专利名称：微小隐孢子虫双价核酸疫苗及制备方法
技术领域：
本发明提供了一种微小隐孢子虫双价核酸疫苗，用于隐孢子虫病的预防 和治疗，同时还提供了该疫苗的的制备方法，属于寄生虫病疫苗制备技术领 域。
背景技术：
隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种人畜共患的寄生性原虫，主要寄 生于人和其它哺乳动物的胃肠道、禽类的呼吸道等粘膜的上皮细胞内，由它 引起的疾病称隐孢子虫病。隐孢子虫病分布广泛，人畜感染率高，且危害严 重，临床上以严重水样腹泻为主要特征。在艾滋病人中隐孢子虫感染率可达 到10% 50%，是艾滋病人的主要致死因素之一。该病是今后医学和兽医学界 防治的重要寄生虫病。虽经多年研究，迄今尚无有效的防治药物以及预防办 法，已筛选了 200多种药物，包括所有的抗生素、抗球虫药和磺胺类药物用 于该病的治疗，但没有任何药物对隐孢子虫有杀灭作用。
发明内容
本发明目的是提供一种微小隐孢子虫双价核酸疫苗，是抗微小隐孢子虫 的新型疫苗，对于隐孢子虫病的预防和治疗有明显效果。
本发明还提供了该疫苗的制备方法，适用于工业化生产。
本发明的微小隐孢子虫双价核酸疫苗，其特征在于以真核表达载体
pVAXl为载体，将两个微小隐孢子虫保护性抗原基因联合CPG免疫加强序列 串联插入到pVAXl真核表达载体的多克隆位点区，获得了含免疫加强序列的微小隐孢子虫双价核酸疫苗。
所述的微小隐孢子虫保护性抗原基因为CP12和CP21。
本发明的微小隐孢子虫双价核酸疫苗的制备工艺，包括如下步骤 根据微小隐孢子虫保护性抗原基因序列的开放性阅读框设计引物进行
PCR， TA克隆。将所得的包含免疫性加强序列的两个保护性抗原基因串联克 隆入真核表达载体pVAXl载体，构建含免疫加强序列的微小隐孢子虫双价重 组核酸疫苗。提取重组质粒并利用试剂盒纯化后，进行细胞转染。并通过间 接免疫荧光、SDS-PAGE电泳分析及Western blotting实验进行验证。之后 利用微小隐孢子虫双价核酸疫苗进行动物保护性试验以验证效果。
具体的工艺是将CPG-CP12、 CP21目的基因与T载体进行连接，分别 用fe/a7J、 fcoA7禾卩&o/(7、 进行双酶切反应，回收片段与经过
和屈W双酶切反应的真核表达载体pVAXl进行连接，构建 pVAXl-CpG-CP12-CP21重组载体。
免疫受损宿主隐孢子虫病症状的严重性和长病程表明，隐孢子虫病与宿 主的免疫系统关系密切。因此，对该病的防治疫苗将起重要作用，而其关键 在于寻找有效的抗隐孢子虫疫苗的候选分子。
利用新的保护性抗原基因，构建新型疫苗，对隐孢子虫的防治起到非常 关键的作用。由于隐孢子虫的感染及其特点与免疫功能密切相关，宿主感染 隐孢子虫卵囊后其病情轻重、病程长短，治疗效果可能主要取决于机体的免 疫状态。因此，免疫干预是控制隐孢子虫病更合适的途径。
本发明的积极效果在于选用了两个保护性抗原基因进行了双价核酸疫 苗的研制，并在此基础上引入了 CPG免疫加强序列，以增强其免疫保护效果。 微小隐孢子虫双价核酸疫苗本身具有较强的细胞免疫和体液免疫作用，并且引入的CPG基序又具有激活免疫系统，诱导天然免疫应答，分泌免疫球蛋白 和各种细胞因子的作用，两者优势组合，从而可以达到更好的预防动物微小 隐孢子虫病的目的。
图l、 pVAXl-CPG-CP12-CP21载体构建示意图； 图2、 pVAXl-CPG-CP12-CP21基因转染Hela细胞的间接免疫荧光图； 图3、pVAXl-CPG-CP12-CP21转染后SDS-PAGE及Western blotting鉴定图； 图4、核酸疫苗对免疫小鼠抗微小隐孢子虫感染的保护效果。
具体实施例方式
为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明 的阐释而非对本发明的任何形式的限制。 实施例l
微小隐孢子虫双价核酸疫苗的制备
本发明以微小隐孢子虫免疫相关蛋白基因CP12、 CP21为例，进行重组真核表 达载体的构建。
微小隐孢子虫双价核酸疫苗的制备步骤
参照CP12、 CP21基因序列开放性阅读框及真核表达载体pVAXl物理图谱设
计引物并引入酶切位点。 CP12上游引物
QF1:5' -CTGGATCCTCCATGACGTTCCTGACGTTATGTCAGATGCATCAATA -3，；其 中5'端含有及朋///位点以及CPG免疫加强序列； 下游引物QR1:5， -GGGGCGAATTCTATTTGTTCATTCATCTG-3， ; 5、端含有&oy /位点。
CP21上游引物QF2: 5， -CCGAATTCGGTGGCGGTGGCTCGATGTCTAAAAGAGCAT -3， 其中5、端含 有fcoAV位点以及Linker序列；
下游引物QR2:5， -CTGGCTCTCGAGCTATTCATCTGTTTGAAC-3， ;5、端含有J力o/ 位点。
利用上述引物序列进行PCR反应(通用参数为94°C 4min; 94°C 45s， 55°C 50s， 72°C lmin， 30个循环后于72。C延伸10min)，将各个PCR纯化产物 克隆分别至PMD18-T载体，经PCR及相对应的酶切鉴定后，送生物公司测序鉴 定。凝胶回收各个目的片段然后与用^9^7^i7^/进行双酶切的真核表达载 体pVAXl连接，连接产物转化Eco"' DH5a感受态细胞后筛选重组质粒，用 ^M^/"和i7 o/进行双酶切反应鉴定，将重组质粒命名为pVAXl-CPG-CP12-CP21 (如图l)。提取重组质粒pVAX卜CPG-CP12-CP21,并利用质粒纯化试剂盒进行 质粒的纯化，37°C， 5。/。C02孵箱培养Hela细胞，使细胞达到50% 80%融合，按 Lipofectamine转染试剂盒说明进行转染，转染72小时后更换培养基并用 G418进行筛选，同时用未加转染的细胞作对照。当对照细胞大部分死亡时， 用含低浓度的G418的培养基维持筛选。l周后有阳性克隆形成，待其逐渐增 大后转移扩大培养。分别收集培养上清液、转染细胞和对照细胞。基因转染 后进行免疫荧光、SDS-PAGE电泳分析及Westernblotting鉴定(如图2、 3)。 实施例2
微小隐孢子虫双价核酸疫苗的用途
将50只4 6周龄，18 22g的雌性清洁级BALB/c小鼠分成5组，每组10只， 其中第 一 组为阴性对照组(肌注100u1/只生理盐水)，第二组 pVAXl-CPG-CP12-CP21肌注组(佐剂为司苯甘油，100ug/只)，第三组为pVAXl 肌注组(佐剂为司苯甘油，100ug/只)，第四组pVAX1-CPG-CP12-CP21,滴鼻 组(佐剂为司苯甘油，100ug/只)，第五组阳性对照组，肌肉注射卵囊抗原
6100ug/只。各组注射三次，间隔两周。三免一周后口服接种微小隐孢子虫卵 囊lX10"个/只进行攻虫试验，攻虫后每隔两天收集各组粪便，用饱和硫酸锌 浮集法收集卵囊，将沉淀溶于一定量的水中，混匀后，取一滴置于血细胞计 数板中，在低倍镜下记数隐孢子虫卵囊总数。同时进行体液和细胞免疫水平 的检测。于每次免疫前尾静脉采血，分离血清，用微小隐孢子虫卵囊抗原作
为包被抗原，通过间接ELISA方法对鼠血清中工gG变化情况进行检测(如附图 4所示)。第三次免疫后l周，每组随机各取4只小鼠放血处死，取脾脏，力n2mL PBS，在200目筛上研磨，用PBS稀释成细胞悬液(1(T个/mL)。取100u L细胞 悬液，加？1冗标记的抗€04+和？￡标记的抗008+兔抗鼠单克隆抗体，避光作用 40min，然后用PBS洗液洗2遍，加入O. 5mL荧光保存液，用流式细胞仪检测CD4+、 CD8+ T淋巴细胞的数量，并用SPSS软件对所得数据进行统计学分析。
免疫保护性试验结果显示试验组免疫保护率明显优于阴性对照组，排出 的卵囊明显减少，排出时间也縮减(见附图4)。体液免疫检测结果证实一免 后各实验组与对照组相比IgG滴度变化不大。二免后IgG滴度逐渐上升，第三 次免疫后，各实验组均显示一定的抗体效价，其中pVAX1-CPG-CP12-CP21滴 鼻组血清抗体效价最高，于阴性对照组相比差异极显著(P〈O.OD。细胞水 平免疫检测结果表明免疫组004+ 、 CD8+变量明显高于阴性对照组，与阴性对 照组差异均极显著(P<0.01)，且滴鼻组鼠的004+ 、 CD8+T淋巴细胞数升值 较注射组高。综合上述实验结果，本发明的微小隐孢子虫双价核酸疫苗 pVAXl-CPG-CP12-CP21，对微小隐孢子虫免疫保护率较高，可以用来作为微 小隐孢子虫病的预防和治疗性疫苗。
权利要求
1、一种微小隐孢子虫双价核酸疫苗，其特征在于以真核表达载体pVAX1为载体，将两个微小隐孢子虫保护性抗原基因联合CPG免疫加强序列串联插入到pVAX1真核表达载体的多克隆位点区，获得了含免疫加强序列的微小隐孢子虫双价核酸疫苗。
2、 根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的微小隐孢子虫 保护性抗原基因为CP12和CP21。
3、 权利要求l所述的重组疫苗的制备工艺，是通过工艺实现的根据微小隐孢子虫保护性抗原基因序列的开放性阅读框设计引物进 行PCR， TA克隆；将所得的包含免疫性加强序列的两个保护性抗原基因串 联克隆入真核表达载体PVAX1载体，构建含免疫加强序列的微小隐孢子虫 双价重组核酸疫苗。
4、 权利要求2所述的重组疫苗的制备工艺，包括以下步骤将CPG-CP12、 CP21目的基因与T载体进行连接，分别用及做力7、 和&o7t7、 Z力W进行双酶切反应，回收片段与经过万a朋W和Z力oJ双酶切 反应的真核表达载体pVAXl进行连接，构建pVAXl-CpG-CP12-CP21重组载 体。
全文摘要
本发明提供一种微小隐孢子虫双价核酸疫苗及制备工艺，以真核表达载体pVAX1为载体，将两个微小隐孢子虫保护性抗原基因联合CPG免疫加强序列串联插入到pVAX1真核表达载体的多克隆位点区，获得了含免疫加强序列的微小隐孢子虫双价核酸疫苗。选用了两个保护性抗原基因进行了双价核酸疫苗的研制，并在此基础上引入了CPG免疫加强序列，以增强其免疫保护效果。本发明疫苗具有较强的细胞免疫和体液免疫作用，并且引入的CPG基序又具有激活免疫系统，诱导天然免疫应答，分泌免疫球蛋白和各种细胞因子的作用，两者优势组合，从而可以达到更好的预防动物微小隐孢子虫病的目的。
文档编号A61K48/00GK101422620SQ200810050899
公开日2009年5月6日 申请日期2008年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者于钦磊, 宫鹏涛, 张国才, 张西臣, 李建华, 李淑红, 举 杨 申请人:吉林大学