专利名称：抗aFGF-scFv在制备抗肿瘤药物中的应用及其制备方法
技术领域：
本发明公开了抗aFGF-scFv在制备抗肿瘤药物中的应用，同时还提供了其制备方 法，属于生物制药技术领域。
背景技术：
本发明涉及的"抗aFGF-scFv"是申请人的另一发明专利(ZL200510119045. 1)《抗 人酸性成纤维细胞生长因子的单链抗体基因》的表达产物。本案申请公开了该产物在 抗肿瘤方面的医用用途和制备方法。
发明内容
本发明公开了抗aFGF-scFv在制备抗肿瘤药物中的用途，用于制备抗肿瘤的药物。 本发明还提供了抗aFGF-scFv的制备方法，分别在大肠杆菌，植物和酵母中实现 了表达，适用于工业化生产。
本发明的制备方法具体步骤如下
根据scFv的序列设计引物，进行PCR扩增，对PCR产物回收并进行双酶切反应， 在T4连接酶催化下将scFv片段克隆入表达载体，将表达载体转化到目的细胞，制备 出抗aFGF-scFv。所述的目的细胞包括大肠杆菌或植物、酵母细胞。
以下药理实验证明本发明具有抗肿瘤的药理活性果 实验例1抗酸性成纤维细胞生长因子单链抗体的应用
1哺乳动物细胞表达载体pEGFPCl-scFv的构建
由测序得到的轻链和重链的序歹IJ，设计了一对扩增V,.的引物VL-forwards-reverse 和一对扩增V 的引物V,rforward, Vfreverse。根据Overlap PCR的原理，引物 V,-reverse和Vfforward具有一段互补的序列。在W和V'.分别扩增延长后，V,的3' 端和Vn的5'端即具有一段互补的碱基序列，在退火的时候，V,和^可以通过这一段 序列配对结合，然后延伸，扩增出V,-linker-V 片段。Linker的序列为 GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGA GGTGGCTCTGGCGGAGGTGGCTCT,共45 bp,编码的氨基酸序列 为(Gly4Ser):!0(1) 根据Vh， V,基因测序结果，用软件Primer5.0设计了
扩增VL基因的一对引物
V,-forward: 5' CCG GAA TTC GAC ATC CAG ATG ACC CAG-3'， 加入餘i II酶切位点。
V「reverse: 5' AGA GCC ACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT-3'
扩增Vn基因的一对引物
VH-forward: 5' GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGA GGT GGC TCT CAG GTG AAG CTG CAG C-3'
VH-reverse: 5' CCC AAG CTT CTA TGA GGA GAC GGT GAC-3'， 加入ffi/7" III酶切位点。
(2) VH， V,基因片段分别扩增。在两个PCR小管中分别加入
PCR for W扩增
One Shot LA PCR Mix 25 W
Vi-forward 1 W
Vi.-reverse 1 1^1
质粒T-W X W (10 ng)
ddH20 up to 50
PCR for VH扩增 One Shot U\ PCR Mix25 (4 Vh-forward 1 "1
Vii-reverse 1 Ml
质粒T-Vn X (10 ng)
d孤O up to 50 Pi
PCR参数为95。C加热5min，然后94 °C 1 min， 60 °C 1 min， 72 °C 1
min，
it
30个循环。最后在72 。C延伸2 min。预期V,.延伸后的长度为375 bp， V,'延伸后的长 度为411 bp。
(3) 用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。方法同上。
(4) V,.和V"基因通过Linker配对连接成scFv基因。在新PCR管中加入
One Shot LA PCR Mix 25 W_
V,扩增回收片段 X(50 ng)
Vn扩增回收片段 X W (50 ng)
ddH20 up to 48 WPCR参数为95卩加热5 min,然后94 'C 70 s， 55 °C 1 min, 72 °C 1 min， 共7个循环。最后在72 'C延伸2 min。
(5) 往第4步的PCR管中加入引物V,-forward和引物VH-reverse各1W，再次进行 PCR，参数为95。C加热5min，然后94°C70 s， 60°C 1 min， 72°C 1 min，共30个循 环。最后在72'C延伸2 min。预期目的片段的长度为741 bp。
(6) PCR产物电泳，回收。方法同上。用5《7 II, III双酶切，再次回收。
(7) 连接和转化。将双酶切后的目的片段连接到经5g7 II,佑'/k/III双酶切的载体 pEGFPCl上，反应体系为
10XT4 DNA Ligase Buffer 2.5 rt T4 DNA Ligase 1 W
pET28a载体 XW(0.03pmo1)
scFv回收片段 X W (0. 3 pmol)
ddH20 up to 25 Pl
16'C下过夜连接。将连接产物转化Aco"'DH5a感受态细胞，涂布在具有卡那霉 素抗性的平板上。
(8)阳性克隆鉴定。从转化平板上挑取单克隆摇菌，以碱性裂解法小量制备质粒。用 Zfe7 11和历/^/ni双酶切鉴定。获得片段长度为741 bp的阳性重组质粒命名为 pEGFPCl-scFv,并送上海生工测序。 2免疫荧光染色
(1) 把生长良好的H印G2和NLT细胞稀释到5X10'个/ml，每孔lml，铺到放有盖玻 片的12孔板中，温箱中培养12h (盖玻片用3y。冰醋酸浸泡30min后冲洗，酒精棉擦 净后，高压灭菌)。
(2) 用Lipfectamine 2000转染试剂把pEGFPCl-scFv和pEGFPCl质粒分别转入H印G2 和NLT细胞，具体方法参考说明书。
(3) 转染24 h后，在荧光显微镜下观察是否有绿色荧光的表达，如果有说明转染成功。
(4) 终止转染细胞的培养，吸掉培养基，用PBS洗涤三次，每次5min。
(5) 用预冷的4 。/。多聚甲醛室温固定10 min，然后用PBS洗涤三次，每次5 nun。
(6) 用0. 2% Triton的PBS室温打孔处理10 min，然后用PBS洗涤三次，每次5 min。(7) 用2% BSA室温封闭1 h。(8) 用含2% BSA的raS，分别稀释鼠抗人aFGF抗体和鼠抗vinculin抗体到相应浓度 (l:2000和1:1000)，室温孵育lh，用PBST洗涤三次，每次5 min。(9) 用含2。/。BSA的PBS或PBST，稀释荧光标记的二抗到相应浓度(1:1000)，室温孵 育30 min，用PBST洗涤三次，每次5min。(10) 去离子水洗两遍，每次5min。(11) 用90%甘油(PBS稀释)封片于载玻片上，将多余甘油用滤纸吸净后，用指甲油 固定片子。(12) 荧光显微镜观察，拍照。 3统计处理为了研究转染后细胞形态学改变是否具有普遍性，用pEGFPC-l和pEGFPC-1-scFv 分别转染H印G2细胞，经固定，洗涤等处理后，显微镜下随机选取1000个细胞进行统 计，计算细胞形态改变百分率，实验重复三次，取三次的平均值。 4流式细胞术分析细胞周期(1) 接种将293T细胞以107ml密度接种6孔板，每孔2 ml;(2) 转染分别用纳米材料把pEGFPCl-scFv和pEGFPCl质粒分别转入293T细胞(纳米材料质粒二20: 1)，培养24 h;(3) 消化用0.25%胰酶进行消化，离心(2000 rpm， 5 min);(4) 洗涤用PBS液洗一次，弃上清；(5) 固定加入一20度预冷的70 %酒精，冰浴30 min;(6) 洗涤用PBS液洗一次，弃上清；(7) 去除RNA:加100 ul 5 mg/ml RNA酶溶液，37度保温30 min;(8) 洗涤用PBS液洗一次，弃上清；(9) 染色加PI染液(500 lVml)避光染色30 min;(10) 分析用流式细胞仪选择GFP阳性的细胞进行细胞周期分析。结果本发明将anti-aFGF-scFv基因插入哺乳动物细胞表达载体，并转染到细胞 中，scFv有效结合细胞内源行抗原aFGF (图1)， scFv在细胞中的表达可以导致细胞 铺展面积减少(图2， 3)，并且scFv导致细胞周期Gl期阻滞(图4， 5)。实验例2 scFv基因治疗有效抑制荷瘤鼠肿瘤生长荷瘤鼠动物模型的建立1 x 106个Lewis肺瘤细胞于C57小鼠后背侧部皮下进行 注射,大约十天后可以看到比较明显的肿瘤块。基因治疗程序分三组,包括PBS组， pEGFPCl组和pEGFPC卜scFv组，治疗前测量肿瘤的长径和短径。电激基因传递法基因 治疗，每两天治疗一次，共三次。治疗结束后，处死小鼠，剥取肿瘤块，将肿瘤块进 行冰冻切片进行服染色，观察肿瘤组织形态学。可以看出表达对照载体其肿瘤细胞生 长铺展良好，而表达scFv的肿瘤细胞变圆，细胞间隙增大(图6)，可能抑制了肿瘤 细胞的增殖，或者减低了肿瘤细胞的侵袭能力。本发明表达产物分子量约为30 kDa用Ni-柱进行纯化，得到了高纯度的scFv蛋 白。在大肠杆菌中成功的表达了 anti-aFGF-scFv，占菌体总蛋白的30%表达产物以包 涵体存在，用尿素溶解后，再进行复性。经间接ELISA检测，表明通过基因工程手段 获得的scFv仍能和aFGF抗原结合。进一步，还在烟草中成功地表达了抗人aFGF的 scFv，通过构建植物病毒表达载体，在烟草中瞬时表达抗人酸性成纤维生长因子scFv; 免疫印迹技术证明了 scFv在烟草中的表达，并通过ELISA证明表达场产物具有结合抗 原的能力。另外，本发明建立了转scFv基因番茄，实现了 scFv在番茄中的稳定表达。此外， 还建立了 scFv的酵母表达体系，实现了 scFv在酵母中的表达。本发明的积极效果在于构建GFP-scFv哺乳动物细胞表达载体，在培养的肿瘤细 胞内，抗aFGF-scFv与细胞内源性aFGF分布具有很好的一致性，scFv的过表达导致 细胞变小、变圆，使细胞生长阻滞在G1期，荷瘤鼠基因治疗表明scFv具有良好的抑 制肿瘤细胞增殖的作用，表明抗aFGF-scFv具有抑制肿瘤细胞生长的作用，可以成为 肿瘤治疗的新的靶点，成为一个新的基因工程药物。
图1.内源性aFGF和scFv在细胞内的分布图2.表达scFv细胞表型变化图3.表达scFv细胞表型变化图4， 5.表达scFv导致细胞Gl期阻滞图6.荷瘤鼠scFv基因治疗图7, 8. scFv基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化图9.表达产物活性分析图10， 11， 12， 13， 14. scFv在烟草中的表达及活性分析 图15， 16. scFv转基因番茄组织培养及PCR检测具体实施方式
为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而 非对本发明的任何形式的限制。实施例l scFv基因在大肠杆菌中的表达，纯化，复性和活性研究1构建pET28a-scFv表达载体(1) PCR扩增scFv基因片段根据scFv的序列设计一对引物(Primer F和Priraer R)，分别引入￡bo/ I和历W III酶切位点。以质粒pEGFPCl-scFv为模板，经PCR扩增出scFv片段。 PCR反应体系如下(50Premix-Taq 25 " 1Primer F 1 u 1 (20幽)Primer R 1 W 1 (20幽)pEGFPCl-scFv 1 U1 (10 ng)DMS0 5 y 1cid貼 17 y 1PCR反应参数95 。C加热5 min， 然后94 °C 1 min， 60 °C 1 min， 72 °C 1 min， 30个循环。最后在72 。C延伸5 min，预期目的片段的长度为741 bp。(2) PCR产物电泳，并对目的片段进行回收，回收方法参考PCR产物凝胶回收试剂盒。(3) 用5W n和历/^/in对回收产物和pET28a空载体分别进行双酶切反应，并分别 进行回收。(4) 连接和转化。将双酶切后的目的片段连接到经I和III双酶切的载体 pET28a上，反应体系如下(25 W):10XT4 DNA Ligase Buffer 2.5 PlT4 DNA Ligase 1 WpET28a酶切产物 2 W (50 ng)scFv酶切产物 10 W (100 ng)ddH20 9.5 W
16'C过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，涂布在含有卡那霉 素抗性的LB平板上进行筛选。
(5)阳性克隆鉴定。从转化平板上挑取单克隆摇菌，以碱性裂解法小量制备质粒，用 I和历力"III双酶切鉴定。获得插入片段长度为723 bp的阳性重组质粒命名为 pET28a-scFv，并送上海生工测序。
2 scFv基因在大肠杆菌中的表达
(1) 将质粒pET28a-scFv转化到大肠杆菌￡ BL21 (DE3)。从平板上挑取单菌落 摇菌过夜。
(2) 第二天，取50W过夜菌液加入到5ml新鲜LB培养基中，37。C培养2 3小时后 直至ODe。。值到达0. 6 1. 0，取出1 ml菌液离心，加入200 W蛋白上样缓冲液，振荡 溶解菌体，-20 。C保存，用于SDS-PAGE分析。
(3) 在剩余培养基中加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mM， 37i:继续培养。每隔1小时 取出1 ml菌液，处理方法同上。
(4) 所有样品进行SDS-PAGE分析。
3 scFv蛋白的纯化
His纯化系统是利用His融合蛋白的6、 8或10个连续的组氨酸残基与固定的二 价Ni"通过亲和吸附，通过咪唑或轻微降低pH洗脱的原理来进行纯化。我们使用的 pET28a载体表达的scFv蛋白是一种His融合蛋白，能使用His纯化系统对目的蛋白 进行纯化。
(1) 将含质粒pET28a-scFv的大肠杆菌￡ co7i BL21 (DE3)划平板。从平板上挑取单 菌落摇菌过夜。
(2) 第二天，取2ml过夜菌液加入到200 ml新鲜LB培养基中，37"培养2 3小时 后直至OD謂值到达0. 6 1. 0，加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mM， 37。C继续培养3小 时
(3) 4500 rpm离心10 min收集菌体。用TE缓冲液(pH7. 4)洗涤菌体两次。
(4) 按100 mg菌体加入1 ml裂解液，冰上放置30 min。
(5) 将菌液放在冰上进行超声破菌功率400 w，超声5秒，间隔5秒，共50次。 在此过程中要避免产生气泡。(6) 4 °C， 10000 g离心10 min，用TE缓冲液洗涤沉淀两次。
(7) 用4M盐酸胍溶液溶解沉淀。若是不溶，可以再次超声。4 。C, 10000 g离心10 min，保留上层的澄清溶液。
(8) 取1 ml 50% Ni-腦His-Bind匀奖和4 ml Ni-NTA Bind Buffer (50 mM NaH2P04， NaCl 300 mM, 10 mM imidazole, pH8. 0)混合，静止，去掉上清。1ml介质大约可以 结合5-10mg His-蛋白质。
(9) 将包涵体蛋白溶解液与Ni-NTA His-Bind匀浆混合，4 °C，摇混1小时。
(10) 将蛋白和介质混合物上柱，打开下面的开关，让液体流出。
(11) 用2X4ml Wash Buffer (50 mM NaH2P04， NaCl 300raM, 20raM imidazole' pH8.0)， 冲洗介质两次。
(12) 用4X0. 5ml Elute Buffer (50 mM NaH^C^, NaCl 300mM， 250mM imidazole, p朋.O)，冲洗，分别收集在4个小管中，用于SDS-PAGE分析。
4 scFv蛋白的复性
(1) 每50mg scFv包涵体加入lml变性剂(4M盐酸胍),充分溶解。4°C，廳0g离 心10min，保留上层的澄清溶液。
(2) 将scFv蛋白变性溶液缓慢加入到复性液(Tris-HCI 50mM， GSH 2mM， GSSH 0. 5raM， 尿素1.5M， NaCl 200mM， L-精氨酸0.3M，甘油5%， pH8.0)中直至终浓度为 50Hg/mri00l^g/ml，同时缓慢搅动。然后4'C放置24小时。
(3) 4'C用PBS溶液透析，然后PEG20000浓缩。
(4) 浓縮液在4。C下，18000rpm离心20min。取上清保存。
5 scFv蛋白的活性研究
用ELISA法检测复性后的scFv蛋白是否具有和aFGF结合的活性。共设立了三组 阴性对照。
方法如下
(1) 以包被缓冲液(50 mM pH 9. 6碳酸盐缓冲液Na2CO:11. 59 g/L， NaHCO:i 2. 93 g/L) 稀释aFGF蛋白抗原至终浓度为10 u g/ml，以每孔100 W的量包被96孔酶标板，4 °C 下过夜。
(2) 第2天弃掉包被缓冲液，用洗涤缓冲液PBST (pH7. 4磷酸盐缓冲液NaCl 8 g/L， KC1 0. 2 g/L， KH2P04 0. 2 g/L， Na異.12H20 2. 9 g/L， Tween 20 0. 05%)充分洗涤3次。每孔加入100 W封闭液(10% W/V脱脂奶粉-PBST), 37。C封闭1小时。(3) 用PBST溶液充分洗涤3次，加入倍比稀释的scFv蛋白。37 。C反应1小时。(4) 用PBST充分洗涤3次，每孔加入100 W 5000倍稀释的抗scFv多克隆抗体。37 'C反应1小时。(5) 用TOST充分洗涤3次，每孔加入100 W 8000倍稀释的冊P-山羊抗小鼠IgG。 37'C反应1小时。(6) 用PBST充分洗涤后，每孔加IOO W底物工作液(pH5.0磷酸一柠檬酸缓冲液 19. 2g/L柠檬酸6 ml， 28. 94 g/L Na臭.12H20 13 ml, 10 mg OPD。用前加入30% H202 37. 5 14) ， 37'C反应15分钟。(7) 每孔加入50 W 2M硫酸终止反应，492 nm测OD值。结果抗aFGF-scFv在大肠杆菌中成功地实现了表达，分子量约为30 KD (图7)， 用Ni-NTA介质对scFv蛋白进行了纯化(图8)，变性，复性后得到了有活性的抗 aFGF-scFv蛋白(图9)。 实施例2 scFv基因在烟草中的表达 1 p35S-30B-scFv表达体系构建 (1) scFv片段的扩增及回收根据质粒pET-28a-scFv中scFv序列设计一对引物(引物F和引物R)，经PCR扩 增出的scFv片段。引物由上海生工公司合成。 PCR反应体系(25u 1):premix-taq 12.5 y 1F Primer 1 u 1R Primer 1 y 1pET-28a-scFv 1 w 1ddH20 9 . 5 ti 1PCR参数94°C 5 min， 94 °C 50 see, 54 °C 30 sec， 72 °C lmin共30个循环； 72 °C 5 min。将PCR反应产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，EB染色后，在紫外光下将目 的条带迅速切下，放于E卯endorf管中。用上海生工的Unit — lO柱式DNA胶回收试剂 盒回收扩增片段。(2) pGEM-T载体的连接
将scFv片段回收产物连接到T载体上，提取质粒，进行Pac I ， J力o I双酶切。获 得具有粘性末端的目的片段。
(3) p35S-30B载体的酶切制备 对获得的质粒进行化c I ， J力o I双酶切。 反应体系(40
NEB buffer 4 BSA
p35S-30B
勘I
dd H20
4 ul 1 yl 20 p 1
1 ul 1 ul 13 ul
将反应体系置于37 'C温箱中反应6个小时。电泳后回收载体片段用于连接反应。 (4) scFv基因片段与p35S-30B载体的连接，转化及鉴定 以DNA片段摩尔数载体摩尔数二3:1的比例进行连接。 连接体系
L Ligase Buffer 1 u 1
p35S-30B plasmid 4 w 1 (100 ng)
scFv 4 u 1 (150 ng)
T4 Ligase 1 n 1
将以上连接体系置于16 'C水浴中连接过夜。次R将连接反应产物转入大肠杆菌 JM109感受态细胞中后，涂布到含卡那霉素(50mg/U的LB平板上。37'C过夜培养。 通过菌落PCR，酶切及scFv序列测定来鉴定阳性克隆。 2烟草的侵染
利用冻融法将质粒p35S-30B-scFv， p35S-30B分别转入农杆菌菌株EHA105。具体 操作如下在200 mL的EHA105感受态细胞中加入2 mg重组质粒DNA，冰浴5 min， 然后转至液氮中冷冻8 min，迅速于37'C水浴中温育5 min后，加入800 mL LB液体 培养基，28°C、 250 rpm预表达培养4 h 5 h，然后涂布在含有卡那霉素、利福平的 LB平板上进行筛选，28 。C培育24 h 48 h后可出现菌落。
12挑取经转化和鉴定的农杆菌EHA105单菌落，接种于5 ml含有50 mg /L卡那霉 素，和50 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 "C过夜培养。次日，按照1: 50的比 例将1 ml的菌液加入50 ml的含有上述抗生素的LB液体培养基中，并加入乙酰丁香 酮至终浓度20 uM和MES至终浓度10 mM。 28。C过夜培养。测定菌液的0" 值，选 择0De。。值范围在0.8-1.0的菌液进行下一步操作。于常温下4000 rpm， 10分钟离心 收集菌体，菌体沉淀用含有终浓度100 ixM乙酰丁香酮(AS)和终浓度IO mM氨基乙 黄酸(MES)的等体积无菌水溶液重悬，室温放置。
以生长期为40天(五叶期或六叶期)的烟草幼苗A 6朋Ws肌's/7s为材料进行侵 染。侵染时，首先用注射器针头在叶片背面主叶脉两侧各轻划一小伤痕，接着用除去 针头的注射器将菌液从伤处注入叶片。为了利于农杆菌中T-DNA的转移，在侵染后的 一天内，将被侵染烟草置于24匸以下放置，之后转移至正常条件培养。 3 Western blot检测scFv在烟草中的表达
将洁净的玻璃板安装好，确定所需凝胶溶液体积。依次配制合适体积的15%的分 离胶(s印arating gel)和5%的积层胶(stacking gel)。随后上样进行蛋白质电泳。当
前沿指示剂跑到胶底时，停止。
将下层胶完整地取下，准备进行转膜。总蛋白从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸 纤维素膜上的方法简述如下将胶置于转移缓冲液中浸泡15分钟(对于0. 75mm厚度的 凝胶)，同时转移装置中的海绵也置于转移缓冲液中浸泡剪8块Whatman3MM滤纸和 一块硝酸纤维素膜，其大小应与SDS-凝胶的大小相同(以防转移过程中短路，另外， 凡接触到胶、滤纸或膜的操作，为防污染均应戴手套)；将剪好的滤纸和纤维素膜在转 移缓冲液中浸泡3-5分钟；安装转移装置50V电压过夜转膜(转膜过程释放大量的热， 因此需在低温条件下进行)。
转移完毕，可用丽春红S染液对转印后的蛋白质进行可逆染色。将膜放入丽春红 S染液中染色5分钟。在水中脱色2分钟，如转膜成功，可见蛋白带出现。在水中再 浸泡10分钟，使完全脱色。
杂交将膜转入1%的封闭液中，其量以能浸过膜即可。4。C封闭过夜后，于PBST 缓冲液漂洗3次，5-10分钟/次；加入用封闭液稀释(1:2500)的第一抗体溶液，37°C 轻轻摇动1小时；将结合了第一抗体的硝酸纤维素膜，置于PBST缓冲液中洗三次，5-1() 分钟/次；加入用PBST缓冲液稀释(1:5000)的第二抗体溶液，37。C轻轻摇动1小时。显色A溶液将0. 205克无水乙酸钠溶于50ml水中；B溶液将0.02克AEC 溶于2. 5 ral 二甲基甲酰胺中；将A， B两者混合，加4 ul 30%的HA;将洗涤完毕 的膜用吸掉多余水分后放入其中进行显色，发现带型清晰可见时即取出，用水冲洗后 保存。
4 ELASA检测表达的scFv的抗原结合活性
用O. 05tno 1/L pH 9. 6的碳酸缓冲液稀释aFGF至10 ug/mL，包被96孔酶标板100 u1/ 孔，4'C包被过夜，次(=1用10%脱脂奶粉封闭后，分别加入梯度稀释的待测样品100ul， 37 。C温育l h;用PBST洗板3次，然后每孔加入l: 5000稀释的鼠抗scFv抗体，37 。C温 育l h; PBST充分洗涤后，加入服P-山羊抗小鼠IgG(l : 5000稀释)100 ul/孔，37 。C 温育l h; PBST洗板5次，TMB显色；2 mol/L &504终止反应。置酶标仪570咖波长测量 吸收值，并绘制曲线。
结果在烟草中获得了成功的表达(图10， 11， 12， 13)，且具有很好的抗原结 合活性(图14)。 实施例3 scFv的转基因番茄
建立了以甘露糖为选择剂的甘露糖阳性选择系统，切取番茄子叶和下胚轴作为外 植体，放入预培养基中培养两天，用006()1, 0. 5的携带植物表达载体的农杆菌侵染外植 体，共培养两天，然后将外植体转移到选择培养基中，每两周继一次代。四周后将选 择压力增加到S: M=l: 1，六周后将ZT的浓度降低到lmg/1，将IAA的浓度降低到O。八
周后将选择压力增加到S: M=l: 2，十周后再次增大选择压力，最后完全用甘露糖取代
蔗糖。并在番茄的遗传转化中进行了初步应用，获得了表达aFGF单链抗体的转基因番 茄(图15， 16)。
实施例4 scFv基因在酵母中的表达
建立了 scFv的酵母表达系统，根据scFv的序列设计一对引物(Primer F: 5' TTT TACGTACATCATCATCATCATCACAGC, 3' Primer R:5' TTTCCTAGGCTATGAGGAGAC GGTGA 3'，将其插入到酵母表达载体pPIC9K，电击法转入酵母菌株GS115, G418筛选高拷 贝数的克隆，得到稳定表达scFv的菌株，实现了 scFv在酵母中的稳定表达。
权利要求
1、抗aFGF-scFv在制备抗肿瘤药物中的应用。
2、 抗aFGF-scFv的制备方法，包括以下步骤根据scFv的序列 设计引物，进行PCR扩增，对PCR产物回收并进行双酶切反应，在 T4连接酶催化下将scFv片段克隆入表达载体，将表达载体转化到目 的细胞，制备出抗aFGF-scFv。
3、 权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的目的细胞 包括大肠杆菌或植物、酵母细胞。
全文摘要
本发明公开了一种抗aFGF-scFv在制备抗肿瘤药物中的应用及其制备方法，用于制备抗肿瘤的药物。本发明构建了GFP-scFv哺乳动物细胞表达载体，在培养的肿瘤细胞内，抗aFGF-scFv与细胞内源性aFGF分布具有很好的一致性，scFv的过表达导致细胞变小、变圆，使细胞生长阻滞在G1期，荷瘤鼠基因治疗表明scFv具有良好的抑制肿瘤细胞增殖的作用，表明抗aFGF-scFv具有抑制肿瘤细胞生长的作用，可以成为肿瘤治疗的新的靶点，成为一个新的基因工程药物。
文档编号C12N15/81GK101318018SQ20081005095
公开日2008年12月10日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者刘晶莹, 施恒亮, 朱筱娟, 亮 李, 王兴智, 王洪伟 申请人:东北师范大学