专利名称：血清中微小核糖核酸的检测方法和用于检测的试剂盒、生物芯片及其制作和应用方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及人和动物血清中微小核糖核酸分子的 检测方法、用于检测血清中微小核糖核酸的试剂盒或生物芯片以及试剂盒和生 物芯片的制作和应用方法。
背景技术：
微小核糖核酸，英文名为microRNA，简写作raiRNA，是一类长约19至23个核 苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，它们在进化上高度保守，广泛存在于动植 物细胞中，近五年来在人类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小 核糖核酸分子。微小核糖核酸通过识别靶mRNA的3'端非翻译序列，与之不完全 互补，从而抑制靶mRNA的翻译。其序列、结构、丰度和表达方式的多样性使微 小核糖核酸成为信使RNA强有力的调节因子并在基因表达调控领域中起着超乎 想象的重要作用。
微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关，涉及生物个体发育； 组织分化；细胞调亡以及能量代谢等生命活动的方方面面。同时，微小核糖核 酸也与许多疾病的发生及发展存在千丝万缕的联系，在发生某种疾病时总有一 些微小核糖核酸表达量是上调的， 一些是下调的。微小核糖核酸与疾病的关联 有两个层面首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制因 子以及促进因子都有可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸本身先发 生了紊乱表达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或 者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游 一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次， 微小核糖核酸的变化也可以是疾病的结果，这是因为当疾病(如癌症)发生时， 会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若微小核 糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。最近研究发现慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中几种微小核糖 核酸的表达水平均有不同程度的下调；分析比较人肺癌、乳腺癌组织中微小核糖 核酸表达时发现有若干组织特定的微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织发 生了变化。也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等 心血管疾病的发生和发展并且与二型糖尿病等代谢性疾病有密切关联。这些结果 提示微小核糖核酸表达与疾病发生和发展之间存在必然联系。微小核糖核酸完全 可以作为一类新的疾病标志物，相比于传统的病理切片或单一使用的生化指标等 手段，能更加准确帮助疾病定性，诊断疾病的发展阶段，判断并发症的发生和恶 性疾病复发率及疾病的预后，并诊断药效和疗效。此外，微小核糖核酸还是潜在 的药物靶点，如果抑制疾病过程中上调的微小核糖核酸和过表达下调的微小核糖 核酸，将有可能极大地缓解疾病的发生和发展。然而，因为人和动物微小核糖核 酸的研究工作才开展4年左右，目前还没有相关的微小核糖核酸试剂盒。因此， 需要我们更深入研究肿瘤，各种急慢性传染病和急慢性疾病(如呼吸系统疾病， 免疫系统疾病，心血管系统疾病，内分泌系统疾病等)过程中微小核糖核酸的特 异变化，对微小核糖核酸的进一步探索将为我们提供疾病诊疗新途径。微小核糖 核酸试剂盒的研发和在临床医学的应用将具产生巨大经济效益和社会前景。
发明内容
本发明需要解决的问题是通过研究各种肿瘤，各种急慢性传染病(如病毒性 肝炎，艾次滋病等)和急慢性疾病(如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，心血管系 统疾病，内分泌系统疾病等)过程中血清微小核糖核酸的特异变化，得到在疾病 及正常生理状态下差异表达程度大的一类血清微小核糖核酸探针，应用于疾病鉴 定和病程，恶性疾病复发率及预后和药效的诊断相关的PCR试剂盒和生物芯片， 以提高疾病的早期发现率以及确诊的准确性和疗效。
实现本发明目的的一种技术方案为 血清中微小核糖核酸分子的检测方法
1) 收集血清样本；
2) 将10 u 1血清作为buffer进行逆转录反应，来制备cDNA样品；
3) 用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；4) 进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
5) EB染色后在紫外灯下观察结果。
所述步骤5)之后还包括下列步骤用荧光染料EVA GREEN检测并比较血清 样本相对于正常血清中微小核糖核酸的量的变化。
实现本发明目的的另一种技术方案为
血清中微小核糖核酸分子的检测方法
1、 使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取血清总RNA (10ml血清通常能富集 约10ug左右的RNA);
2、 通过RNA逆转录反应得到cDNA;
3、 用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；
4、 进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
5、 EB染色后在紫外灯下观察结果。
所述步骤5之后还包括下列步骤用荧光染料EVA GREEN检测并比较血清样 本相对于正常血清中微小核糖核酸的量的变化。
在上述检测方法中，我们首次使用了 RT-PCR技术来发现并证明人和动物血 清中能检测到各种微小核糖核酸，而且它们具有不同的组织来源和表达丰度。 其次，为了研究在各种肿瘤，各种急慢性传染病(如病毒性肝炎，艾次滋病等) 和急慢性疾病(如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，心血管系统疾病，内分泌系统 疾病等)过程中血清微小核糖核酸的特异变化，我们选取再生障碍性贫血、乳腺 癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤、糖尿病病人血清样品，同时用人全部五百多 个成熟体微小核糖核酸设计引物进行了血清微小核糖核酸的定量PCR实验，以得 到与疾病相关的差异表达的一类血清微小核糖核酸探针。我们直接用病人血清进 行定量PCR实验，用荧光染料EVA GREEN检测并比较相对于正常血清各种疾病血 清中微小核糖核酸的量的变化。
一种用于血清中微小核糖核酸检测的生物芯片，包括人血清中能正常检测到 的全部微小核糖核酸的探针。
此芯片能高通量地筛选血清中稳定变化的微小核糖核酸探针，同时通过血清 中微小核糖核酸的整体变化预测和诊断疾病。
最后我们通过定量PCR技术和生物芯片技术筛选得到和再生障碍性贫血、乳腺癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤、糖尿病等疾病相关的血清微小核糖核酸， 作为预测疾病以及诊断病变程度的探针，来制备PCR试剂盒。
一种用于血清中微小核糖核酸检测的试剂盒，包括一批血清微小核糖核酸探 针以及Taq酶、dNTP试剂。
目前对疾病进行临床诊断的生物化学及分子生物学手段还比较繁琐和粗糙， 比如对于癌症的诊断，需要将手术标本进行组织细胞学染色检验，过程复杂又耗 时耗力。此外，目前尚没有一套早期预测及诊断重症疾病的简易又精确的方法。 鉴于目前疾病诊断方法的单一以及早期发现与预测的困难，我们亟待找到一种比 目前现有方法都更简单可靠同时又简单易行的新方法来鉴定疾病的发生以及判 断病理阶段。我们选取血清中的微小核糖核酸作为研究对象，希望通过检测血清 中的微小核糖核酸解决临床早期诊断等问题。检测血清中的微小核糖核酸有以下 几个优势首先，血清相对组织较易获得，甚至在平常体检中都可以收集到；其 次，血清中的微小核糖核酸反映的是整个机体的生理病理情况，其检测结果具有 指导意义；第三，血清中某些特定的微小核糖核酸可以指示特定的组织器官的病 变，因此其又可以作为疾病诊断的一个参数。总之，检测血清中的微小核糖核酸， 简单易行且效果优越，从血清中的微小核糖核酸的特异性变化这一新角度出发发 现疾病并且区分程度，将建立一种更敏感更精确的用于疾病早期确诊等的全新技 术。
本发明与原有技术相比，其优势在于 一、简单易行，成本低廉。二、特别 适用于早期诊断。三、输出的结果简单明了且精确。
四
图1正常人血清中直接检测到的部分微小核糖核酸RT-PCR结果。 图2提取正常人血清中RNA，检测其中微小核糖核酸的RT-PCR结果。 图3病人血清中部分微小核糖核酸相对于正常人血清中微小核糖核酸的变 化量。
五具体实施例方式
1、血清中的微小核糖核酸的RT-PCR实验我们使用了 RT-PCR技术次发现并证明人和动物血清中不仅能检测到各种微
小核糖核酸，而且其表达量相当丰富。具体步骤为(1)收集小鼠,大鼠，正常
人及某些病人的血清。(2)制备cDNA样品。此操作有两种方案， 一种方案为将 10ul血清作为buffer直接进行逆转录反应，另一种为使用Trizol试剂 (Invitrogen公司)先提取血清总RNA (10ml血清通常能富集约10wg左右的 RNA)，然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4 u 1 5XAMV buffer、 2 u 1 10mM each dNTP mixture (Takara公司)、0. 5 u 1 RNase Inhibitor (Takara公司)、2 u 1 AMV (Takara公司)以及1. 5 y 1基因特异性反向引物混 和物，反应步骤为16'C孵育15分钟，42。C反应l小时，85。C孵育5分钟。(3) PCR及电泳观察。将cDNA按1/50稀释，取1 y 1稀释后的cDNA，加入0, 3 y 1 Taq 酶(Takara公司)，0.2ul 10 y M正向引物，0. 2 u 1 10uM通用反向引物，1.2ul 25mM MgCl" 1.6ul 2, 5mM each dNTP mixture (Takara公司)，2wl 10XPCR buffer, 13. 5ulH20， 20ul体系进行PCR。 PCR的反应条件是95°C 5分钟进 行1个循环—95°C 15秒，60°C 1分钟进行40个循环。PCR产物取10u 1进行 3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯下观察。
具体实验结果见附图。图1是以正常人血清为研究对象，将血清作为buffer 直接进行RT-PCR的实验结果。我们选用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸进 行PCR反应，图1为其中的12种微小核糖核酸。它们分别是血细胞特异性的微 小核糖核酸miR-181a、 miR-181b、 miR-223、 miR-142-3p、 miR-142-5p、 miR-150， 来自心肌及骨骼肌的微小核糖核酸miR-l、 miR-133a、 miR-206，来自脑组织的 微小核糖核酸MR-9、 miR-124a，以及来自肝脏的微小核糖核酸miR-122a。从结 果可以看出上述四种组织来源的微小核糖核酸在血液中都能检测到。但是并非全 部五百多个成熟体微小核糖核酸在血清中都有高丰度表达，有些微小核糖核酸是 很微量的，甚至不能正常检测到。为了进一步验证血清中存在微小核糖核酸，我 们先提取正常人血清中的RNA，然后选用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸进 行PCR实验，结果如图2所示。图2的结果与图1的结果很吻合，PCR产物都单 一，表明这两种实验方法都能检测到人血清微小核糖核酸的表达和丰度。此外， 我们用同样的方法检测了小鼠和大鼠血清中五百多个微小核糖核酸的表达和丰 度，同样发现不同组织来源的微小核糖核酸在小、大鼠血清中有表达(图没列出)。
82、 血清中微小核糖核酸的real-time PCR实验
为了研究各种肿瘤，各种急慢性传染病(如病毒性肝炎，艾次滋病等)和急 慢性疾病(如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，心血管系统疾病，内分泌系统疾病 等)过程中血清微小核糖核酸的特异变化，我们进行了血清微小核糖核酸的定量 PCR实验。定量PCR实验原理及实验步骤同RT-PCR—样，唯一不同是在PCR的 时候加入了荧光染料EVA GREEN。仪器使用的是ABI Prism 7300荧光定量PCR 仪，反应条件为95°C 5分钟进行1个循环一95°C 15秒，60°C 1分钟进行40 个循环。数据处理方法为AACt法，ct设为反应达到域值时的循环数，则每个 微小核糖核酸相对于标准内参的表达量可以用方程2—"t表示，其中ACt =Ct# 。 -Ct a#。我们将病人血清样本与正常人血清样本直接进行逆转录反应，通过定量 PCR反应比较其中所含微小核糖核酸的量。
我们选取再生障碍性贫血、乳腺癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤、糖尿病 病人血清样品，同时用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸进行PCR实验。图3 仅是上述提及的四种组织来源的12种微小核糖核酸在正常人和病人血清中进行 定量PCR的实验结果。再生障碍性贫血、乳腺癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤、 糖尿病病人血清中微小核糖核酸的量相对于正常人的量的比值分别有上调和下 调，表明血清微小核糖核酸可以作为一类新的疾病诊疗预测的标志物。此外，从 图3可知，在一种疾病中不同微小核糖核酸在血清中表达水平不同，提示可能是 不同疾病过程中，对不同组织来源的微小核糖核酸，血细胞免疫应答不同或细胞 破裂或分泌微小核糖核酸途径不同造成的。
3、 用于诊断疾病的血清微小核糖核酸芯片的制作
为了验证通过定量PCR筛选出的与疾病相关的一类血清微小核糖核酸探针 准确可靠性，我们制作了血清微小核糖核酸的生物芯片，该芯片包含了人血清中 能正常检测到的全部微小核糖核酸的探针。此外，芯片能高通量地筛选血清中稳 定变化的微小核糖核酸探针，同时通过血清中微小核糖核酸的整体变化预测和诊 断疾病。我们首先通过测序的方法或定量PCR方法确定血清中有一个以上拷贝的 微小核糖核酸，然后合成这些微小核糖核酸的的反向互补探针，再把这些探针用芯片点样仪SmartArrayTM点制在一张75X25 mm、经过化学修饰的载玻片上。点 制在芯片上的样品还包括作为内标的U6、 tRNA，人工制备的30个碱基长度的外 标，阳性对照Hex等。整个点阵分成4个亚阵，每个亚阵有23行，21列，点间 距为185um，点的直径约为130um，每条探针重复三次。芯片操作流程为(1) 提取血清中总RNA，甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量；(2)微小核糖核酸的 分离取50-100yg总RNA用Ambion's miRNA Isolation Kit (Cat 1560) 分离微小核糖核酸；(3)微小核糖核酸样品的荧光标记利用T4 RNA连接酶标 记方法进行荧光标记，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；(4)杂 交与清洗将RNA溶于16 P L杂交液中(15%甲酰胺；0.2% SDS; 3XSSC; 50X Denhardt' s solution)，于42。C杂交过夜。杂交结束后，先在42。C左右含0. 2% SDS， 2XSSC的液体中洗4分钟，而后在0.2XSSC液体中室温洗4分钟，玻片 甩干后即可用于扫描；(5)芯片扫描芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描 仪进行扫描；(6)数据提取及分析采用LuxScan3. 0图像分析软件对芯片图像 进行分析，把图像信号转化为数字信号，最后用SAM分析挑选差异表达基因。
将定量PCR技术和生物芯片技术双重验证的在疾病及正常生理状态下差异 表达程度大的一类血清微小核糖核酸探针，用于制备生物芯片，方法同上。此芯 片与传统芯片相比，制作工艺和操作流程没有很大改进，但是此芯片简化了探针 库，由此将大大减少芯片的制作成本和生产时间，易于制备。同时也增加了芯片 的疾病针对性和实用性。将此芯片投入实践，仅仅需要病人的血清而不需要任何 其它组织就可以在早期发现疾病，帮助指导诊断和治疗。
4、专门用于疾病诊断与预测的微小核糖核酸试剂盒的制作
用于诊断预测各种肿瘤，各种急慢性传染病(如病毒性肝炎，艾次滋病等) 和急慢性疾病(如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，心血管系统疾病，内分泌系统 疾病等)的微小核糖核酸试剂盒的制作工艺和操作流程是基于定量PCR技术和生 物芯片技术。我们首先通过测序的方法或PCR方法确定正常血清中有一个以上拷 贝的微小核糖核酸。然后通过定量PCR技术和生物芯片技术筛选在疾病及正常生 理状态下表达量和差异程度大的一类血清微小核糖核酸，作为预测是否发生癌变 或其它疾病以及诊断病变程度的探针。此试剂盒包括一批血清微小核糖核酸探针，Taq酶、dNTP等试剂。此试剂盒价值在于只需要血清而不需要其它组织样品， 通过最精简的探针库检测微小核糖核酸的变化趋势，再通过该变化趋势预测疾病 的发生可能或诊断疾病的病理阶段。因此将此试剂盒投入实践，特别对于不能活 检组织的疾病如胰腺癌等，可以增加在早期发现病变的可能，帮助指导诊断和治 疗，把疾病的确诊和治疗推上一个新高度。
权利要求
1、血清中微小核糖核酸分子的检测方法，其特征是，所述检测方法包括下列步骤6)收集血清样本；7)将10μl血清作为buffer进行逆转录反应，来制备cDNA样品；8)用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；9)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；10)EB染色后在紫外灯下观察结果。
2、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征是，所述步骤5)之后还包括 下列步骤用荧光染料EVA GREEN检测并比较血清样本相对于正常血清中微小核 糖核酸的量的变化。
3、 血清中微小核糖核酸分子的检测方法，其特征是，所述检测方法包括下 列步骤① 使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取血清总RNA (10ml血清通常能富集 约10ug左右的RNA);② 通过RNA逆转录反应得到cDNA;③ 用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应； 进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；⑤EB染色后在紫外灯下观察结果。
4、根据权利要求2所述的检测方法，其特征是，所述步骤⑤之后还包括下 列步骤用荧光染料EVA GREEN检测并比较血清样本相对于正常血清中微小核糖 核酸的量的变化。
5、 一种用于血清中微小核糖核酸检测的生物芯片，其特征是，所述生物芯 片含有人血清中能正常检测到的全部微小核糖核酸的探针。
6、 一种用于血清中微小核糖核酸检测的试剂盒，其特征是，所述试剂盒中 设有一批血清微小核糖核酸探针以及包括Taq酶、dNTP在内的试剂。
7、 一种应用血清中微小核糖核酸检测的生物芯片的检测方法，其特征是， 该制作方法包括下列步骤(1) 提取血清中总RNA，甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量；(2) 微小核糖核酸的分离取50-100ug总RNA用Ambion's miRNAIsolation Kit (Cat tt. 1560)分离微小核糖核酸；(3) 微小核糖核酸样品的荧光标记利用T4 RNA连接酶标记方法进行荧光 标记，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；(4) 杂交与清洗将RNA溶于16uL杂交液中(15M甲酰胺；0.2%SDS; 3XSSC; 50XDenhardt's solution)，于42。C杂交过夜。杂交结束后，先在42。C左右含 0.2%SDS， 2XSSC的液体中洗4分钟，而后在0. 2XSSC液体中室温洗4分钟， 玻片甩干后即可用于扫描；(5) 芯片扫描芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪进行扫描；(6) 数据提取及分析采用LuxScan3. 0图像分析软件对芯片图像进行分析， 把图像信号转化为数字信号，最后用SAM分析挑选差异表达基因。
8、 一种用于血清中微小核糖核酸检测的试剂盒的制作方法，其特征是，该 制作方法包括下列步骤I .通过测序的方法或PCR方法确定正常血清中有一个以上拷贝的微小核糖核酸；II. 通过定量PCR技术和生物芯片技术筛选在疾病及正常生理状态下表达量 和差异程度大的一类血清微小核糖核酸，作为预测是否发生癌变或其它疾病以及 诊断病变程度的探针；III. 将步骤II中得到的一类血清微小核糖核酸探针和包括Taq酶、dNTP在内 的试剂，制备成用于血清中微小核糖核酸检测的试剂盒。，
全文摘要
本发明涉及血清中微小核糖核酸分子的检测方法、用于检测血清中微小核糖核酸的试剂盒或生物芯片以及试剂盒和生物芯片的制作和应用方法，目的在于检测血清微小核糖核酸的变化，得到在疾病及正常生理状态下差异表达程度大的一类血清微小核糖核酸探针，应用于疾病鉴定和病程，恶性疾病复发率及预后和药效的诊断相关的PCR试剂盒和生物芯片，以提高疾病的早期发现率以及确诊的准确性和疗效。本发明的技术方案为血清中微小核糖核酸分子的检测方法收集血清样本；将10μl血清作为buffer进行逆转录反应，来制备cDNA样品；用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；EB染色后在紫外灯下观察结果。
文档编号G01N27/447GK101424640SQ200710134620
公开日2009年5月6日 申请日期2007年11月2日 优先权日2007年11月2日
发明者一 巴, 燕 张, 张峻峰, 张红杰, 张辰宇, 柯 曾, 媛 殷, 进 王, 王可慧, 星 蔡, 郭继刚, 熹 陈, 陈江宁 申请人:南京大学