专利名称：基于金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶的方法
技术领域：
本发明涉及基于金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶 的方法，属于分析化学技术领域。
技术背景核酸适配子是针对特定目标分子通过体外筛选出来的功能化DNA或RNA片段，核酸适配子的目标分子可以小到无机物、有机物， 大到蛋白质、细胞(参考文献Ellington, A. D.; Szostak，J.W., In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. iV她re 1990， 346, (6287)， 818-822; Tuerk， C.; Gold, L.， Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Sc/ewce 1990， 249， (4968), 505-510)。核酸适配子对其目 标分子有高的亲和力和特异的识别能力。相对于传统的抗原/抗体间 的识别作用，核酸适配子作为识别元素有易于合成、稳定性好、易于 化学修饰、适用范围广等优点。因而，核酸适配子被研究人员用来测 定这类目标分子。与测定方法比较，比色方法更为简单，无需使用特殊的仪器设备， 因而越来越受到研究人员的青睐。其中，用金纳米粒子作为探针的比 色方法已被用于基于核酸适配子的比色测定中(参考文献Liu, J. W.; Lu， Y" A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. 乂爿m. Ozew. Soc. 2003， 125, (22)， 6642-6643; Liu, J. W.; Lu， Y" Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general senwr design involving aptamers and nanoparticles.C//ew. /W. ￡d加06， 45, (1)， 90-94)。但这类比色方法大多较 为繁琐，需要将巯基功能化的核酸适配子标记在金纳米表面，还需要 将此"核酸适配子/金纳米"从未反应的金纳米或核酸适配子中分离出来。这些操作一方面更为复杂且花费较大，另一方面核酸适配子在 金纳米表面的修饰有可能影响其与目标分子的亲和力。为简化和提高 检测效率，发展无标记的金纳米比色传感器便显得尤为重要。Rothberg研究小组近来发展了一种新型无标记的标记比色方法来 检测DNA(参考文献Li， H. X.; Rothberg, L.， Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. /Voc.胸/. JcW. 5W. 2004， 101, (39), 14036-14039; Li, H. X.; Rothberg, L. J.， Label-free colorimetric detection of specific sequences in genomic DNA amplified by the polymerase chain reaction. / Jm. Chew. Soc, 2004， 126, (35)， 10958-10961)。他们的设计基于单双 链DNA在金纳米表面有着的不同吸附行为。发明内容基于和Rothberg等人研究工作类似的原理，本发明提供了一种 基于金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶的方法。本发明目的是提供基于金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定 凝血酶的方法。该方法可用于凝血酶的灵敏、特异性比色检测，从 0.83纳摩尔每升到167纳摩尔每升浓度范围内对凝血酶检测呈现好的 线性响应，检测限为0.83纳摩尔每升。
图1为利用金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶的 示意图。从图1可知，未结合凝血酶的核酸适配子处于自由伸展状态， 此单链的核酸适配子能够稳定金纳米保护其不被所加入的盐聚集，此 时金纳米为酒红色；相反，结合凝血酶后的核酸适配子呈"四极子/ 双螺旋"结构，无法与金纳米作用，故不能保护盐诱导的金纳米聚集， 此时金纳米为天蓝色。这样，通过金纳米颜色的变化，能够实现凝血 酶的检测。利用金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶的步骤如
下
U)用参考文献方法合成13nm的金纳米探针(参考文献:Gmbar， K. C.; Freeman, R. G.; Hommer， M. B.; Natan， M. J., Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers. 4wa/. C7ze肌1995， 67， (4)， 735-743);
(2) 在含有140 mM的NaCl禾Q 5 mM的KC1的20 mM pH-7.5的三羟甲基氨基甲垸-盐酸缓冲溶液中，配制4.59ioM的核酸 适配子溶液；此核酸适配子的序列为5' AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TG A CT 3 ，；
(3) 将13 nm的金纳米探针溶液和4.59 (iM的核酸适配子溶液 混合；所述的13nm的金纳米探针溶液4.59 的核酸适配子溶液 体积比为20: 3;
(4) 接着，将待测浓度的凝血酶加入至(3)的混合液中，反应 5min;所述的凝血酶溶液13nm的金纳米探针溶液4.59 的核
酸适配子溶液体积比为3: 20: 3;待测凝血酶的浓度范围从0.83纳 摩尔每升到167纳摩尔每升；
(5) 向(4)中的反应液中，加入0.5M氯化钠溶液；加入氯化 钠溶液后，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液 的颜色变化，完成基于金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血 酶的方法；所述的0.5M氯化钠溶液13 nm的金纳米探针溶液体积
比为1: 2。利用本发明的比色方法对凝血酶检测的表征如图2和图3所示。 从图2数据可以看出，本发明提供的方法对于凝血酶有很好的比
色响应；通过金纳米探针溶液的颜色变化，很容易用肉眼进行凝血酵
的比色检测。
从图3数据可以看出，该方法对于凝血酶的检出限为0.83纳摩 尔每升，线性范围是0483纳摩尔每升到167纳摩尔每升。
为考察利用金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶方
法的特异性，按歩骤如下进行了对比实验
(1) 参考文献方法合成13nm的金纳米探针(参考文献Gmbar, K. C.; Freeman, R. G; Hommer， M. B.; Natan, M.丄，Preparation and Ch咖cterization of Au Colloid Monolayers. Jwa/. CTzem. 1995， 67, (4), 735-743);
(2) 在含有140 inMNaCl, 5 mM KC1和20 mM pH=7.5的三羟 甲基氨基屮烷-盐酸缓沐溶液中，配制4.59 核酸适配子溶液；此 核酸适配子的序列为5 AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGACT3,;
(3) 将13 nm的金纳米探针溶液和4.59 核酸适配子溶液混 合；所述的13nm的金纳米探针溶液4.59 核酸适配子溶液体积 比为20: 3;
(4) 接着，将83.3纳摩尔每升的牛血清白蛋白加入至(3)的 渴合液中，反应5min，所述的牛血清白蛋白溶液13nm的金纳米
探针溶液4.59:(iM核酸适配子溶液体积比为3: 20: 3;(5)向(4)中的反应液中，加入0.5M氯化钠溶液；加入氯化 钠溶液后，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液 的颜色变化；所述的0.5M氯化钠溶液13 nm的金纳米探针溶液体 积比为1: 2。
利用本发明的比色方法对于凝血酶检测的表征如图2所示。 从图2数据可以看出，牛血清白蛋白对该金纳米比色方法没有响 应，这证明该方法对凝血酶的比色检测有好的特异性。
本发明的有益效果本发明利用无修饰的金纳米探针，实现了基
于核酸适配子对凝血酶的简单灵敏的比色检测。该方法具有如下优
势l)通过金纳米探针颜色的变化，可以方便地进行蛋白质检测；2) 制备金纳米探针所需原料廉价易得；3)金纳米探针无需进行修饰， 这一方面省去了修饰和分离的操作，另一方面免修饰可以保持核酸适 配子的生物活性；4)利用核酸适配子作为识别元素，原则上可以推广 到其它任何核酸适配子在结合目标分子前后发生了构象变化的"核酸 适配子-目标分子"体系。 附圃说明
图1为利用金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶的示 意图。
图2为利用金纳米探针进行蛋白质比色测定的照片。向30 ^iL4.59 ^tM核酸适配子稳定的200 pL 13 nm的金纳米探针溶液中，加入待测 样品后，再加入100pL0.5M的NaCl的比色结果，从左至右分别为 83.3nM凝血酶、83.3ftM牛血清白蛋白和水。图3为30min内，加入不同浓度凝血酶后，金纳米探针溶液的吸 收比率(A620/A520)随时间变化曲线(A); 30min时，吸收比率 (A620/A520)与凝血酶浓度的关系图(B)。 (A)中，1到6号样品 对应凝血酶浓度依次为0纳摩尔每升、0.833纳摩尔每、8.33纳摩尔 每升、83.3纳摩尔每升和167纳摩尔每升。
具体实施方式
实施例l
利用金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶的步骤如
下
(1) 参考文献方法合成13nm的金纳米探针(参考文献Grabar， K. C.; Freeman, R. G; Hommer， M. B.; Natan, M. J., Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers. Jwa/. C7z缀1995， 67, (4)， 735-743);
(2) 在含有140 mM NaCl， 5 mM KC1和20 mM pH=7.5的三羟 甲基氨基甲烷-盐酸缓沖溶液中，配制4.59 核酸适配子溶液；此 核酸适配子的序列为5, AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGACT3，；
(3) 将200 13 nm的金纳米探针溶液和30 4.59 |aM核酸 适配子溶液混合；
(4) 接着，将30tiL待测浓度的凝血酶加入至(3)的混合液中， 反应5 nrin;待测凝血,的浓度依次为0纳摩尔每升、0.833纳摩尔每、 8.33纳摩尔每升、83.3i纳摩尔每升和167纳摩尔每升；(5)向(4)中的反应液中，加入100pL0.5M氯化钠溶液；加入氯化钠溶液后，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液的颜色变化。实施例2
为考察利用金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶方
法的特异性，按步骤如下进行了对比实验
(1) 参考文献方法合成13nm的金纳米探针(参考文献Gmbar，K. C.; Freeman, R. G.; Hommer， M. B.; Natan， M. J., Preparation andCharacterization of Au Colloid Monolayers.爿wa/. CTie/w. 1995， 67， (4),735-743);
(2) 在含有140 mM NaCl， 5 mM KC1和20 mM pH-7.5的三羟甲基氨基甲垸-盐酸缓冲溶液中，配制4.59 (_iM核酸适配子溶液；此核酸适配子的序列为5' AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGGTGACT3，；
(3) 将200 13 nm的金纳米探针溶液和30 4.59 核酸适配子溶液混合；
(4) 接着，将30^iL浓度为83.3纳摩尔每升的牛血清白蛋白加入至(3)的混合液中，反应5min;
(5) 向(4)中的反应液中，加入100^iL0.5M氯化钠溶液；加入氯化钠溶液后，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液的颜色变化。
从图2数据可以看出，样品有牛血清白蛋白时，金纳米仍然为红色，说明牛血清白蛋白对该金纳米比色方法没有响应，这证明该方法对凝血酶的比色检测有好的特异性。
权利要求
1、基于金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶的方法，其特征在于，步骤和条件如下(1)用参考文献方法合成13nm的金纳米探针(参考文献Grabar，K，C.；Freeman，R.G.；Hommer，M.B.；Natan，M.J.，Preparation andCharacterization of Au Colloid Monolayers.Anal.Chem.1995，67，(4)，735-743)；(2)在含有140mM的NaCl和5mM的KCl的20mMpH＝7.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，配制4.59μM的核酸适配子溶液；此核酸适配子的序列为5’AGT CCG TGG TAG GGCAGG TTG GGG TGA CT 3’；(3)将13nm的金纳米探针溶液和4.59μM的核酸适配子溶液混合；所述的13nm的金纳米探针溶液4.59μM的核酸适配子溶液体积比为20∶3；(4)接着，将待测浓度的凝血酶加入至(3)的混合液中，反应5min；所述的凝血酶溶液13nm的金纳米探针溶液4.59μM的核酸适配子溶液体积比为3∶20∶3；待测凝血酶的浓度范围从0.83纳摩尔每升到167纳摩尔每升；(5)向(4)中的反应液中，加入0.5M氯化钠溶液；加入氯化钠溶液后，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液的颜色变化，完成基于金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶的方法；所述的0.5M氯化钠溶液13nm的金纳米探针溶液体积比为1∶2。
全文摘要
本发明涉及基于基于金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶的方法，属于分析化学技术领域。未结合凝血酶的核酸适配子处于自由伸展状态，此单链的核酸适配子能够稳定金纳米保护其不被所加入的盐聚集，此时金纳米为酒红色；相反，结合凝血酶后的核酸适配子呈“四极子/双螺旋”结构，无法与金纳米作用，故不能保护盐诱导的金纳米聚集，此时金纳米为天蓝色。这样，通过金纳米颜色的变化，能够实现凝血酶的检测。本发明方法对于凝血酶的检出限为0.83纳摩尔每升，线性范围是0纳摩尔每升到167纳摩尔每升。此种比色方法检测凝血酶，选择性高、灵敏度高、操作简单、无需复杂仪器。
文档编号C12Q1/68GK101672770SQ200810051068
公开日2010年3月17日 申请日期2008年8月11日 优先权日2008年8月11日
发明者敬 李, 李冰凌, 汪尔康, 董绍俊, 辉 魏 申请人:中国科学院长春应用化学研究所