专利名称：鱼丝氨酸蛋白酶及其在制药和化妆品上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及疾病的预防与治疗领域和化妆品领域的广泛应用，具体涉及从鱼中获得的丝氨酸蛋白酶在制药和化妆品上的用途。特别是提供了作为活性成分的具有药物活性或者化妆品活性的组合物，其含有从大西洋鳕鱼中分离得到的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶，和与这些酶相关的丝氨酸蛋白酶。
本发明还提供了一种以商品化规模制备鳕鱼胰蛋白酶同功酶纯化制品的方法，此方法包括以下步骤(i)制备鳕鱼内脏的水抽提液；(ii)将此水抽提液进行一步或多步层析，包括使用对氨基苯甲脒亲和配体的亲和层析步骤；和(iii)解吸附并洗脱结合于对氨基苯甲脒亲合配体的胰蛋白酶，获得商品化规模的鳕鱼胰蛋白酶纯化制品。发明详述本发明提供了自鳕鱼提取的胰蛋白酶或者其它相关的胰蛋白酶或丝氨酸蛋白酶，(例如自动物尤其是水栖动物，例如鱼类包括鳕鱼，提取的胰凝乳蛋白酶)，在各种药物和化妆品中的用途。本次所用的术语“酶”如果没有特别说明，指活性酶。“胰蛋白酶或其他相关的肽酶”指胰蛋白酶类型(EC3.4.21.4)的肽酶和所有与大西洋鳕鱼胰蛋白酶有90％或更多序列同源的肽酶(Asgeirsson et al.，Eur.J.Biochem.180.85-94，1989；Gudmundsdottir et al.，Eur.J.Biochem.2171091-1097，1993)。术语“胰凝乳蛋白酶和其他相关的多肽酶”指所有胰凝乳蛋白酶类型(EC3.4.21.1)的肽酶和所有与大西洋鳕鱼胰凝乳蛋白酶A和B有90％或更多序列同源的肽酶(Asgeirsson and Bjarnason，Comp.Biochem.Physiol.99B327-335-94，1991；Gudmundsdottir et al.，Biochim et Biophys.Acta 1219211-214，1994)。
具体说，本发明的酶可用于治疗疼痛、炎症、急性或慢性炎症、关节炎、关节红肿、滑囊炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、纤维肌痛、系统性红斑狼疮、静脉炎、湿疹、皮疹、牛皮癣、痤疮、创伤和念珠菌病。在有用的实施例中，鳕鱼胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶或这些酶的混合物以药物组合物形成局部地应用于受影响部位，此药物组合物含有纯化的肽酶或纯化肽酶与药学上可接受的稀释液或运载体，具体是但不限于水凝胶。另外，所述酶可用于治疗病毒感染，例如疱疹发作，真菌、细菌或寄生虫感染，包括大肠炎、溃疡、痔疮、角膜疤痕、牙齿菌斑和包括自身免疫病的免疫性疾病。
与鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶结构基本相似的酶具有鳕鱼酶相同的用途。
具体说，这些胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶有可用于治疗关节炎、关节红肿、滑囊炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎和静脉炎。在这些治疗中，胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶或这两种酶的混合物以药物组合物形式局部应用在关节炎或发炎部位，此药物组合物含有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶或这两种酶，和药学上可接受的稀释液或运载体，具体是但不限于水凝胶。另外，本发明的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶可用于治疗病毒感染，例如，疱疹发作，真菌、细菌或寄生虫感染，包括大肠炎、溃疡、痔疮、角膜疤痕、牙齿菌斑，痤疮，创伤，念珠菌病和包括自身免疫病的免疫性疾病。
具体说，本发明涉及大西洋鳕鱼或其他动物的胰蛋白酶在医疗、制药和化妆品中的应用。大西洋鳕鱼胰蛋白酶的三种主要同工酶已经纯化和作了特征鉴定。他们称为胰蛋白酶I、II和III(Asgeirsson et al.，Eur.J.Biochem.180.85-94，1989)。鳕鱼胰蛋白酶氨基末端序列为I-V-G-G-Y-Q/E-C-E/T-K/R-H-S-Q-A-H-QV-S-L-N-S，而哺乳动物胰蛋白酶如牛胰蛋白酶氨基末端序列为I-V-G-G-Y-T-C-G-A-N-T-V-P-Y-Q-V-S-L-N-S。鳕鱼胰蛋白酶的三种异构体分子量相似大约为24kDa。
本发明还涉及大西洋鳕鱼提取的胰凝乳蛋白酶在医疗、制药和化妆品中的应用。大西洋鳕鱼胰凝乳蛋白酶的两种主要同功酶已经纯化和作了特征鉴定。它们被命名为胰凝乳蛋白酶A和B(Asgeirsson and Bjarnason，Comp.Biochem.Physiol.99B327-335-94，1991)。鳕鱼胰凝乳蛋白酶具有其活性形式之一的双重氨基末终端序列C-G-R/S-P-A-I-S/Q-P-V/Q-I/V-T-G-Y(A链)和I-V-N-G-E-E-A-V-P-H-S/T-W-S/P/Y-W-Q-V-S-LQ-D/Q(B链)。而哺乳动物胰凝乳蛋白酶如牛胰凝乳蛋白酶A氨基末端序列为C-G-V-P-A-I-Q-P-V-L-S-G-L(A链)和I-V-N-G-E-E-A-V-P-G-S-W-P-W-Q-V-S-L-Q-D(B链)。两种鳕鱼胰凝乳蛋白酶的异构体分子量相似大约为26kDA。
鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶系从鳕鱼内脏(除肝，脾和鱼卵外)中分离和提纯。发明人发现下述方法可用于鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的商品化规模生产。采用水提取法轻轻搅拌从整个或者切碎的内脏中抽提这些酶，内脏与水可以任一比例混合，优选内脏与水的比例(w/w)是1∶1至1∶10。将粗提溶液和残余内脏分离后，提取液通过沉淀或过滤进行澄清。宜通过超滤和/或任选的通过离子交换浓缩该澄清溶液，然后，宜进行微过滤，以得到低生物负荷的纯正溶液，适合于加入到包括几个步骤的柱层析中。随后，胰蛋白酶通过亲和层析，优选通过氨基苯甲脒(amino benzamidine)亲和层析进行纯化，胰凝乳蛋白酶通过疏水反应层析，优选通过苯基琼脂糖层析进行纯化。
如本文所用，商品化规模生产鳕鱼胰蛋白酶指采用可靠和稳定的方法生产，各批产量为1-10克或更多(如10-100克)。
本专利申请中，用所述优选方法来制备的纯化的酶或纯化酶混合物是采用一种水凝胶和水的制剂，其含0-85％(体积比)的多价醇(polyol)如丙三醇甘油。胰蛋白酶活性的适宜浓度是每100毫升最终水凝胶制剂中，对于CBZ-GIy-Pro-Arg-pNA(苄氧羰基-Gly-Pro-Arg-对硝基酰苯胺)活性为0.1-10000个酶单位，胰凝乳蛋白酶活性的适宜浓度是每100毫升最终水凝胶试剂中，对于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA活性为0.1-10000个酶单位。
本发明也提供一种含鳕鱼胰蛋白酶和相关的肽酶，以及药学上可接受的稀释剂或运载体的药物组合物。
本发明还提供(a)涉及用有效剂量的上述纯化酶治疗或预防某些疾病的方法，(b)这些方法所使用的组合物或底物，(c)这些方法所使用的含有有效剂量的酶的药物组合物，以及(d)使用所述酶或酶组合物来制造这些方法所用的药剂。这些方法可用于
治疗或预防下列疾病如疼痛，急性炎症，慢性炎症，关节炎，关节红肿，滑囊炎，骨关节炎，类风湿性关节炎，青少年类风湿性关节炎，脓毒性关节炎，纤维肌痛，系统性红斑狼疮和静脉炎，用量宜为治疗或预防有效量。
治疗或预防皮肤疾病例如皮疹、痤疮、牛皮癣、湿疹、脸部皮脂溢性湿疹、手、脸、头皮或颈部湿疹、痔疮等，给予鳕鱼胰蛋白酶和相关肽酶的量宜为治疗和预防皮肤疾病的有效量。
治疗或预防伤口感染和清创(通过在伤口施加有效剂量的酶来防止微生物感染或通过给予有效量的酶抑制微生物感染而增强伤口的愈合)，处理后，伤口可以基本上没有坏死组织；或从健康皮肤上去除死皮或脱皮，以改善皮肤外观，给予的酶量宜为去除死皮的有效剂量。
治疗或预防囊性纤维变性，癌症，例如通过给予有效量的酶来治疗肿瘤或有效量的酶来防止或抑制肿瘤转移、动脉粥样硬化、哮喘、脓毒性性休克、中毒性休克综合征、组织粘连、如腱鞘、腹部术后或关节粘连、反复灌注损伤、疟疾、免疫性疾病如自身免疫病、细胞调亡、大肠炎和肠炎如局限性回肠炎，鳕鱼胰蛋白酶和相关肽酶的给药量宜为治疗或防治有效量。治疗或预防微生物感染，例如病毒感染(例如单纯疱疹病毒HSV-1，HSV-2，带状疱疹或生殖器疱疹感染)、HIV、肝炎、流感、冠状病毒、巨细胞病毒、鼻病毒、或乳头瘤病毒感染；导致肠胃疾病如溃疡、腹泻的感染；真菌感染如全身性、皮肤、口腔、阴道或食道真菌感染，包括酵母菌感染(包括真菌性指甲感染和念珠菌感染)；眼睛微生物感染，宜用眼部给药治疗；细菌感染，例如葡萄球菌属、链球菌属、克雷伯杆菌属、假单胞菌属，奈瑟淋环菌、嗜血杆菌属、衣原体属、梅毒和大肠杆菌感染和导致软性不疳的细菌感染；免疫缺陷病人的机会性微生物感染，鳕鱼胰蛋白酶的给药量宜为治疗或预防微生物感染的有效剂量，或具有阻止细胞-细胞或细胞-病毒间粘附的抑制活性。去除牙齿的菌斑，酶的给药量宜为去除菌斑的有效剂量；和溶解血凝块，酶的给药量宜为溶解血凝块的有效剂量。
所述方法包括给以一种组合物，其含有上述的鳕鱼胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶，或相关的多肽酶。本发明这种的组合物也可用来去除死细胞的和分散细胞。
本发明提供含有上述纯化的鳕鱼胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、或其他相关的肽酶，以及凝胶、霜或栓剂组分的局部使用的化妆品和药物组合物。
本发明还提供(a)治疗或预防细胞-细胞或细胞-病毒间粘附相关综合征的方法，包括给予有效剂量的的鳕鱼胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶或相关的肽酶对抗粘附，以有效地去除或灭活参与细胞-细胞或细胞-病毒间粘附的细胞或病毒受体，或受体粘附成分；(b)这些方法中所使用的组合物或底物；(c)这些方法中所用的含有有效剂量的的酶的药物组合物；和(d)用所述酶组合物来制造上述方法中所用的药物。通常，所述综合征包括炎症、关节炎、关节红肿、滑囊炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、静脉炎、湿疹、皮疹、牛皮癣、痤疮、创伤、念珠菌病，和免疫性疾病包括自身免疫病、休克、肿瘤转移、移植排斥反应或微生物感染。优选用于治疗或预防，(a)所述综合病征有微生物感染、免疫性疾病、囊性纤维变性、动脉粥样硬化、癌症、哮喘、脓毒性性休克、中毒性休克综合征、结膜炎、反复灌注损伤和疼痛，和(b)参与细胞-细胞或细胞-病毒间的粘附的细胞表面受体，选自鳕胰蛋白酶能剪切的受体，包括CD4、CD8、CD54、(ICAM-1)、CD31、CD62L、CD102(ICAM-2)、CD11a/CD18，通过使用此酶而去除或灭治。优选用于治疗或预防微生物感染，微生物感染是指疱疹、HIV、肝炎，或乳突淋瘤感染；导致大肠炎和腹泻的感染；念珠菌感染如口腔、阴道、食道念珠菌感染；伤风或流感感染；葡萄球菌属、链球菌属、克雷伯杆菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属或大肠杆菌属感染；原发性或继发性麻风感染；导致结膜炎和结核病的感染。
在一个实施例中，本发明提供了一种通过给予鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶来预防或抑制病原微生物传播的方法。宜将鳕鱼胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶应用于在身体的局部，该局部包括引起疾病的微生物的最初传染进入口。在一个优选实施例中，例如对与性交活动有关的身体孔道采用喷雾，涂油膏，或冲洗方法给药，以阻止HIV和肝炎的传播。在另一优选实施例中，将鳕鱼胰蛋白酶和相关的肽酶应用在上气道中，例如通过气雾剂，来抑制或预防普通感冒病毒(例如鼻病毒或冠状病毒)的传染。
一方面，对组织、体液或细胞成分进行身体外(extra-corporeally)治疗以去除细胞粘附成分的方法，能减少自一个体移植到另一个体的组织、体液或细胞组分的免疫排斥。另一方面，这些治疗可去除或灭活参与微生物感染的受治疗的组织、体液或细胞组分中的细胞粘附成分。
给予鳕鱼胰蛋白酶和相关的多肽酶可治疗和预防脓毒性休克或中毒性休克综合征，合适的给药途径包括全身给药。治疗伴有休克的阴道感染，可用阴道冲洗，乳膏，凝胶，或栓剂作为给药方。
给予鳕鱼胰蛋白酶和相关的肽酶可治疗或预防疼痛，炎症、急性炎症、慢性炎症、关节炎、关节红肿、滑囊炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、纤维肌痛、系统性红斑狼疮、静脉炎，合适的给药方法包括但不限于乳膏，凝胶和栓剂，特别是但不限于含丙三醇和其他多羟基化合物(polyols)的水凝胶。
给予鳕鱼胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和相关的多肽酶可治疗或预防皮疹、牛皮癣、痤疮、湿疹、包括面部皮脂溢特湿疹，手部、脸部、头皮或颈部湿疹、包皮感染、脚癣，瘘管感染、感染性局部溃疡，新生儿肚脐感染、皱纹，疤痕、疤痕疙瘩，疖，疣、过敏性骚痒、痔疮等等；创伤、伤口感染、烧伤，除去健康皮肤的死皮或脱皮以改善皮肤外观；真菌感染例如全身、皮肤、口腔、阴道、或食道真菌感染包括酵母菌感染、指甲真菌感染、念珠菌感染、免疫性疾病，包括自身免疫病，合适的给药方式可以使用乳膏，凝胶，栓剂，特别包括但不限于含丙三醇或其他多羟基化合物(polyols)的水凝胶。
相应地，本发明的一个目的是提供一种组合物，来治疗疼痛、炎症、急性炎症、慢性炎症、关节炎、关节红肿、滑囊炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、纤维肌痛，系统性红斑狼疮、静脉炎、皮疹、牛皮癣、痤疮、湿疹、包括面部皮脂溢性湿疹，手部、脸部、头皮或颈部湿疹、包皮感染，脚癣，瘘管感染、感染性局部溃疡，新生儿肚脐感染、皱纹，疤痕、疤痕疙瘩，疖，疣、过敏性骚痒、痔疮等、创伤、伤口感染、烧伤，除去健康皮肤死皮或脱皮以改善皮肤外观，真菌感染如全身、皮肤、口腔、阴道或食道真菌感染、包括酵母菌感染、指甲真菌感染、念珠菌感染，免疫性疾病，包括自身免疫病等疾病。本发明的另一个目的是提供一种用来制造治疗上述疾病的的组合物的方法。第三个目的是提供一种应用所述组合物治疗上述疾病的方法，包括体外和局部用药的剂量。因此本发明的基础是含有这些酶的组合物，而以前没用过这些酶或没有较好的酶。
通过使用含有能解消除疼痛，炎症，关节炎，肿胀，水肿，牛皮癣，湿疹，皮炎，皮疹和/或以上引言部分提到的其他疾病的有效剂量的鳕鱼胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的组合物，可以达到上述本目的。鳕鱼酶可从鳕鱼内脏以较简单的方法获得高产量。已发现，鳕鱼酶可以用较直接的方法大规模地纯化并得到合理的产量。纯化的鳕鱼胰蛋白酶包含此酶的三种主要同功酶，而鳕鱼胰凝乳蛋白酶包含两种主要同功酶。一种或所有的同功酶都可用于本发明的目的。
现在可以确认，本发明的鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶能有效地去除或灭活某些细胞表面粘附分子、细菌肠毒素、细胞因子、炎症介质和基质金属蛋白酶(MMPs)如CD4、CD8、CD54(ICAM-1)、CD31、CD62L、CD102(ICAM-2)、CD11a/CD18、TNF-alfa、IL-1和MMP-9，而不影响细胞的活力。认为这些粘附位点的切断或细胞因子的失活现象、炎症介质和基质金属蛋白酶的灭活，至少为鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对许多物质的有效性提供了部分解释，虽然鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶不可能对所有物质都有效。如TNF-α在关节炎、牛皮癣、肿瘤和炎症中所提示的那样(见Cytokines，.Mire-Slui和Thrope编，Acedemic press，1998，第350页)。
在很多方面，鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶看来比其他常规蛋白酶更为有效。在这一方面，比较了一组13种最有活性的蛋白酶对以上提到的16种细胞表面粘附分子、细菌肠毒素、细胞因子、炎症介质和MMPs的活性，以及他们对血清抑制的敏感性，发现大西洋鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶是活性最强的。蛋白酶从高活性到很高活性记为2分，从低活性到中度活性记为1分，从很低活性到无活性记为0分(蛋白酶的血清抑制活性相反记分)。根据此记分表，大西洋鳕鱼胰蛋白酶记为30分和大西洋胰凝乳蛋白酶记为29分，而已知的磷虾多功能蛋白酶记为16分。在这一方面，发现牛胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶缺乏活性。进一步，当用常规的小生色底物用来比较它们的活性时，鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性比牛的相应酶活性高2-20倍(Asgeirsson等，欧洲生化杂志Eur.J.Biochem.18085-94，1989；Asgeirsson和Bjarnason.，Comp.Biochem.Physiol.99B327-335-94，1991)。
鳕鱼内脏是提取本发明鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的有用资源。举例说，可以从上述冷冻鳕内脏以商品化规模提取得到这些酶。将澄清和浓缩的提取液可任选地通过大规模离子交换层析进行分级分离，优选先进行阳离子交换色谱层析，再进行阴离子交换层析步骤，来结合和去除相关的丝氨酸蛋白酶，如弹性蛋白酶和丝氨酸胶原酶。在随后和最后步骤中。通过大规模亲和层析纯化得到鳕鱼胰蛋白酶，优选采用对氨基苯甲脒亲和柱层析；而胰凝乳蛋白酶采用疏水性相互作用柱层析优选采用苯基琼脂糖凝胶柱层析获得。
将本发明所用的鳕鱼胰蛋白酶从亲和性基质上解吸附下来可采用使酶与亲和配体之间的相互作用不稳定的条件。这种条件包括高盐，然后低pH，优选用30％或更高的甘油。酸洗脱步骤后，让柱洗脱剂流入中和缓冲液中以稳定鳕鱼胰蛋白酶(Asgeirsson etal.，Eur.J.Biochem.18085-94，1989)。本发明所用的鳕鱼胰凝乳蛋白酶可采用使酶与疏水性配体之间的相互作用不稳定的条件，从苯基琼脂糖柱上释放出来。这种条件包括水或缓冲液中的高浓度甘油，优选水或缓冲液中的甘油浓度为50％或更高(Asgeirsson和Bjarnason，Comp.Biochem.Physiol.99B327-335-94，1991)。用这些方法，分离得到的鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的纯度可超过90％。这样得到的鳕鱼胰蛋白酶组分含有三个主要形式的同功能，如SDS电泳得到一条条带所证明的那样，而等电聚焦显示三个条带，层析聚焦色谱产生三个与胰蛋白酶三种同功形相关的山峰(
图1)，如不采用阴离子交换层折胰蛋白酶组分中还含有胰蛋白酶IV的至少四种同功酶。进行Q(mono-Q)或DEAE阴离子交换层析，可将这些同功能分为更小的组分。
可将其他来源(非大西洋鳕鱼)的丝氨酸蛋白酶与分离的大西洋鳕鱼胰蛋白酶进行比较，比较分子量、等电点、氨基酸序列、温度或pH稳定性、温度或pH最大值、蛋白水解的特异性和动力学参数，或如实施例中所示的大西洋鳕鱼胰蛋白酶的其他特性(Asgeirsson等，Eur.J.Biochem.18085-94，1989)。可用酪氨酸精氨酸甲基酯作为底物测定鳕鱼胰蛋白酶的活性。在25℃，pH8.1时，亲和柱纯化(90-100％纯度)得到的分离的鳕鱼胰蛋白酶具有的比活度性宜至少为140U/mg，与之相比，磷虾多功能水解酶为60U/mg。另外，可以Cbz-Gly-Pro-Arg-对硝基酰苯胺(Cbz-GPR-pNA)为底物测定得胰蛋白酶活性，其比活性宜至少为100U/mg。当B2-Arg-pNA作为底物时，获得鳕鱼胰蛋白酶I，II，III的催化效率常数(Kcat/Km)分别为52，20和7s-1mM-1，与之相比，牛胰蛋白酶为3s-1mM-1(Asgeirsson等，Eur.J.Biochem.18085-94，1989)。鳕鱼胰凝乳蛋白酶和牛胰凝乳蛋白酶也发现有类似的差异(Asgeirsson和Bjarnason，Comp.Biochem.Physiol.99B327-335，1991)。
鳕鱼胰蛋白酶的分子量大约24kDa，胰蛋白酶I，II，III的等电点分别为6.6，6.2和5.5，胰蛋白酶IV同功能的等电点更低。鳕鱼胰蛋白酶同功酶的氨基酸序列以下述序列表达，对于多种同工酶含有位点的变异。I-V-G-G-Y-E-C-K/R-H-S-Q-A-H-Q-V-S-L-N-S-G-Y-H-Y/F-C-G-G-S-L-I-N-K/E-D-Q-W-V-V-S-A-A-H-C-Y-K-S-V-L-R-V-R-L-G-E-H-H-I-R-V-N-E-G-T-E-Q-Y/F-I-S-S-S-SV-I/X-R-H-P-N-Y-S-S-Y-N-I-N/D-N-D-I-M-L-I-K-L-T-K/E-P-A-T-L-N-Q-Y-V-H-A-V-A-L-P-T-E-C-A-A-D-A-T-M-C-T-V-S-G-W-G-N-T-M-S-S-V-A/D-D-G-D-K-L-Q-V/C-L-N/S-L-P-I-L-S-H-A-D-C-A-N-S-Y-G-P-G-M-I-T-Q-S-M-F-C-A-G-Y-L-E-G-G-K-D-S-C-Q-G-D-S-G-G-P-V-V-C-N-G-V-L-Q-G-V-G-V-V-S-W-G-Y-G-C-A-E-R-D-H/N-P-G-V-Y-A-K-V-M/V/C-V-L-S-G-W-V-R-D-T-M-A-N/S-Y其中X可以是任何氨基酸或者不是氨基酸，鳕鱼胰蛋白酶I在位置9上为氨基酸残基K，而鳕鱼胰蛋白酶II，III这个位置上是氨基酸残基R(Gudmundsdottir等，1993，以及未发表的数据)。
通常，鳕鱼胰蛋白酶同功酶是足够稳定的，5℃，在pH7.0含有10mM的氯化钙的缓冲溶液中孵育18小时后，至少可以保留约50％的TAME活性。然而，在5℃，pH2.0，孵育18小时后，只保留约10％的TAME活性(图2)。
鳕鱼胰蛋白酶以TAME作为底物时的最适pH值约为7.0到8.7之间，更佳的是约8.0(图3)。用TAME作为底物，在25℃，pH8.1的10mM氯化钙中，鳕鱼胰蛋白酶I，II，III的Km分别大约是0.029mM，0.021mM，0.049mM。鳕鱼胰蛋白酶在用TAME作底物是活性最大的温度宜为50℃至60℃(图4)。
本发明的鳕鱼胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶经局部，口腔，直肠，阴道给药是通过灌注(比如进入尿道或者瘘管)，通过肺部途径，如采用气溶胶(aerosol)，通过滴入眼睛的方法，或全身，比如甲肠外途径，例如肌肉、皮下、腹膜内、动脉内或静脉内注射。鳕鱼酶应按照标准制药实践，以溶液形式，或结合药学上可接受的载体或赋剂的形式给药。对于口服给药，鳕鱼酶可采用药片、胶囊、糖锭、咀嚼片、锭剂、粉剂、糖浆、酏剂、水溶液和悬浮液等形式。用于胃肠外途径给存，通常制备鳕鱼酶的无菌溶液，溶液的pH值应适当调整和缓冲。对于静脉使用，应控制溶质总浓度使制备物等渗。用于眼睛，药膏或滴眼溶液可用本领域已知的眼科药物输送系统诸如涂药器或者滴眼器来给药。用于肺部，应选择适合形成气溶胶的稀释液和/或运载体。用于体表，鳕鱼胰蛋白酶通常以含有0-85％甘油的水凝胶，如约20％-30％，可能高达85％甘油的水凝胶给药。
对于体表治疗，鳕鱼胰蛋白酶的合适剂量为每次治疗大约每平方厘米0.01微克到每平方厘米1毫克，宜用大约每平方厘米0.1微克到每平方厘米0.01毫克(使用大约每毫升凝胶0.01毫克酶)。对于全身治疗，通常选用能维持鳕鱼胰蛋白酶血清水平的剂量，为大约每100毫升0.1毫克到每100毫升100毫克，优选大约每100毫升0.5毫克到每100毫升2毫克。另一种全身给药的较佳剂量宜为大约每千克(体重)0.1毫克到10毫克，更优选大约每千克(体重)1毫克。对于阴道和尿道治疗，鳕鱼胰蛋白酶输注/滴注溶液通常所用浓度为大约每毫升1微克到每毫升15毫克，优选大约每毫升100微克到每毫升3毫克。对于所有的治疗，此酶组合物通常每天应用1到10次，优选每天2到5次。当然这些剂量将根据疾病的类型和严重程度、患者的年龄、体重和医疗状况等因素而不同，医学领域普通技术人员懂得这些相信可使用较高剂量而不会产生副作用。
对于创伤愈合，鳕鱼胰蛋白酶宜在伤口第一次敷裹后使用多次。鳕鱼胰蛋白酶至少宜在伤口每次敷裹时换药。鳕鱼胰蛋白酶至少应每隔一天，更佳的是每天或者每天数次敷。对于诸如湿疹、牛皮癣等皮肤病，鳕鱼胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶水溶胶宜每天，更好是每天两次使用。对于急性或慢性炎症、关节炎、关节红肿、滑囊炎、骨关节炎等，鳕鱼胰蛋白酶宜每天使用一次，更好是每天两次。
如下述许多临床实施例所阐明的那样，本发明的鳕鱼酶水溶胶对于治疗或者预防炎症是有效的。典型的是，在治疗开始后两或三天内，炎症就减轻到可接受的水平。实施例还说明此酶对于减轻疼痛也有效。常在治疗开始20分钟到2小时，病人报告疼痛减轻。疼痛的减轻并不伴有患处感觉丧失。在治疗开始1天内，有更完全的疼痛减轻，患者仅有轻微的疼痛或触痛感觉。
通常，此有效剂量的给予本发明的鳕鱼酶。有效剂量指能有效地(1)减轻待治疗疾病的症状，(2)引起待治疗疾病与治疗有关的药理变化，(3)抑制或者预防传染因子引起的感染或再感染，或(4)预防非传染性疾病的发生(如可通过阻断细胞粘附现象来治疗的疾病)的剂量。对于伤口治疗，一方面，有效剂量包括如果有规律地使用能有效防止感染发生的剂量。另一方面，对于伤口愈合，有效剂量包括能有效地减少伤口愈合所需平均时间的量。
测定蛋白质的同源百分比的许多方法为本领域技术人员所公知。一种适宜的方法是运用GAP电脑程序6.0版来进行序列比较。这个程序可从威斯康星大学遗传学计算机集团(University of Wisconsin Genetics Computer Group)得到，其采用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48，443(1970))建立的，并由史密斯和华特曼(Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981))修订的排列对比方法。另一个方法是运用FASTA计算机程序。
本发明现在将通过以下非限制性实施例和附图作进一步说明。
图1显示大西洋鳕鱼胰蛋白酶组分在氨基苯甲脒亲和柱纯化过程中的层析聚焦色谱分析。将对氨基苯甲脒柱洗脱组分在SephadexG-25柱上进行凝胶过滤，该G-25柱用PH9.4含10mM氯化钙的25mM单乙醇胺/乙酸液平衡，继而再加入到以相同缓冲液平衡的PBE-94离子交换柱(Pharmacia)上。然后用含10mM氯化钙的聚缓冲液94(Polybuffer 94，用乙酸调PH值为5.5)洗脱该柱。并监测280nm光值(空心圆)，PH值(空心菱形)和对底物TAME(实心圆圈)的活性。洗脱的第一组分被命名为胰蛋白酶I，第二组分为胰蛋白酶II，第三组分为胰蛋白酶III。
图2在不同PH值经两种不同时间培育后，通过剩余TAME活性的测定，显示PH值对氨基苯甲脒纯化的大西洋鳕鱼胰蛋白酶的稳定性的影响。在不同PH值下，5℃培育大西洋鳕鱼胰蛋白酶样品30分钟(空心圆环)，和18小时(实心方块)。之后，在PH8.1和25℃，测定对TAME底物的剩余活性。
图3显示用TAME底物所测定的对氨基苯甲脒纯化的大西洋鳕鱼胰蛋白酶的活性对PH值的依赖性。最终浓度时使用的缓冲液为0.1的醋酸盐(PH3.0-5.9)，hepes/HCI(PH值6.0-8.0)，以及甘氨酸盐(PH值8.3-9.0)，均含10mM氯化钙。
图4显示用TAME底物测得的大西洋鳕鱼胰蛋白酶I活性对温度的依赖性与牛胰蛋白酶活性相比较。将两种酶放入一个预先加热的恒温比色杯中，经过约3分钟的短暂平衡期后，测定平均水解速率。
洗涤结束后，将对氨基苯甲脒亲和柱与其他柱断开连接，用5倍柱体积的高盐溶液-25mMTris缓冲液(PH7.5含0.5M氯化钠和2.5mM的氯化钙)进行洗涤。然后用酸性溶液，即25mM乙酸PH3.2含10mM氯化钙和30％甘油)使鳕鱼胰蛋白酶从亲和配体上解吸附并从柱上洗脱下来。将鳕鱼胰蛋白酶组分收集到中和缓冲液一含30％甘油的200mM Tris缓冲液中。
SDS PAGE电泳和FPLC Mono Q层析显示，纯化后的鳕鱼胰蛋白酶制品是均质的，等电聚焦，显示有三条胰蛋白酶同功酶条。使用上述Cbz-GPR-pNA作为底物，该酶制品的比活性为100U/mg。用0.22微米滤器对已纯化的制品进行除菌过滤，冻存于零下20℃。
然后用5倍柱体积的高盐溶液-25Mm Tris缓冲液(PH7.5，含0.5M氯化钠和2.5mM的氯化钙)洗涤该亲和柱。用酸性溶液即2.5mM醋酸液(PH3.2含10mM氯化钙和30％甘油)使鳕鱼胰蛋白酶从亲和配体上解吸附并从柱上洗脱下来。将鳕鱼胰蛋白酶组分收集到中和溶液-PH8.5含30％甘油的200mM Tris缓冲液中，该鳕鱼胰蛋白酶组分含有约5-6克的胰蛋白酶。
SDS PAGE电泳显示，纯化后的鳕鱼胰蛋白酶制品是均质的，等电聚焦显示有三条胰蛋白酶同功酶条带。较小组分(＜5％)可以用FPLC Mono Q层析法再进行分离，并鉴定出至少有四种其他同工酶胰蛋白酶IVa，IVb，IVc，和Ivd。使用上述的Cbz-GPR-pNA作为底物，该酶制品的比活性为100U/mg。用0.22微米滤器对已纯化的制品进行除菌过滤，冻存于零下20℃。
一些患者(40，41，48，66，50，20，46，87，97，100号)能够不继续治疗并且看来疾病已永久或长期缓解，而其他患者长期或间断地使用Penzyme 100控制了症状。
权利要求
1.一类鱼丝氨酸蛋白酶，其特征在于，此类酶可用作药物。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶，其选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和它们的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白酶，其特征在于，此类酶不是多功能性酶。
4.根据权利要求1-3任一项所述的蛋白酶，其特征在于，此类酶衍生自大西洋鳕鱼。
5.根据权利要求1所述的蛋白酶，该蛋白酶是大西洋鳕鱼的胰蛋白酶。
6.根据权利要求5所述的蛋白酶，其选自胰蛋白酶I、胰蛋白酶II、胰蛋白酶III、胰蛋白酶IVa、胰蛋白酶IVb、胰蛋白酶IVc、胰蛋白酶IVd。
7.根据权利要求4所述的蛋白酶，其选自胰凝乳蛋白酶A和胰乳蛋白酶B。
8.根据权利要求1所述的蛋白酶，其是一种与大西洋鳕鱼胰蛋白酶I、、胰蛋白酶II、胰蛋白酶III和胰蛋白酶IV任一种的氨基酸序列同源性至少90％的胰蛋白酶。
9.根据权利要求1所述的蛋白酶，其是一种与大西洋鳕鱼分离得到的胰乳蛋白酶A和胰凝乳蛋白酶B之一的氨基酸序列同源性至少90％的胰凝乳蛋白酶。
10.根据权利要求1所述的蛋白酶作为治疗和/或预防人或动物疾病药物中的用途，所述疾病包括疼痛、急性炎症、慢性炎症、关节炎、关节红肿、滑囊炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、纤维肌痛、系统性红斑狼疮、、静脉炎、肌腱类、皮疹、牛皮癣、痤疮、湿疹、面部皮脂溢性湿疹、手脸或颈部湿疹、毛皮感染、脚癣、瘘管感染、感染性局部溃疡、新生儿肚脐感染、皱纹、疤痕疤痕疙瘩、疖、疣和过敏性骚痒、痔疮、创伤、伤口感染、烧伤、真菌感染和免疫性疾病包括自身免疫病。
11.根据权利要求1所述的蛋白酶作为去除健康皮肤上死皮或脱皮的药物的用途。
12.鱼丝氨酸蛋白酶在制造用于治疗和/或预防人或动物疾病药物中的用途，所述疾病包括疼痛、急性炎症、慢性炎症、关节炎、关节红肿、滑囊炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、纤维肌痛、系统性红斑狼疮、静脉炎、肌腱炎、皮疹、牛皮癣、痤疮、湿疹、面部皮脂溢性湿疹、手脸或颈部湿疹、毛皮感染、脚癣、瘘管感染、感染性局部溃疡、新生儿肚脐感染、皱纹、疤痕疤痕疙瘩、疖、疣和过敏性骚痒、痔疮、创伤、伤口感染、烧伤、真菌感染和免疫性疾病包括自身免疫病。
13.鱼丝氨酸蛋白酶在制造用于去除健康皮肤上死皮或脱皮药物中的用途。
14.鱼丝氨酸蛋白酶在制造用于治疗或预防其发病机制涉及受体介导结合的疾病的药物的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所治疗或预防的疾病由病毒、细菌、真菌、寄生虫和原虫等病原生物所引起。
16.根据权利要求12-14任一项所述的用途，其中鱼丝氨酸蛋白酶是权利要求2-9任一项所述的蛋白酶。
17.一种药物组合物，其特征在于，该组合物含有鱼丝氨酸蛋白酶。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中鱼丝氨酸蛋白酶是权利要求2-11任一项所述的蛋白酶。
19.根据权利要求17或18所述的组合物，其特征在于，该组合物是局部使用的。
20.根据权利要求19所述的组合物，该组合物是一种水凝胶。
21.根据权利要求20所述的组合物，该组合物还含有多价醇包括丙三醇(甘油)。
22.根据权利要求17所述的组合物该组合物还含有药物活性化合物。
23.一种化妆品组合物，其特征在于，该组合物含有鱼丝氨酸蛋白酶。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中鱼丝氨酸蛋白酶是权利要求2-11任一项所述的蛋白酶。
25.根据权利要求23所述的组合物，该组合物是一种水凝胶。
26.根据权利要求23所述的组合物，该组合物还含有多价醇包括丙三醇(甘油)。
27.根据权利要求23所述的组合物，该组合物还含有具有美容活性的化合物。
28.一种治疗和/或预防人或动物疾病的方法，其特征在于，该方法包括给予所述人或动物药学上有效剂量的鱼丝氨酸蛋白酶。
29.根据权利要求28所述的方法，其中蛋白酶是权利要求2-11任一项所述的蛋白酶。
30.根据权利要求28所述的方法，其中蛋白酶是局部给药。
31.根据权利要求30所述的方法，其中蛋白酶通过胃肠道给药。
32.一种以商品化规模制备含有胰蛋白酶I、II、III和IV种同功酶的纯化的鳕鱼胰蛋白酶同功酶制品的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)制备鳕鱼内脏的水性提取物；(2)将该水性提取物进行一步或多步层析，包括采用对氨基苯甲脒亲和配体的亲和层析，和；(3)解吸附和洗脱结合于对氨基苯甲脒亲和的胰蛋白酶。
33.根据权利要求32所述的制备纯化的鳕鱼胰蛋白酶同功酶制品的方法，其中该方法还包括采用一步或多步阳离子交换树脂，或采用一步或多步阴离子交换树脂，然后进行亲和层析的步骤。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中纯化步骤持续进行，直到制品所含的比活性用Cbz-GPR-pNA作底物测定至少为每毫克蛋白质50U为止。
35.根据权利要求34所述的方法，其中制品的比活性为100U/mg或更高。
36.根据权利要求32所述的方法，该方法还包括用0.22um滤器除菌过滤纯化的制品步骤。
37.一种商品化规模的鳕鱼胰蛋白酶纯化制品。
38.根据权利要求37所述的纯化的鳕鱼胰蛋酶制品，当该制品经SDS-PAGE电泳和FPLC MonoQ层析后，只有胰蛋白酶同功酶的3-7条蛋白条带。
39.根据权利要求37或38所述的制品，该制品用Cbz-GPR-pNA作底物溶液的比活性至少为每毫史蛋白质50U。
40.根据权利要求38所述的制品，其中该制品比活性为100U/mg或更高。
全文摘要
本发明公开了用从鱼提取的丝氨酸蛋白酶包括从鳕鱼(如大西洋鳕鱼)中提取的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,治疗各种疾病和紊乱,如炎性疾病,由病毒、细菌和真菌引起的传染性疾病,以及在发病中涉及受体结合机制的疾病等。本发明还公开了含有这些蛋白酶的药物组合物和化妆品组成物。
文档编号C12N9/64GK1356907SQ00809111
公开日2002年7月3日 申请日期2000年6月15日 优先权日1999年6月18日
发明者布亚纳森·乔·布拉吉 申请人:布亚纳森·乔·布拉吉