专利名称：隐孢子虫属及微小隐孢子虫种特异pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及隐孢子虫病的诊断和检测技术，更确切地说是提供了一种隐孢子虫属 特异性及微小隐孢子虫种特异PCR检测试剂盒及检测方法，属于寄生虫检测技术领域。
背景技术：
隐孢子虫病(Oy/7ftw/wrWtoWs)是由隐孢子虫所引起的一种危害严重的人兽共患 原虫病，可造成哺乳动物尤其是反刍动物以及人的严重腹泻。目前已经命名隐孢子虫 有27种，能感染人的隐孢子虫有多种，其中以微小隐孢子虫的感染最为常见，微小隐 孢子虫宿主范围广泛且危害严重，多感染人、家畜等哺乳动物，因此是隐孢子虫属中 危害最大的隐孢子虫种。
隐孢子虫病的诊断方法主要有病原学诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断三大类。 病学学诊断多通过粪便显微镜检及改良的抗酸染色法检查，此法费时费力且检出率低 下。免疫学诊断有间接血凝试验(IHA)、免疫荧光试验(IFA)、嗨联免疫吸附试验 (ELISA)、单克隆抗体(McAb)等方法，然这些免疫学方法特异性和敏感性也较低。 因此，开发一种特异灵敏的隐孢子虫属及微小隐孢子虫种的检测方法己经是迫在眉睫。
发明内容
本发明提供一种隐孢子虫属及微小隐孢子虫种特异的PCR检测试剂盒，用于隐孢 子虫病及微小隐孢子虫种的鉴别诊断。 本发明还提供了该试剂盒的检测方法。
本发明隐孢子虫属及微小隐孢子虫种特异PCR检测试剂盒，包括以下部分
(1) DNA裂解液含不同浓度的NaCl、 Tris-HCl、 EDTA、 SDS和蛋白酶K的混 合溶液；
其中，浓度配比为NaCl 100mM、 Tris-HCl(pH7.5)20Mm、 EDTA25Mm、 SDS20/。 (w/v)和蛋白酶K0.1ug/lU;
(2) PCR反应液终浓度各100-300uM的4种dNTPs，终浓度各10-100pmo1/ VI1的引物CF、 CR、 HF和HR， 1.5-4.5mM的Mg^浓度；T叫酶按每个PCR反应(20^1)
含2.01)加入，反应液中不含T叫酶；
(3)隐孢子虫属和微小隐孢子虫种特异性引物 属特异性诊断引物CF: 5'-ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3'
CR: 5'-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3' 种特异性诊断引物HF: 5'-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3'
HR: 5'-TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3 (4)阳性对照阳性对照为微小隐孢子虫基因组DNA，比较PCR产物以及监测 PCR操作过程是否正确。
本发明的试剂盒还可以含有琼脂糖(A辟rose)、溴酚蓝点样缓沖液和Taq酶，其浓 度优选为溴化乙锭10iig/iU;溴酚蓝点样缓冲液和Taq酶5U/ul。也还可以含有PCR 反应管。
本发明所述的试剂盒的检测方法，包括以下歩骤
1) 样本的预处理取样本用水混匀过筛，先过60目，再过100目筛，滤液反复 离心沉淀三次，沉淀即为备用样本；
2) 样本DNA的提取
(1) 将上述沉淀转移到1.5ml离心管中，加入lml裂解液，在液氮和65flC水浴 中反复冻融三次；
(2) 将冻融后的样品加入5-6 li 1 (20mg/ml)蛋白酶K,使其终浓度为100" g/ml。 混匀后在65C水浴中浸泡2h;
(3) 用酚:氯仿:异戊醇(24:25:1)进行抽提两次，7000r/min离心十分钟；
3) 、 PCR扩增
(1) 准备待检样品数+2的PCR反应管，管内包括PCR液、Taq酶等，盖紧盖子， 在涡旋器上混匀备用；
(2) 将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好， 置于PCR仪中。PCR条件为95"预变性5min、 94"C变性30s、 6(TC退火40s、 72卩 延伸30s，共30个循环，后72'C延伸10min;
4)、 PCR产物观察
称取琼脂糖，用电泳液混匀后(0.8%-1.0%)在微波炉中加热三分钟。等胶冷却 后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，
如果出现同时存在424bp和223bp扩增条带就证明是微小隐孢子虫感染，如果只有 223bp条带就证明是其它种的隐孢子虫感染。
试验例l
试剂盒的组成
裂解液(NaC1100mM、 Tris-HCl(pH 7.5)20Mrn、 EDTA25Mm、 SDS2% (w/v)和 蛋白酶K0.1ug/iil) 20ml; PCR反应液10管(20ul体系)，其中各自dNTPs的浓度 为250nM、引物HF、HR和CF、CR的终浓度各为0.5pmol/u 1，Mg^终浓度为1.5 mM; 4g琼脂糖；50ul溴化乙锭(20"g/iil); 0.5外溴酚蓝点样缓冲液50nl; 10ulT叫酶 (5U/u 1); 1支微小隐孢子虫基因组DNA阳性对照。
实验例2
试剂盒特异性实验
取羊微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、猪隐孢子虫、人源贾第虫、 犬源贾第虫、鸡艾美尔球虫、鼠艾美尔球虫、弓形虫、毛滴虫等10个样本的DNA为 模板，用建立的扩增体系分别对其进行扩增。
扩增条件为
,950C5min 940C 30s 590C 40s
72。C30s Goto2 30tims 720C lOmin
扩增产物用0.8%的琼脂糖进行电泳分析，在凝胶成像系统上观察结果。
结果显示(见附图2、 3):种特异引物H只在牛和羊微小隐孢子虫样本中得到了 扩增，其它样本均无扩增，扩增条带为424bp，符合种特异检测标准。属特异引物C 分别在微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、猪隐孢子虫样本中都得到了扩 增，扩增条带为223bp，其它样本均无扩增，符合属特异检测标准。
图中，Lanel-10:牛微小隐孢子虫、羊微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、贝氏隐孢 子虫、猪隐孢子虫、人源贾第虫、犬源贾第虫、鸡艾美尔球虫、鼠艾美尔球虫、弓形 虫、毛滴虫。
实验例3
试剂盒敏感性实验
将提取出的总核酸在核酸分析仪上定量，分别将浓度稀释到第个反应体系中的含
量为100ng、 10ng、 lng、 0.1 ng、 0.01 ng、 0.001 ng、 0.0001 ng。反应条件同特异性检 测实施例，同时设阴性对照。产物用0.8%的琼脂糖进行电泳分析，在凝胶成像系统上 观察结果。结果表明H引物的检测阈值为0.0Ing(10pg)， C引物的检测阈值为0.001ng (lpg)，且二重PCR检测的阈值也分别是H(10pg)和C(lpg)，完全符合敏感性检测标 准。
见附图3、 4、 5、 6: Lanel-7:模板浓度梯度设为100ng、 10ng、 1 ng、 0.1 ng、 0.01 ng、 0.001 ng、 0.0001 ng。由图可见H和C引物最低检测阈值分别为H(10pg)和 C(lpg)。
实验例4
试剂盒的稳定性和重复性实验
阳性模板，PCR反应液，EX T叫酶在-20。C条件下贮存，裂解液、溴酚蓝等其它 物品4QC保存即可。当贮存时间为30天、60天、100天、150天、200天时取出各组 分，用已知PCR阳性的样品检测试剂盒稳定性。另外，15份PCR阳性样本用此试剂 盒重复试验3次，15份PCR阴性样本同样重复3次，扩增条件如前所述。结果表明在 以上各时段取出的组分在已知PCR阳性样品和15份PCR阳性样本均得到了两条明亮 特异的目的带，而空白对照和15份阴性样品均无任何扩增带，故此试剂盒稳定性和重 复性良好。
实施例5
试剂盒的保质期试验
将分别在4"和-2(TC贮存1个月、3个月、5个月、7个月和IO个月的试剂盒取 出并对已知阳性样品进行检测。扩增及检查方法同前，结果表明在4C和-20"条件下 保存达10月之久的试剂盒依然能扩增出清晰的目的条带，无杂带。
本发明的积极效果在于利用PCR的特异性检测方法，根据分析属特异及种特异 的诊断序列设计属和种特异引物，通过优化扩增条件來提高其敏感性，电泳分析直接 观察扩增结果。本发明试剂盒设计严谨，简单易操作，灵敏性强，特异性强，能同时 鉴定属特异和种特异隐孢子虫感染，结果判定准确客观。
图l: 二重PCR引物(H和C)浓度配比摸索； 图2、 3: 二引物特异性摸索；
图4、 5、 6: 二引物各自及二重PCR体系敏感性摸索；
具体实施例方式
为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而 非对本发明的任何形式的限制。
实施例l
隐孢子虫属特异诊断序列18SrRNA基因(此基因为隐孢子虫的各个种所共有且 是种间基因变异最小的一段基因)序列中保守的部分，在NCBI中比对为多个隐孢子 虫种共有，且同源性大于98%,符合属特异检测标准。
attggaggttgttccttactccttcagcaccttatgagaaatcaaagtctttgggttctagggggagtat ggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttg actcaacacgggaaaactcaccaggtccagacataggaaggattgacagattgatagctccttcttgatt ctatgggcggct
微小隐孢子虫种特异诊断序列 一段指状Ul核内小分子核糖核蛋白基因，NCBI 中比对仅为人源和微小隐孢子虫所共有，同源性均为100%，符合种特异检测研究标准。 taagaagccacc幼g幼ggcggaaggcacaactataatttaagaaagttgttgaaaagtgaaaactatagggaactacag aagaaaaaagatgaggaagaggtccgaaaggagtttatgaagttacaaggggtcgagcaaac加taatcgtgaaaagaaaa gaatcaaactgatagataaggaagtoagatcaggaagttctaccacttttggagataatgttttcacagccaattatacctttgatg attcaaagaatatttttgaaaaaaaagatcataatgaa^ccatgacaaaacgaacgaaatgggaattattgggaaatgggaag aagttaaagagtctgaatctgcctttttaggaaatattaccttagaacaacaagatcatactcaaatcccgaacccatttaag cctattga 实施例2
根据实施例1的隐孢子虫属特异和种特异诊断序列设计特异性诊断引物如下
属特异性诊断引物CF: 5' -ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3'
CR: 5， -AGCCGCCCATAGMTCMGAA-3，
种特异性诊断引物HF: 5'-TAAGAAGCCACCAAGMGGCG-3'
HR: 5' -TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3
以上两种引物在同一体系中(二重PCR)能同时扩增出种特异和属特异的诊断基 因片断，目的条带明亮，无非特异性杂带。实现同时检测隐孢子虫属和微小隐子虫的 目的。
实施例3
隐孢子虫属和微小隐孢子虫PCR检测试剂盒，组成结构如下
(1) DNA裂解液含不同浓度的NaCl、 Tris-HCl、 EDTA、 SDS和蛋白酶K的混 合溶液。各浓度配比为NaCl 100mM、 Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、 EDTA25Mm、 SDS2%
(w/v)和蛋白酶K 0.1lig/iU。裂解液的作用是将卵囊裂解并消化其中的蛋白质，释 放出基因组DNA。
(2) PCR反应液终浓度各100-300 u M的4种dNTPs,终浓度各10-100pmo1/ "1的弓l物CF、 CR、 HF和HR, 1.54.5mM的Mg^浓度。T叫酶按每个PCR反应(20 111)含2.011加入，反应液中不含T叫酶。
(3) 隐孢子虫属和微小隐孢子虫种特异性引物
(4) 阳性对照本发明的试剂盒所用阳性对照为微小隐孢子虫基因组DNA,其 作用是比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确。
此外，本发明的试剂盒还可以含有琼脂糖(Agarose)、溴酚蓝点样缓沖液和T叫 酶，其浓度优选为溴化乙锭10lig/ul;溴酚蓝点样缓冲液和Taq酶5U/Ul。还可以含 有PCR反应管。
实施例4
本发明试剂盒PCR反应条件的优化过程为
二对引物各自浓度的优化设置引物在体系的终浓度梯度为0.5ixM、 1UM、 1.5 ii M、 2uM、 2.5uM、 3uM,用此区间的引物尝试都得到相应的扩增，其中当引物量为 lOpmol (引物的贮存浓度为20pmol/u 1,取0. 5u 1)终浓度为0. 5 pmol/u 1时效果 最佳。
二对引物各自退火温度的优化设置引物的退火温度分别为47"C、 49"C、 52"C、 54"C、 56"C、 59。C、 61°C、 63°C,在梯度PCR仪上进行扩增，结果在59"C时两引物都有 最优化的扩增。
二对引物各自dNTPs浓度的优化设置每种dNTPs (each)浓度梯度为50uM、 100ixM、 250u M、 350 ii M、 400 uM。，在这个浓度段里都得到不错的扩增，其中在浓度 为250uM (each)时两引物均有最佳扩增。
二对引物各自Mg"浓度的优化设置Mg"终浓度梯度为lnM、 1.5nM、 2 nM、 3 nM、 4 nM、 5 nM,其中浓度在1. 5 mM时两引物均有最佳扩增。
两引物最佳酶浓度的摸索设置酶浓度梯度为0.5U、 1U、 2U、 3U、 4U，两引物 在此浓度段时均有不错的扩增，但在2U时两引物均得到最优化的扩增。
二重PCR体系条件的摸索二重PCR体系的Mg"终浓度为3mM, dNTPs(each)的终 浓度为500uM，酶浓度为2U,退火温度为59"C,弓|物C的浓度为0. 5 pmol/" 1,弓l物 H的终浓度为0. 5pmol/ul。
见附图1: Lanel-6: H和C引物各浓度配比梯度为:0.5/0.5uM、 0.6/0.5uM、 0.7/0.5uM、 0.8/0.5wM、 0.9/0.5uM、 1/0.5uM。由上图可见，两引物浓度配比为
0、 5/0. 5 ii M时就能发挥最佳扩增效果。
实施例5
分别采集长春地区的35份牛粪样和50份羊粪样，用经典的改良抗酸染色方法作 对比结合二重PCR方法对样品进行检测。
(一) 改良抗酸染色法
每个粪样取20g,加5倍水用玻璃棒搅匀，先用60目尼龙筛过滤，再用100目尼 龙筛过滤，将滤液涂片，自然干燥或在酒精灯上干燥，将适量复红染液覆盖在固定好 的滤液上面，7-8分钟后流水冲洗。滴加1096硫酸覆盖在复红着色的滤液上面，5-6分 钟后流水冲洗。滴加孔雀绿于样品上面，2min后水洗，自然干燥后10X100倍油镜镜 检。
附抗酸染色染液配制方法
1.复红染液碱性复红4g, 95%酒精20ml,石炭酸8ml,蒸馏水lOOml。 2.10%硫酸 9896浓硫酸10ml，蒸馏水90ml。 3.孔雀绿复染0.2g孔雀绿，蒸馏水100ml。
(二) PCR检测
1、 样本的预处理
取样本20g用水混匀过筛，先过60目，再过100目筛，滤液用水平离心机3000r/min
反复离心沉淀三次，沉淀即为备用样本。
2、 样本DNA的提取
(1) 将上述沉淀转移到1.5ml离心管中，加入lml裂解液，在液氮和65iC水浴中反 复冻融三次。
(2) 将冻融后的样品加入5-6ul (20rag/ml)蛋白酶K，使其终浓度为100ug/ml。 混匀后在651C水浴中浸泡2h。
(3) 用酚:氯仿:异戊醇(24:25:1)进行抽提两次，7000r/rain离心十分钟。
(4) 将上面的水相小心的吸取到灭菌的EP管中，注意不要吸取中层变性的蛋白层。
(5) 在水相中加入3M醋酸钠(PH5.2) 60-70ul，再加入2倍体积的冷乙醇在-20。C 冰箱中过夜沉淀。
(6) 次日，将沉淀完全的样品在4"C冷冻离心机中离心30rain，弃上清后再用75 酒 精洗涤一遍。
(7) 弃酒精后在冷冻干燥机中冻干，用TE液或是灭菌4蒸水溶解保存。
3、 PCR扩增
(1) 按待检样品数+2的PCR反应管取PCR反应液、Taq酶等，混于一管中，建立20 "1体系，盖紧盖子，在涡旋器上混匀备用。
(2) 取阴性和阳性对照各liU分别加入标记好的管中，然后取样品各lixl依次加 入并标记好，置于PCR仪中。
(3) PCR扩增条件为
<formula>formula see original document page 11</formula>
4、 PCR产物观察
称取琼脂糖，配制0.挑的琼脂糖凝胶，按0. 5 ii g/ml加入E. B.，用电泳液混匀后 (0.8%_1.0%)在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，IOOV电压下 电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现同时存在424bp和223bp扩增 条带就证明是微小隐孢子虫感染，如果只有223bp条带就证明是其它种的隐孢子虫感 染。
(三)、改良抗酸染色和二重PCR检测结果
经改良抗酸染色和二重PCR检测发现35份牛粪样中改良抗酸染色法检出3例微小 隐孢子虫和18例安氏隐孢子虫，二重PCR法检出4例微小隐孢子虫和20例安氏隐孢 子虫，50份羊粪样中改良抗酸染色法检出6例微小隐孢子虫和0例安氏隐孢子虫，二 重PCR法检出8例微小隐孢子虫和0例安氏隐孢子虫。
权利要求
1、一种隐孢子虫属及微小隐孢子虫种特异PCR检测试剂盒，包括以下部分(1)DNA裂解液含不同浓度的NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；各浓度配比为NaCl 100mM、Tris-HCl(pH7.5)20Mm、EDTA25 Mm、SDS 2％(w/v)和蛋白酶K 0.1μg/μl；(2)PCR反应液终浓度各100-300μM的4种dNTPs，终浓度各0.5-3pmol/μl的引物CF、CR、HF和HR，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；Taq酶按每个PCR反应(20μl)含2.0U加入，反应液中不含Taq酶；(3)隐孢子虫属和微小隐孢子虫种特异性引物属特异性诊断引物CF5’-ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3’ CR5’-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3’种特异性诊断引物HF5′-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3′ HR5′-TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3(4)阳性对照本发明的试剂盒所用阳性对照为微小隐孢子虫基因组DNA，其作用是比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其中PCR反应液中4种dNTPs 的终浓度为各250uM，引物HF、 HR和CF、 CR和终浓度各为0.5pmo1/ li 1， Mg2+终浓度为1.5mM。
3、 权利要求1所述的试剂盒的检测方法，包括以下步骤 l)样本的预处理取样本用水混匀过筛，先过60目，再过100目筛， 滤液反复离心沉淀三次，沉淀即为备用样本；2) 样本DNA的提取(1) 将上述沉淀转移到1.5ml离心管中，加入lml裂解液，在液氮 和65'C水浴中反复冻融三次；(2) 将冻融后的样品加入5-6iU (20mg/ml)蛋白酶K，使其终浓度 为100ug/ml。混匀后在65'C水浴中浸泡2h;(3) 用酚:氯仿:异戊醇(24:25:1)进行抽提两次，7000r/min离心十分钟；3) 、 PCR扩增(1) 准备待检样品数+2的PCR反应管，管内包括PCR液、Taq酶 等，盖紧盖子，在涡旋器上混匀备用；(2) 将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加 入并标记好，置于PCR仪中；PCR条件为95'C预变性5min、 94'C变性 30s、 60'C退火40s、 72-C延伸30s,从第二步开始共设30个循环，然后 72QC延伸10min;4) 、 PCR产物观察称取琼脂糖，用电泳液混匀后(0.8%-1.0%)在微波炉中加热三分钟。 等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外 灯下观察实验结果，如果出现同时存在424bp和223bp扩增条带就证明是 微小隐孢子虫感染，如果只有223bp条带就证明是其它种的隐孢子虫感 染。
全文摘要
本发明提供一种隐孢子虫属及微小隐孢子虫种特异PCR检测试剂盒，包括DNA裂解液、PCR反应液、隐孢子虫属和微小隐孢子虫种特异性引物及阳性对照微小隐孢子虫基因组DNA，利用PCR的特异性检测方法，根据分析属特异及种特异的诊断序列设计属和种特异引物，通过优化扩增条件来提高其敏感性，电泳分析直接观察扩增结果。本发明试剂盒设计严谨，简单易操作，灵敏性高，特异性强，能同时鉴定属特异和种特异隐孢子虫感染，结果判定准确客观。
文档编号C12Q1/04GK101353690SQ20081005095
公开日2009年1月28日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者宫鹏涛, 张国才, 张西臣, 巍 李, 李建华, 李淑红, 举 杨 申请人:吉林大学