专利名称：新型脱敏型天冬氨酸激酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于棒状细菌的新型天冬氨酸激酶、编码该酶的DNA、含有所述DNA的重组DNA、具有所述重组DNA的棒状细菌或在染色体上具有所述DNA的棒状细菌，以及其特征为培养上述微生物的生产L-赖氨酸的方法。
(1)就使用生产L-赖氨酸的突变株的方法而言，已知例如S-(2-氨乙基)-半胱氨酸(以下简称AEC)抗性突变株(氨基酸发酵，1986年，第273页，学会出版中心)、L-高丝氨酸缺陷型突变株(氨基酸发酵，1986年，第273页，学会出版中心)、呼吸系统抑制剂抗性突变株(特公平5-55114)、嘧啶类似物抗性突变株(特开昭59-88094)、嘌呤类似物抗性突变株(特公昭63-062199)等。
(2)就通过使用基因重组技术的重组菌的方法而言，已经公开了在棒杆菌属微生物中自主复制的、带有赋予可选择表型的标记基因的载体质粒，以及将所述载体质粒高效率地导入该细菌中的方法，公开了藉此通过增加参与含L-赖氨酸的各种L-氨基酸合成的基因在细胞中的拷贝数而高效率地生产该氨基酸的方法(特公平5-11959、特公平7-55155)。
关于L-赖氨酸生物合成的控制，了解得最为清楚的是L-赖氨酸和L-苏氨酸对催化从L-天冬氨酸生物合成天冬氨酰磷酸的天冬氨酸激酶(以及简称AK)的协同反馈抑制作用。已知在带有解除了这种反馈抑制的突变型AK(以下简称脱敏型AK)的编码基因(以下简称脱敏型AK基因)的棒杆菌属微生物中，L-赖氨酸被分泌到菌体外(氨基酸发酵，1986年，第273页，学会出版中心)。如果有突变的碱基序列信息，则可以将在体外使碱基序列变为所需序列的技术(例如使用ストラタジ-ン社的QuickChang定点诱变试剂盒的方法)与所述信息组合，能够将野生型基因改变为突变型基因。最近，报道了上述脱敏型AK基因的碱基序列水平的分析[Joumal of Bacteriology，175，4096(1993)；Molecular Microbiology 5，1197(1991)；特开平6-62866]。
本发明人就用棒状细菌有效生产L-赖氨酸的方法进行了专心研究，结果发现具有解除了L-赖氨酸和L-苏氨酸协同反馈抑制的性质而且也解除了单独的L-赖氨酸的反馈抑制的脱敏型AK的菌株具有出色的L-赖氨酸生产能力，因而完成了本发明。
也就是说，本发明涉及以下(1)-(12)。
(1)来源于棒状细菌的编码天冬氨酸激酶的DNA，所述天冬氨酸激酶具有在序列鉴定号18所述的氨基酸序列中第311位氨基酸残基被Thr以外的氨基酸置换的氨基酸序列，而且解除了L-赖氨酸和L-苏氨酸引起的协同反馈抑制。
(2)上述(1)的DNA，其中所述DNA是具有序列鉴定号17所述碱基序列的DNA。
(3)上述(1)的DNA，其中所述棒状细菌是属于选自棒杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)的一个属的棒状细菌。
(4)通过将上述(1)-(3)中的任一种DNA插入载体中而得到的、可在棒状细菌中复制的重组DNA。
(5)在染色体上带有上述(1)-(3)中的任一种DNA的棒状细菌。
(6)具有上述(4)的重组DNA、属于棒状细菌的转化体。
(7)上述(6)的转化体，其中所述转化体是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)Tf-5(FERM BP-6689)。
(8)L-赖氨酸的生产方法，其特征为在培养基中培养选自上述(5)的棒状细菌、上述(6)以及(7)的转化体的微生物或转化体，在培养物中产生积累L-赖氨酸，然后从该培养物中收集L-赖氨酸。
(9)由上述(1)-(3)中的任一种DNA编码的天冬氨酸激酶。
(10)来源于棒状细菌的编码天冬氨酸激酶的DNA，所述DNA具有在序列鉴定号18所述氨基酸序列中的第311位氨基酸残基是Thr的碱基序列。
(11)上述(10)的DNA，其中所述DNA具有序列鉴定号17所述的第932位碱基被胞嘧啶置换的碱基序列。
利用该DNA，可以构建编码上述(1)的天冬氨酸激酶的DNA。
(12)由上述(10)或者(11)的DNA编码的天冬氨酸激酶。
以下详细说明本发明。
作为含有编码AK的基因(以下简称AK基因)的DNA的供体菌，只要是属于棒状细菌、有AK活性的微生物，则无论何种微生物都可以应用。
在本发明中，关于棒状细菌，可以列举属于Agrococcus、壤霉菌属(Agromyces)、节杆菌属(Arthrobacter)、金杆菌属(Aureobacterium)、短杆菌属、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、棍状杆菌属(Clavibacter)、棒杆菌属、微杆菌属(Microbacterium)、拉氏杆菌属(Rathayibacter)、地杆菌属(Terrabacter)、苏黎士菌属(Turicella)的细菌。最好是属于棒杆菌属、短杆菌属的细菌。作为具体实例，例如可以使用下述的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC13870、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)ATCC15991、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806。
由野生型菌株可以提供存在L-赖氨酸或者L-赖氨酸和L-苏氨酸引起的反馈抑制的野生型AK基因。关于由所述野生型AK基因获得解除了反馈抑制的脱敏型AK基因的方法，例如可以列举由野生型菌株开始进行突变操作[例如N-甲基N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)的方法；微生物实验指南，1986年，第131页，讲谈社サィエンティフィック社]后，选择AEC抗性作为指标，从具有L-赖氨酸生产能力的突变体中获得脱敏型AK基因的方法。关于优选的突变株，可以列举通过诱变处理从谷氨酸棒杆菌野生型菌株ATCC13032诱导的L-赖氨酸生产菌，或者在获得野生型AK基因后，通过上述的NTG法或者体外诱变法[例如使用羟胺的方法；Molecular and General Genetics，145，101(1978)]对该基因进行诱变而获得的、以AEC抗性以及L-赖氨酸生产率作为指标含有脱敏的脱敏型AK基因的菌株。
通过例如斋藤等人的方法[Biochimica et Biophysica Acra，72，619(1963)]，对含AK基因的菌株进行分离，可以获得AK基因。亦即，制备染色体DNA，用适当的限制性酶将其酶切。酶切后，将所得的酶切片段连接到能够在微生物中自主复制的载体(例如质粒)中，将其导入缺乏AK活性的宿主微生物中。从所述微生物中分离表现出AK活性的转化体，从所述转化体中分离出所述基因，可以获得AK基因。
作为宿主微生物，只要是棒状细菌的AK基因在其中能够表达的微生物，则都可以使用。优选AK缺陷型大肠杆菌菌株。
作为自主复制型载体，只要是能够在导入了该载体的微生物中进行自主复制的载体，则任何载体都可以使用。例如，可以列举pUC18(宝酒造社生产)、pBluescriptSK(-)(东洋纺社生产)等在大肠菌中可自主复制的载体、pCE54(特开昭58-105999)等在大肠菌和棒状细菌两者中均可自主复制的穿梭载体等。
可以通过用T4 DNA连接酶的常规方法，将载体与含AK基因的DNA片段连接。
例如在大肠菌的情况下，可以通过Hanahan等人的方法[Journal ofMolecular Biology，166，557(1983)]等来进行向宿主的导入。
而且，通过以下方法可以分离出AK基因。
根据众所周知的来源于谷氨酸棒杆菌的AK基因的碱基序列信息[例如GenBank登录号E06825]合成寡聚DNA，用该DNA作为引物，通过PCR法扩增分离出含该基因的DNA片段。将该DNA片段连接到含有选择标记基因的载体中，将其导入大肠菌、棒状细菌等合适宿主微生物中。从所述微生物中分离所导入的载体，可以获得AK基因。在宿主微生物中不必使用AK缺陷型菌株。
作为用以构建本发明所称的“在棒状细菌中可以复制的重组DNA”的载体，只要是在棒状细菌中能自主复制的载体，则任何载体都可以使用。具体地说，可以列举pCG1(特开昭57-134500)、pCG2(特开昭58-35197)、pCG4(特开昭57-183799)、pCG11(特开昭57-134500)、pCG116、pCE54、pCB101(均在特开昭58-105999中)、pCE5 1、pCE52、pCE53[Molecular and General Genetics，196，175(1984)]、以及在本发明中表明了构建过程的pCS299P等。最好使用pCG116、pCS299P等之类的尺寸比较小的、有多个克隆位点、带有抗药性基因等能选择的标记基因的载体。
关于将上述重组DNA导入棒状细菌的方法，可以列举原生质体法(例如特开昭57-186492和特开昭57-18649)、电穿孔法[例如Journalof Bacteriology，175，4096(1993)]等。
所谓在染色体上具有编码本发明的新型AK的DNA的棒状细菌，只要是在染色体上含有该AK基因的棒状细菌，则任何棒状细菌都是合适的。例如，可以列举通过突变操作获得的菌株、通过同源重组法[Bio/Technology，9，84(1991)]、使用噬菌体、转座子的方法[Escherichia coli and Salmonella typhimurium，1996年，第2325页，第2339页，American Society for Microbiology]等在染色体中人工插入该DNA片段的微生物。
通过培养如上所述获得的、属于具有含新型AK基因的DNA的棒状细菌的转化体，可以在培养液中生成积累L-赖氨酸。
可以使用含有碳源、氮源、无机盐类等的常用营养培养基作为培养基。
作为碳源，例如可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉水解物等糖类；乙醇等醇类；乙酸、乳酸、琥珀酸等有机酸类。
作为氮源，可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、乙酸铵等各种无机和有机铵盐类；尿素、其它含氮化合物；以及肉膏、酵母膏、玉米浆、大豆水解物等含氮有机物。
作为无机盐，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、氯化钠、硫酸镁、碳酸钙等。
此外，可以根据需要加入生物素、硫胺素等微量营养源。这些微量营养源也可以用肉膏、酵母膏、玉米浆、酪蛋白氨基酸等培养基添加物代替。
培养在振荡培养、深层通气搅拌培养等有氧条件下进行。培养温度一般优选20-40℃。培养基的pH理想的是维持在中性附近。用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等调节pH。培养时间通常为1-6天。
培养结束后，除去菌体。可以通过活性炭处理、离子交换树脂处理等众所周知的方法，从所得的培养液中回收L-赖氨酸。
以下是本发明的实施例，但本发明不限于这些实施例。
实施发明的最佳方式实施例1 质粒pCS299P的构建用以下方法构建可以在大肠菌和棒状细菌两者中自主复制的穿梭质粒pCS299P。
用BglII(宝酒造社生产)酶切pCG116[Bio/Technology，11，921(1993)]，获得BglII酶切片段。
用BamHI(宝酒造社生产)酶切pHSG299(宝酒造社生产)后，将所得的BamHI酶切片段按常规方法通过乙醇沉淀法浓缩，然后用碱性磷酸酶处理所述片段。将所得的上述两种片段混合，用连接试剂盒Ver.1(宝酒造社生产)进行连接酶反应。用反应产物按常规方法[Molecular Cloing，第2版，1989年，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(以下简称分子克隆第2版)]转化大肠菌NM522菌株。在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1L水中含有10g细菌用胰蛋白胨(Difco生产)、5g酵母膏(Difco生产)、10g氯化钠、16g细菌培养用琼脂(Difco生产)，调至pH 7的培养基]上培养所述菌株，由此选择转化体。所述转化体用含20μg/ml卡那霉素的LB培养基过夜培养，通过碱SDS法(分子克隆第2版)由所得的培养液制备质粒，得到pCS116-299Bgl1 DNA。
按常规方法证实所述pCS116-299Bgl1的限制性酶切位点。
用pCS116-299Bgl1 DNA通过电穿孔法[FEMS MicrobiologyLetters，65.299(1989)]转化产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)ATCC6872。
在含有20μg/ml卡那霉素的CM琼脂培养基[1L水中含有10g聚胨S(日本制药社生产)、5g酵母膏S(日本制药社生产)、10g Ehrlich肉膏(极东制药工业社生产)、3g氯化钠、30μg生物素，调至pH 7.2的培养基]上培养所述菌株，由此选择转化体。按常规方法从所述转化体中提取质粒，通过用限制性酶酶切所述所质粒，证实了该质粒是pCS116-299Bgl1。
将pCS116-299Bgl1 DNA用PstI(宝酒造社生产)和BamHI酶切后，通过乙醇沉淀法纯化。用Kilo测序缺失试剂盒(宝酒造社生产)由所得的DNA获得部分缺失的质粒。按常规方法用该质粒转化大肠菌NM522菌株。将所述菌株在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上培养，由此选择转化体。将所述转化体用含20μg/ml卡那霉素的LB培养基过夜培养。然后用碱SDS法从所得的培养液中制备质粒。按常规方法，对所得的各种质粒作限制性酶切图谱，选择部分缺失长度不同的质粒。
通过电穿孔法，用所选择的质粒转化产氨棒杆菌ATCC6872。所得的转化体在含20μg/ml卡那霉素的CM琼脂培养基上涂布后，于30℃培养2天，以有无出现卡那霉素抗性菌落作为指标，选择能够在产氨棒杆菌中自主复制的质粒。
在能够自主复制的质粒中选择缺失区最长的质粒，将这种质粒称为pCS299del6。
根据常规方法，从转化体中制备pCS299del6 DNA后，用限制性酶DraI和PvuII(均为宝酒造社生产)酶切。所述酶切的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后，分离出含有来源于pCG116的DNA的约2.7kb DNA片段，然后用DNA prep(旭硝子社生产)进行提取纯化。
根据常规方法，用EcoRV(宝酒造社生产)酶切pBluescriptSK(+)(东洋纺织社生产)。所得的酶切DNA片段经乙醇沉淀法浓缩后，用碱性磷酸酶处理。所述经处理的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分离后，用DNA prep进行提取纯化。
用连接试剂盒ver.1将上述2.7kb片段和pBluescript SK(+)片段连接后，按常规方法用所述连接的DNA转化大肠菌NM522菌株。该菌株在含100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)、1mmol/L IPTG(硫代异丙基-β-D-半乳糖苷)的LB琼脂培养基上培养，由此选择转化体。所述转化体用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基过夜培养，通过碱SDS法从所得的培养液中制备质粒。按照常规方法，对所得的各种质粒作限制性酶切图谱。由EcoRI酶切产生3.4kb和2kb片段的质粒称为pCSSK21。
合成序列鉴定号1、2中所示的DNA，用这些DNA作为引物，用pHSG299DNA作为模板，用Taq DNA聚合酶(宝酒造社生产)按照所附的反应条件进行PCR反应。按照常规方法将反应产物进行乙醇沉淀后，用限制性酶PstI和XhoI(宝酒造社生产)酶切。所述经酶切的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，所得的约1.3kb DNA片段用DNA prep提取纯化。
合成序列鉴定号3、4中所示的DNA，用这些DNA作为引物，用pHSG299DNA作为模板，用Taq DNA聚合酶(宝酒造社生产)按照所附的反应条件进行PCR反应。按照常规方法将反应产物进行乙醇沉淀后，用限制性酶PstI和BglII酶切。所述经酶切的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，所得的约1.3kb DNA片段用DNA prep提取纯化。
如上所述获得的质粒pCSSK21用SalI(宝酒造社生产)和BamHI酶切。所述经酶切的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，所得的约2.7kbDNA片段用DNA prep提取纯化。将经提取纯化的上述3种DNA片段混合后，用连接试剂盒ver.1进行连接。
按照常规方法，用所述连接的DNA片段转化大肠菌NM522菌株。该菌株在含20μg/ml卡那霉素、50μg/ml X-Gal、1mmol/LPTG的LB琼脂培养基上培养，由此选择转化体。
所述转化体用含20μg/ml卡那霉素的LB培养基过夜培养，通过碱SDS法从所得的培养液中制备质粒。按照常规方法，对所得的各种质粒作限制性酶切图谱，具有
图1记载的构造的质粒称为pCS299P。
实施例2 生产L-赖氨酸的突变体的产生和来自该突变体的AK基因的碱基序列的确定用NTG对谷氨酸棒杆菌野生型菌株(ATCC13032)施加诱变处理(微生物实验指南，1986年，第131页，讲谈社サィエンティフィック社)后，在含1mg/ml AEC和1mg/ml L-苏氨酸的基本琼脂培养基[1升水中含有5g葡萄糖、0.75g磷酸氢二钾、0.75g磷酸二氢钾、1g硫酸铵、0.5g七水硫酸镁、0.1g氯化钠、10mg七水硫酸亚铁、8mg七水硫酸锰、1mg氯化钙、1mg盐酸硫胺素、0.03mg生物素、16g琼脂(Difco生产)，调至pH 7.2的培养基]上涂布，于30℃培养2天。分离所出现的菌落，用下述实施例5所述的方法进行L-赖氨酸生产试验，选出生产率提高的克隆。
通过以下的PCR法，从其中一个变异株(AEC11株)和野生型菌株ATCC13032中扩增AK基因，然后测定碱基序列。
根据斋藤等人的方法[Biochimica et Biophysica Acta，72，619(1963)]，从各种菌株中制备染色体DNA。根据谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中已知的AK基因的碱基序列[GenBank，登录号E06825]，设计扩增用的DNA引物。所述DNA引物示于序列鉴定号5和6中。用如上所述制备的染色体DNA、DNA引物、Perkin Elmer制造的热循环仪(GeneAmp PCR系统9600)、得自Phyrococcus sp.KOD菌株的DNA聚合酶(东洋纺社生产)和所附的缓冲液进行PCR。以94℃-30秒、60℃-30秒、74℃-60秒的反应作为一个循环，进行30个循环的PCR。用PCR Product Presequencing试剂盒(AmershamPharmacia生产)纯化所扩增的约1.5kb DNA后，将所述纯化的DNA作为模板进行循环测序。根据上述AK基因的碱基序列，设计测序反应中所用的DNA引物。所述DNA引物示于序列鉴定号7-16中。使用ABI PRISM Dye Termanitor Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(Perkin Elmer生产)，以96℃-10秒、50℃-5秒、60℃-4分钟的反应作为一个循环，进行25个循环测序反应，通过ABI PRISM 377DNA测序系统(Perkin Elmer生产)测定碱基序列。
来源于AEC11菌株的突变型AK基因的碱基序列和对应的可读框的氨基酸序列分别示于序列鉴定号17和18中。在序列鉴定号17中所示的突变型AK基因的碱基序列中第932位是胸腺嘧啶，而在野生型AK基因中是胞嘧啶。通过该碱基的置换，野生型AK基因中第311位的L-苏氨酸残基(密码子ACC)在来源于AEC11菌株的AK基因中被置换为异亮氨酸残基(密码子ATC)。作为谷氨酸棒杆菌的AK基因的脱敏型突变，报道了Ala279的Ala以外的氨基酸突变(特开平6-62866、特开平6-261766)、Gly345Asp(Journal of Bacteriology，175，4096(1993)]、Ser301Tyr[Molecular Microbiology，5，1197(1991)]、Ser301Phe、Thr308Ile(均为特开平6-261766)等，但本发明的突变全都不符合。
实施例3 突变型AK基因的克隆和向棒状细菌的导入用以下方法评价上述突变对L-赖氨酸生产率的影响。
通过PCR法，从谷氨酸棒杆菌野生型菌株(ATCC13032)和L-赖氨酸生产菌AEC11菌株中克隆AK基因。用与实施例2相同的方法获得的、含来源于ATCC13032菌株或者来源于AECC11菌株的AK基因的约1.5Kb的基因片段用SalI、BamHI(宝酒造社生产)处理后，通过琼脂糖电泳分离，从凝胶中切出，然后通过Gene Clean试剂盒(BIO 101生产)纯化。将实施例1所述的在大肠杆菌(E.coli)和棒状细菌两者中能够自主复制的穿梭质粒pCS299P用SalI、BamHI酶切，用连接试剂盒ver.1(宝酒造社生产)将其与上述AK基因片断连接。用所述连接产物按照生产商的说明转化大肠杆菌DH5α菌株(东洋纺社生产)后，分离出在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长的菌落。培养这些菌落，用与实施例1相同的方法制备质粒DNA。按照实施例2所述的方法测定碱基序列，选择不含由于PCR过程引起的突变的克隆。将通过这种选择所得到的含有来源于ATCC13032菌株的AK基因的质粒之一命名为pAK1，含有来源于AECC11菌株的AK基因的质粒命名为pAK2。
实施例4 谷氨酸棒杆菌的野生型AK和突变型AK的酶分析按照电穿孔法[FEMS Microbiology Letters，65，299(1989)]，分别将质粒pAK1、pAK2和pCS299P导入谷氨酸棒杆菌野生型菌株ATCC13032中。将所得的带有质粒pAK1的菌株命名为Tf-14，将带有pAK2的菌株命名为Tf-5，而将带有pCS299P的菌株命名为Tf-21。根据Follettie等人的方法[Journal of Bacteriology，175，4096(1993)]，测定这些转化株的AK活性。
在表1中显示了转化株粗提液的AK比活。
表明在导入含AK基因的质粒的菌株(Tf-14和Tf-5)中，AK比活比在导入载体的菌株(Tf-21)中的高6倍。Tf-5不仅解除了L-赖氨酸和L-苏氨酸所致的协同抑制，也大大解除了L-赖氨酸引起的反馈抑制。
将Tf-5于平成11年4月2日保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(日本国茨城县つくば市东1丁目1番3号)，保藏号FERM BP-6689。
表1AK比活(nmol天冬氨酰-异羟肟酸/mg蛋白/min)菌株 L-Lys L-Thr L-Lys+L-Thr无添加 1mM10mM1mM 10mM各1mM 各10mMTf-212.8Tf-1417.316.59.723.124.34.81.2(100) (96) (56)(133) (140) (28) (7)Tf-5 16.716.715 30.935.818.2 18.4(100) (100) (89) (185) (215) (109) (110)在括号内显示以无添加时的比活作为100的相对活性值(％)。
实施例5 在谷氨酸棒杆菌中变异型AK对L-赖氨酸生产能力的影响培养评价在实施例4中所产生的Tf-5、Tf-14和Tf-21的L-赖氨酸生产能力。
将各种菌株接种于5ml种子培养基(1升水中含有50g蔗糖、30g大豆水解物、3g尿素、20g蛋白胨、20g酪蛋白氨基酸、20g肉膏、0.5g七水硫酸镁、2g磷酸二氢钾、8g硫酸铵、1mg盐酸硫胺素、0.1mg生物素、10mg泛酸钙、10mg七水硫酸亚铁、1mg七水硫酸锌、20mg烟酸和10g碳酸钙，pH 7.2]中，于30℃振荡培养16小时。
将通过培养获得的1ml种子培养液接种于10ml主培养培养基(1L水中含有200g废糖蜜、45g硫酸铵、1g尿素、0.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、0.3mg生物素和30g碳酸钙，pH 7.0)中，于30℃振荡培养72小时。将作为质粒抗药性标记的卡那霉素抗性作为指标，测定培养结束时的质粒保持率，表明稳定性全都高达约100％。
在培养基中积累的L-赖氨酸的定量通过高效液相色谱进行。
表2显示了结果。
表明通过导入本发明的突变型AK基因，显著提高了L-赖氨酸的生产能力。
表2菌株 L-赖氨酸生产率(g/L)Tf-210.1Tf-140.1Tf-5 8.1工业应用性根据本发明，可以使棒状细菌中的L-赖氨酸生物合成关键酶AK解除由L-赖氨酸和L-苏氨酸引起的协同反馈抑制以及由单独的赖氨酸引起的反馈抑制，将其改变为脱敏型，成为有利于L-赖氨酸生产的酶。
序列表的单独文本序列鉴定号1人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号2人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号3人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号4人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号5人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号6人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号7人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号8人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号9人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号10人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号11人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号12人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号13人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号14人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号15人工序列的说明-合成的DNA序列鉴定号16人工序列的说明-合成的DNA
序列表<110>KYOWA HAKKO KOGYO CO..LTD<120>新型脱敏型天冬氨酸激酶<130>11203WO1<140><141><150>JP 99/110437<151>1999-04-19<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>1aaaaagatct cgacggatcg ttccactg 28<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>2gtaaaacgac ggccatg 17<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>3cgagtcgact cgcgaagtag cacctgtcac ttttg35<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>4tggggatccg caccaacaac tgcgatggtg gtc 33<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>5aaaactcgag aggtctgcct cgtg24<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>6caggaaacag ctatgac17<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>7tgcagcggca gtgaatcccg ttccgcc 27<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>8ttctgacacc actgcagttg cgttgg 26<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>9tcgcaaccga caagtccgaa gccaaag 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320Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415Ala Gly Thr Gly Arg420
权利要求
1.一种来源于棒状细菌、编码天冬氨酸激酶的DNA，所述天冬氨酸激酶具有在序列鉴定号18中所述的氨基酸序列中第311位氨基酸残基被置换为Thr以外的氨基酸的氨基酸序列，并且解除了L-赖氨酸和L-苏氨酸引起的协同反馈抑制。
2.权利要求1所述的DNA，其中所述DNA是具有序列鉴定号17所述碱基序列的DNA。
3.权利要求1所述的DNA，其中所述棒状细菌是属于选自棒杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)的一个属的棒状细菌。
4.一种重组DNA，所述重组DNA通过将权利要求1-3中任一项所述的DNA插入载体中而得到，并且能够在棒状细菌中复制。
5.一种棒状细菌，所述棒状杆菌在染色体上带有权利要求1-3所述的DNA。
6.一种转化体，所述转化体含有权利要求4所述的重组DNA，属于棒状细菌。
7.权利要求6所述的转化体，其中所述转化体是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)Tf-5(FERM BP-6689)。
8.一种L-赖氨酸的生产方法，其特征为，在培养基中培养选自权利要求5所述的棒状细菌、权利要求6以及7所述的转化体的微生物或转化体，在培养物中生产积累L-赖氨酸，然后从该培养物中收集L-赖氨酸。
9.一种天冬氨酸激酶，所述天冬氨酸激酶由权利要求1-3中任一项所述的DNA编码。
10.一种来源于棒状细菌、编码天冬氨酸激酶的DNA，所述DNA具有在序列鉴定号18所述的氨基酸序列中第311位氨基酸残基是Thr的碱基序列。
11.权利要求10所述的编码天冬氨酸激酶的DNA，其中所述DNA具有序列鉴定号17所述的第932位碱基被胞嘧啶置换的碱基序列。
12.一种天冬氨酸激酶，所述天冬氨酸激酶由权利要求9-11中任一项所述的DNA编码。
全文摘要
本发明涉及来源于棒状细菌的新型天冬氨酸激酶;编码该酶的DNA;含有上述DNA的重组DNA;具有所述重组DNA的棒状细菌或在染色体上具有所述DNA的棒状细菌;以及通过培养上述微生物生产L－赖氨酸的方法。已经成功地构建了解除了L－赖氨酸和L－苏氨酸的协同反馈抑制的天冬氨酸激酶的编码DNA,所述DNA来源于棒杆菌,并且具有这样的碱基序列,其中SEQ ID NO:18所示氨基酸序列中的311位氨基酸残基是Thr以外的氨基酸。
文档编号C12N1/19GK1355849SQ00808835
公开日2002年6月26日 申请日期2000年4月14日 优先权日1999年4月19日
发明者横井治彦, 大西淳子, 落合惠子, 米谷良之, 尾崎明夫 申请人:协和发酵工业株式会社