特异干扰猪瘟病毒基因组序列及高效治疗猪瘟病毒感染的方法

专利名称：：特异干扰猪瘟病毒基因组序列及高效治疗猪瘟病毒感染的方法
技术领域：
：本发明提供一种特异干扰猪瘟病毒基因组序列，同时还公开了高效治疗猪瘟病毒感染的方法，涉及治疗猪瘟病毒感染的药物，属于生物制药
技术领域：
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背景技术：
：本发明涉及的猪瘟病毒以下简写CSFV。目前，为了防止猪瘟病毒感染的一般采用被动免疫(注射高免血清)和主动免疫方法，但是仍然不能完全防治猪瘟流行。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)首次报道于1998年，是近两年才逐渐发展起来的一种全新的技术，RNAi从一发现开始就受到病毒学研究者的高度重视，被认为是抗病毒感染的最有效方法之一并被用于病毒学研究领域。应用RNAi技术抑制病毒增殖的关键是获得高效、特异的干扰小RNA(siRNA)序列。经检索应用RNA干扰法生产治疗猪瘟病毒感染的药物未见报道。
发明内容本发明提供了一种特异干扰猪瘟病毒基因组序列，用于T7RNA聚合酶体外转录系统和质粒表达系统，得到了高效、特异抑制猪瘟病毒的干扰RNA分子，适用于工业化生产。本发明还提供了利用该基因组序列生产的生物制剂，对CSFV的抑制效率高达到95.1-99.0%，在敏感动物体内能明显阻止CSFV的感染，使动物免于发病和死亡。本发明的特异干扰猪瘟病毒基因组序列如下AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTAGTGACGGA;AAGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACC。本发明的猪瘟病毒基因组上序列制成的生物制剂可通过两种方法实现方法一包括以下步骤合成所述序列的siRNA分子的正义链和反义链模板DNA和T7脂A聚合酶结合序列，利用T7RNA聚合酶体外转录设计合成siRNA分子，得到体外转录生成的siRNA分子猪瘟治疗生物制剂。方法二包括以下步骤按照pSilencer3.1H1HygroshRNA载体使用方法，合成针对根据权利要求1所述的猪瘟病毒基因组上序列的能生成shRNA分子的质粒，得到猪瘟治疗生物制剂。本发明优点在于对所选猪瘟病毒基因组上序列，利用RNA干扰技术设计合成RNA干扰分子后，这些RNA干扰分子能特异、高效抑制猪瘟病毒增殖从而对猪瘟病毒感染有明显治疗作用，对CSFV的抑制效率高达到95.1-99.0%，在敏感动物体内能明显阻止CSFV的感染，使动物免于发病和死亡。1.选择干扰RNA分子作用的序列利用RNA干扰技术设计合成RNA干扰分子后，这些RNA干扰分子能特异、高效抑制猪瘟病毒增殖从而对猪瘟病毒感染有明显治疗作用。在猪瘟病毒基因组序列中的保守区域，根据具有AA-N29特征的31nt序列，进行同源性和二级结构分析，选择猪瘟病毒基因组上的以下2个干扰RNA分子作用序列表1干扰RNA分子作用序列及其位置针对基因siRNA分子干扰序列位置*命名『AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTAGTGACGGA721-751Nl『AAGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACC820-850N2*:位置相对与参考毒株shimen，GenBank登录号AF092448。2.根据上述的干扰RNA分子作用序列Nl、N2制成猪瘟治疗生物制剂可以通过以下两种方法制得1)体外合成siRNA分子生物制剂根据干扰RNA分子作用的序列Nl、N2分别合成编码siRNA分子的正义链和反义链模板DNA和T7RNA聚合酶结合序列，并确定对照序列为Nl序列的反向序列。利用T7RNA聚合酶体外转录设计合成siRNA分子，得到体外转录生成的siRNA分子猪瘟治疗生物制剂。序列如下T7RNA聚合酶结合序列GGATCCTAATACGACTCACTATANl正义链模板序列AATCCGTCACTACCTGTCACCCTACCTATCCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCNl反义链模板序列AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTAGTGACGGATATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN2正义链模板序列AATTTCCCGTGGCTAATCCACTTCAGGGTTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN2反义链模板序列AAGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC对照的正义链模板序列AACCTATCCATCCCACTGTCCATCACTGCCTTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC对照的反义链模板序列AAAGGCAGTGATGGACAGTGGGATGGATAGGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC将上述合成的DNA序列用无DNA酶、无RNA酶的水分别稀释为100pmol/L，用PCR方法将它们分别合成为双链DNA序列。2)质粒表达shRNA干扰分子的生物制剂根据pSilencer3.1H1Hygro(Ambion)shRNA载体设计要求，设计用于表达shRNA干扰的DNA序列，设计策略见图3。合成针对猪瘟病毒基因组上序列的能生成shRNA分子的质粒，得到猪瘟治疗生物制剂。为了提高序列正确退火成为双链DNA分子的效率，设计为用DNA聚合酶合成的PCR策略，将表达目的shRNA序列的DNA序列拆分为两段部分互补配对的序列，然后用VNTI3.0辅助分析，使拆分的两段序列之间的互补配对碱基为21-23bp，而各拆分序列自身配对碱基少于10bp，以提高PCR合成双链模板DNA的效率。表2合成各个shRNA模板DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>通过以下检测方法证明本发明制剂具有抑制猪瘟病毒增殖的作用:例l体外合成的siRNA抑制猪瘟病毒增殖①计数PK-15细胞，用含10%小牛血清、0.3%谷氨酰胺、无抗生素的MEM营养液以1.0X107孔传代于24孔细胞培养板，37°C5XC02培养24h，使贴壁细胞生长满度约为30%-50%，吸去营养液，用无血清无抗生素的MEM营养液洗涤单层细胞3次，加入450uL无血清无抗生素的MEM备用。②用X-tremeGenesiRNATransfectionReagent(Roche)将合成的si腿分子转染PK-15细胞，具体方法为分别于无核酸酶的离心管中加入无血清无抗生素的MEM营养液47.5"L、X-tremeGenesi腿TransfectionReagent2.0"L,轻轻混匀，室温静置3-5min,取另一无核酸酶的离心管，加入无血清无抗生素的MEM营养液48.0PL，siRNA分子(shNl+shN2，体积比1:1或sh对照)2.0uL，轻轻混合均匀，室温静置3-5min，混合上述两个离心管中溶液，室温静置15-20min，使脂质体和siRNA形成转染复合物，然后分别加入PK-15细胞单层中，轻轻混匀，37t:孵育4-6h，用无血清无抗生素的MEM洗涤转染细胞，换用含2%小牛血清的MEM营养液于37°C，5%0)2培养箱培养20h，用5.0Xl(fTCID5。的猪瘟病毒Shimen株感染转染了si脂A的细胞，感染后培养72h，用间接免疫荧光试验、Real-timePCR和病毒的半数细胞感染量(TCID50)测定等方法检测猪瘟病毒在转染细胞中的增殖，测定siRNA对猪瘟病毒感染增殖过程中病毒基因表达的抑制作用。表1间接免疫荧光试验检测细胞被感染情况结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>转染siRNA的PK-15细胞感染猪瘟病毒后，间接免疫荧光检测结果表明，未转染的PK-15细胞和转染si对照的PK-15细胞，感染猪瘟病毒72h后，几乎所有的细胞均能被荧光抗体染色，细胞发出绿色荧光，转染猪瘟病毒特异的siRNA(siNl+siN2)的细胞感染猪瘟病毒后，只有极少的细胞能被荧光抗体染色，出现荧光的细胞不到全部细胞的0.5%。表2Real-timePCR方法检测病毒基因组增殖情况<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>结果显示转染对照siRNA分子的细胞感染病毒后72h,细胞总RNA中的猪瘟病毒基因组RNA拷贝数为5.95Xl(fcopies/5ng总RNA，而siNl+siN2转染细胞的猪瘟病毒基因组RNA拷贝数为3.97X104copies/5ng总RNA，为转染si对照细胞的1/15，表明导入细胞的猪瘟病毒特异的si認A分子抑制了病毒在感染细胞中的增殖。回收Real-timePCR产物，进行序列测定，结果表明Real-timePCR扩增片段为猪瘟病毒Shimen株NS5B基因片段，说明检测结果具有高度的特异性。表3测定细胞中病毒的半数细胞感染量(TCIDs。)增减情况<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>结果显示转染对照Si对照的细胞感染猪瘟病毒后，病毒能有效地在细胞中增殖，显示出较高的感染滴度，感染后60h的TCID5。测定结果为1X10425'与未转染细胞感染猪瘟病毒后60h的相当，表明转染试剂及转染过程对细胞支持猪瘟病毒的增殖能力有效较小，而转染猪瘟病毒siRNA分子(siNl+siN2)的细胞感染猪瘟病毒后，TCIDs。较低，病毒感染后60h，siNl、siN2、转染细胞的TCID5。与si对照的感染滴度相比，其TCID5为1/55倍，表明siNl+siN2有效地抑制了猪瘟病毒的增殖。例2.表达的shRNA抑制猪瘟病毒增殖用含有10%小牛血清、不含抗生素的MEM营养液传代PK-15细胞于24孔细胞培养板，每孔5.0X1(V细胞/500uL个，37°C，5%002培养箱中培养20-24h，使细胞贴壁生长满度达到90-95%，用Lipofectamine2000(Invitrogen)进行转染，(每孔细胞)方法为①取0.8yg质粒(shNl+shN2，质量比1:1)DNA加入50yL无血清无抗生素的MEM中，混匀。②取2.0uLLipofectamine2000加入50PL无血清无抗生素的MEM中，轻轻混匀，于室温静置5min。③将稀释的质粒DNA加入稀释的Lipofectamine2000中，轻轻混匀后于室温静置20min，以形成DNA-Lipofectamine2000复合体。将形成的DNA-Lipofectamine2000加入到上述准备的中，轻轻混匀，置于37"5%0)2培养箱中转染4-6h，换用含有2%小牛血清和抗生素的MEM，37°C5%0)2培养箱中培养备用°◎抗生素抗性筛选将转染了shRNA表达质粒的细胞，按优化确定的传代细胞满度，用含10X血清的MEM传代于6孔细胞培养板中(同时传代相同满度的未转染的PK-15细胞作为加压的正常对照细胞)，培养24h后，换用含有杀细胞浓度的相应抗生素(hygromicinB)、含有2X血清的MEM，37。C培养，杀死未转入质粒的细胞。其间每隔3d换用含抗生素的新鲜营养液，直至对照细胞完全死亡，转染质粒的细胞长出细胞集落。换用含有50%杀细胞浓度的相应抗生素继续培养转染细胞，细胞集落长满培养孔后，扩大培养筛选所得细胞备用。⑥表达的shRNA抑制猪瘟病毒的效果检测筛选得到的有抗生素抗性的转染细胞，用无抗生素(hygromicinB)的MEM传代于96孔细胞培养板，培养20-24h后，用1X102TCID5。的猪瘟病毒Shimen株感染，病毒感染后培养72h，用间接免疫荧光、Real-timePCR、病毒的半数细胞感染量(TCIDS,>)测定等方法检测猪瘟病毒在转染细胞中的增殖，测定siRNA对猪瘟病毒感染增殖过程中病毒基因表达的抑制作用。表4间接免疫荧光试验检测细胞被感染情况<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>间接免疫荧光试验检测细胞被感染情况结果表明，设计的shRNA分子抑制了病毒感染细胞。表5Real-timePCR方法检测基因组RNA拷贝数测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注抑制率-(对照分子数一shRNA样品分子数)/对照分子数X100X，计算shRNA抑制病毒基因组复制的效率，表中抑制倍数为对照/shRNA的值一l。Real-timePCR方法检测基因组RNA拷贝数测定结果表明猪瘟病毒在转染细胞中的基因组复制受到了高效的抑制。表6稳定转染细胞感染猪瘟病毒后不同时间tcid5。测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>检测结果表明转染sh对照的细胞，在猪瘟病毒感染后，其感染滴度增加迅速，在感染后48-60h达到高峰，体现了猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖时其感染滴度的变化特点，而与对照细胞相比，转染猪瘟病毒特异的shRNA表达质粒的细胞，猪瘟病毒的感染滴度增加速度慢，且比对照细胞的感染滴度低得多，在对照细胞的感染滴度达到高峰(48-60h)时，转染猪瘟病毒特异的shRNA表达质粒的细胞的感染滴度仍然保持在较低的水平，且呈现出较为平滑的增长趋势，表明质粒表达的猪瘟病毒特异的shRNA使猪瘟病毒的成熟的感染性的病毒粒子的组装过程受到了抑制，且抑制作用能持续较长的时间，转染猪瘟病毒特异的shRNA表达质粒的细胞感染病毒后即使在感染滴度最高的时间(72-96h)，其感染滴度仍比对照低一个数量级。检测结果表明，在感染后60h，按sh对照/shRNA—l计算抑制倍数，则shNl抑制猪瘟病毒TCIDs(,的倍数分别为71.1倍，即使在shRNA转染细胞TCID,;。较高的96h，仍然对病毒具有4-10倍的抑制效率。例3动物实验水平①购进35只日本大耳白家兔，进行编号，饲养观察7d，测定家兔正常基础体温每天测定两次，将编号的家兔用SPSS软件进行随机分组，每组8只，分组及注射见表3。表3实验家兔分组<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实验家兔分组后，按上表的所示的注射剂量，分别注射转录获得的siRNA(s皿+siN2，质量比1:l)和shRNA(shNl+shN2，质量比1:l)表达质粒，其中质粒在攻毒前24h注射，注射部位为颈部皮下，siRNA与攻毒同时注射，为静脉注射。②HCLV攻毒及体温测定注射shRNA表达质粒和siRNA的家兔，通过静脉注射50XID5。的猪瘟兔化弱毒株，注射后24h内每12h测量2次体温，24h后每间隔6h测定家兔体温，直到家兔体温恢复到正常体温值。表7各组家兔的平均体温rc)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>如表所示，在体外转录的siRNA实验组si对照、siNl+siN2两个组中，注射转录的si对照组的家兔首次升温超过基础体温的0.5'C的时间是在30h，之后动物持续出现高热，且能持续6个温次(36h)至攻毒后60h，而实验组出现发热时间的明显比对照组延迟，siNl+siN2组的时间在攻毒后48h，比对照组的发热时间延迟了12h，且发热温次只有3个,且发热期的平均体温均低于对照组。在注射shRNA表达质粒的两个实验组中，注射sh对照表达质粒的家兔发热的时间出现在36h，持续时间为36h，而实验组shNl+shN2的发热时间在54h，比对照组延迟了18h，持续时间为18h(3个温次)。从表中的实验结果看出，注射猪瘟病毒特异干扰RNA的实验组均表现出发热时间延迟，发热平均温度比对照组略低，且发热持续时间比对照组大大縮短的特点，表明猪瘟病毒特异的干扰RNA延迟了猪瘟兔化弱毒株在家兔体内的增殖，推迟了使家兔出现高热反应所需的病毒量。从图2中的家兔体温变化趋势图中可以看出，实验组的体温上升速度明显比对照组慢，出现持续高热的时间比对照组的短，且温度较对照组低。③抑制病毒增殖测定恢复到正常体温的家兔，在6h内捕杀，无菌采集家兔脾脏和肠系膜淋巴结，用Real-timePCR、病毒的半数细胞感染量(TCID5。)测定等方法检测猪瘟病毒在家兔体内中的增殖，测定siRNA分子对猪瘟病毒感染增殖过程中病毒基因表达的抑制作用。在用50XID5。的猪瘟病毒兔化弱毒株攻毒后测定家兔的体温，提取家兔脾脏总RNA，用Real-timePCR检测病毒基因组增殖情况，结果显示见表8。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>结果表明，si对照,siNl+siN2，sh对照，shNl+shN2注射组所对应的HCLV的ID50分别为1X10383，1X10"。，1X103.92，1X10313，对照组si对照的ID5。是siNl+siN2的4.22倍，sh对照的105。是shNl+shN2的6.18倍。测定结果表明注射转录的siRNA和shRNA表达质粒均有效地抑制了猪瘟兔化弱毒株在家兔体内的增殖。本发明的积极效果在于应用RNA干扰法生产治疗猪瘟病毒感染的生物制剂，得到了高效、特异抑制猪瘟病毒的干扰RNA分子，适用于工业化生产。本发明还提供了利用该方法生产的生物制剂，对CSFV的抑制效率高达到95.1-99.0°/。，在敏感动物体内能明显阻止CSFV的感染，使动物免于发病和死亡。图1为本发明体外转录合成siRNA分子示意图。图2家兔攻毒后的体温曲线。图3为本发明shRNA分子的示意图。具体实施例方式实施例1siRNA设计分析GenBank中己发表的猪瘟病毒基因组序列，选择基因组中保守的区域，根据RNAi技术的要求，寻找具有AA-Nw特征的31nt序列，进行BlastN和二级结构分析，根据BlastN分析结果，用VNTI3.0软件分析它们的(G+CH、Tm值、内部发夹环结构等理化参数，选择(G+CH较低的序列，设计了针对猪瘟病毒N^基因的2个siRNA分子干扰序列。所设计的序列及其在猪瘟病毒基因组中的位置如表10所示表IOsiRNA分子干扰序列及其位置针对基因siRNA序列位置'命名『AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTAGTGACGGA721-751Nl『AAGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACC820-850N2*:位置相对与参考毒株shimen，GenBank登录号AF092448。实施例2体外合成siRNA:按T7RiboMAXExpressRNAiSystem(Promega)说明书设计合成实施例1中选定的2个片段的siRNA分子的DNA序列和T7RNA聚合酶结合序列，并确定对照序列为Nl序列的反向序列，参见附图l;分别合成转录各个siRNA分子的正义链和反义链的模板DNA，序列如下T7RNA聚合酶结合序列GGATCCTAATACGACTCACTATANl正义链模板序列AATCCGTCACTACCTGTCACCCTACCTATCCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCNl反义链模板序列AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTAGTGACGGATATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN2正义链模板序列MTTTCCCGTGGCTAATCCACTTCAGGGTTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN2反义链模板序列AAGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC对照的正义链模板序列AACCTATCCATCCCACTGTCCATCACTGCCTTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC对照的反义链模板序列AAAGGCAGTGATGGACAGTGGGATGGATAGGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC具体步骤为将上述合成的DNA用无DNA酶、无RNA酶的水分别稀释为100pmol/L，按下面步骤分别合成3个siRNA分子。用PCR方法将它们分别合成为双链DNA，在洁净的无DNA酶、无RNA酶的PCR管中加入稀释的T7RNA聚合酶结合序列DNA5.0PL，分别加入上述3个用来转录成siRNA分子的的正义链和反义链DNA5.0uL，lOXpfuDNApolymerasebuffer5.0yL，10mmol/LdNTP1.0"L，水33.8uL，置于PCR仪95。C变性2min，加入pfuDNApolymerase0.2uL(1U)，再于95。C变性30s,56。C退火30s，72。C延伸10s,5个循环后，72i:后延伸7min。反应结束后，加入经DEPC处理并高压灭菌的3mol/L醋酸钠(pH5.2)5.0uL，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于-20。C放置10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，沉淀于室温干燥10min，加入无DNA酶、无RNA酶的水50yL充分溶解沉淀，聚丙稀酰胺凝胶电泳检查模板DNA制备结果。转录方法按T7RiboMAXExpressRNAiSystem说明书进行体在洁净的无DNA酶、无RNA酶的PCR管中依次加入上述制备的模板DNA4.0uL，RiboMAXExpressT72XBuffer10.OuL，Nuclease-FreeWater4.OuL,EnzymeMix,T7Express2.OiiL，然后置于37。C反应1h;加入无RNA酶的DNA酶LOuL(lU)，37°C30min;混合相应的siRNA正义和反义链转录物，7(TC保温10min，缓慢降温至室温；加入l/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)，加入等体积的异丙醇，混匀后冰浴5min，13000r/min离心10min，小心吸去上清液，500wL70%乙醇洗涤沉淀，沉淀于室温干燥10-15min，加入100uL水充分溶解沉淀，电泳检查，测定含量后分装为0.3pg/uL，-80。C保存备用。得到体外合成的siRNA猪瘟治疗生物制剂，其碱基序列见表11。表11体外合成的siRNA猪瘟治疗生物制剂及对照siRNA分子<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例3质粒表达shRNA分子的设计方法根据pSilencer3.1H1Hygro(Ambion)shRNA载体设计要求，设计用于表达shRNA的DNA序列，设计策略见表12。为了提高序列正确退火成为双链DNA分子的效率，设计为用DNA聚合酶合成的PCR策略，将表达目的shRNA序列的DNA序列拆分为两段部分互补配对的序列，然后用VNTI3.0辅助分析，使拆分的两段序列之间的互补配对碱基为21-23bp，而各拆分序列自身配对碱基少于10bp，以提高PCR合成双链模板DNA的效率。设计合成的各个shRNA模板DNA序列如表12:表12生成shRNA分子的模板DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>具体步骤如下:按下面步骤分别合成3个生成shRNA分子的质粒，将合成的DNA稀释为100umol/L，用PCR方法将它们分别合成为双链DNA，方法为取稀释的DNA5.0uL，加入10XpfuDNApolymerasebuffer5.0uL，10,ol/LdNTP1.0yL，水33.8yL，置于PCR仪95。C变性2min，加入pfuDNApolymerase0,2uL(1U)，再于95°C30s，56。C30s，72。C10s，5个循环后，72°C后延伸7min。反应结束后，加入3mol/L醋酸钠(pH5.2)5.0，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于-20。C放置10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用1000uL70%乙醇洗涤沉淀，弃去上清液，沉淀于室温干燥10min，加入50"L水充分溶解沉淀，-S(TC保存备用。用^a/z//1和//i'/^III双酶切表达shRNA的DNA插入片段，酶切消化结束后于70'C保温15min灭活内切酶，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后分别将它们克隆到pSilencer3.1H1Hygro载体的fe/n/ZI和ffi/7dl1位点，转化大肠杆菌，对转化菌落用31H1FP(GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG)和31H1RP(GCGGATAACAATTTCACACAGG)为引物进行PCR快速鉴定，对PCR阳性克隆小量提取质粒，通过测序确定重组质粒中的插入片段的正确性。得到的质粒表达的shRNA分子能抑制猪瘟病毒增殖，表达shRNA分子的pSilencer3.1H1Hygro载体在5rfl和历y7offl酶切位点间插入序列见表13。表13表达shRNA分子的pSilencer3.1H1Hygro载体在5a/zz^1和历/oin酶切位点间插入序列<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>权利要求1、一种猪瘟病毒基因组上序列，利用RNA干扰技术设计合成RNA干扰分子后，这些RNA干扰分子能特异、高效抑制猪瘟病毒增殖从而对猪瘟病毒感染有明显治疗作用AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTAGTGACGGA；AAGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACC。2、权利要求1所述的序列在制备抗猪瘟病毒生物制剂中的应用。3、权利要求1所述的猪瘟病毒基因组上序列制成的生物制剂方法，包括以下步骤按照T7、T3或SP6RNA聚合酶使用方法，合成权利要求1所述序列的RNA千扰分子的正义链和反义链模板DNA和T7、T3或SP6RNA聚合酶结合序列，利用相应的聚合酶体外转录设计合成RNA干扰分子，得到体外转录生成的RNA干扰分子猪瘟治疗生物制剂。4、权利要求1所述的猪瘟病毒基因组上序列制成的生物制剂方法，包括以下步骤按照含HI或U6启动子体外转录载体使用方法，合成针对根据权利要求1所述的猪瘟病毒基因组上序列的能生成shRNA分子的质粒，得到猪瘟治疗生物制剂。全文摘要本发明提供一种特异干扰猪瘟病毒基因组序列，同时还公开了高效治疗猪瘟病毒感染的方法，涉及治疗猪瘟病毒感染的药物，通过设计针对猪瘟病毒不同基因的特异RNA干扰分子的DNA模板序列，利用T7、T3或SP6RNA聚合酶体外转录系统和含H1或U6启动子体外转录质粒表达系统，得到了高效、特异抑制猪瘟病毒的干扰RNA分子，适用于工业化生产。本发明还提供了利用该方法生产的生物制剂，对CSFV的抑制效率高达到95.1-99.0％，在敏感动物体内能明显阻止CSFV的感染，使动物免于发病和死亡。文档编号C12N15/63GK101407809SQ20081005142公开日2009年4月15日申请日期2008年11月14日优先权日2008年11月14日发明者史子学,徐兴然,涂长春申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所