专利名称：：一种血清肿瘤标志物的检测方法
技术领域：
：本发明属生物技术，涉及一种利用蛋白质组学检测裸鼠胰腺癌模型血清，以获得血清肿瘤标志物的方法，为胰腺癌的早期诊断提供动物实验基础。
背景技术：
：胰腺癌以发病隐匿、恶性程度高、手术切除率低、预后极差为特征，是恶性程度最高的肿瘤之一。在我国现居癌症死亡率的第六位，其5年生存率仅为1%-4%。手术根治是目前治疗胰腺癌唯一有确切疗效的方法，术后配合化疗，其5年生存率可达15%-40%。但临床上只有10%-15%的病人可获行根治性切除手术的机会，85%左右胰腺癌患者在确诊时已因出现转移等原因而失去手术根治的机会。目前尚缺乏可用于早期筛査胰腺癌的特异性肿瘤标志物。几年来，蛋白质组学已成为检测和筛查肿瘤标记物的重要手段之一。目前，新型质谱技术以其高通量、高敏感性、采样便捷等优点广泛应用于肿瘤标记物筛选的研究。表面加强激光解吸电离一飞行时间质谱技术是最近几年才发展起来的一种新的蛋白组学研究方法，它能够直接自未经处理的生物样品获取蛋白质图谱。以这一技术为基础开发的系列蛋白质芯片可以非特异性或特异性地结合被测样本中的各种蛋白质，当在质谱仪中受到激光轰击时，各种结合蛋白质会被激发而形成气化离子，由于不同质荷比(m/z)的离子在电场中飞行的时间长短不一，因此接收装置可根据蛋白质质荷比的不同及量的多寡直观的用位置、强弱不同的峰表现出来，进而形成图谱用于分析。这一方^具有样品用量小，操作简便，灵敏度高，高通量等优点，可检测到ftnol(10'15mol)数量级的微量蛋白，并可一次性获得某一样品中成千上万个蛋白质数据。
发明内容本发明的目的是提供一种血清肿瘤标志物的检测方法，是一种利用蛋白质组学检测裸鼠胰腺癌模型血清，以获得血清肿瘤标志物的方法。该方法为早期诊断胰腺癌提供了新的途径，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。本发明提供的方法包括胰腺癌模型血清蛋白质质谱、质谱仪及生物信息学分析，通过以下步骤实现①制备血清样品l，②质谱数据的测定，(D数据收集和生物信息学分析本发明提供的人血清蛋白质质谱由三个质荷比(M/Z)位于11753Da、8615Da、8256Da的蛋白质(包括磷酸化，甲基化，乙酰基化修饰前或修饰后)所组成。具体通过以下步骤实现(1)制备血清样品取全血lml，在4度低温离心(4000转/分钟)10分钟，取上清液，再次离心10分钟，取上清血清。1(^1U9血清处理液中加入血清5pL，摇床上振荡使充分混合，用结合缓冲液(BindingBuffer)将U9处理后的血清稀释至20(Hil用于上样。取上述经U9处理并稀释过的血清100^1加到CM10型蛋白质芯片上，芯片与血清充分反应1小时后去除血清样品，每孔加入200[il相应的BindingBuffer,摇床上振荡5分钟(600rpm，室温)后除去液体，重复该过程2次，用水(纯度HPLC级)20(V1快速清洗每个孔1次，用力甩干并将96孔蛋白质芯片工作支架(Bio-Processor)倒扣在清洁的吸水纸上轻拍以去除多余的水，将芯片从Bio-processor中取出，自然干燥，每孔点加50%饱和的能量吸收分子SPA溶液1^1，待其自然干燥后重复点加1次，自然干燥即可上机检测。(2)利用表面加强激光解吸电离一飞行时间质谱技术(SurfanceEnhancedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry,SELDI-TOF-MS)检测步骤(l)的血清样本，获得血清蛋白质谱，质谱仪参数设定:激光强度165，灵敏度7，数据收集范围2000—30000m/z(蛋白质质量和电荷比值，即质荷比)，每次收集数据前以标准蛋白质芯片校正分子量。(3)数据收集和生物信息学分析原始数据先以ProteinchipSoftware3.0软件校正，使总离子强度及分子量达到均一，并过滤噪音，初始噪音过滤值5，二次噪音过滤值2，以10%为最小阐值进行聚类，经上述数据预处理后，Mann-Whitney秩检验比较各组血清蛋白质质谱数据(由ProteinchipSoftware3,0自带的BiomarkerWizard3.2.0软件完成)，寻找各组之间表达有差异的蛋白质峰，各组血清蛋白质质谱比较的数据导入Matlab6.5数据处理软件的SVM、判别分析软件，选择两组间差别最显著的10个蛋白质峰数据进行分析，筛选出Youden指数最高的秩和比峰组合，用SVM留一法和判别分析留一法建立分期模型。每组分析样本设为n个，则所有样本中随机抽取n—l个样本设为训练集用于建立模型，剩余1个样本设为测试集进行交叉验证。如此抽样、训练和验证过程重复n次，以得到最接近真实值的结果。最后同时输出SVM、原始判别及二者交叉验证的结果。并以SPSS13.0统计软件包进行统计分析，比较不同蛋白质峰排列组合的判别分析结果,选出最佳排列组合；(4)结果表明质荷比分别为11753、8615、8256的三个蛋白质峰值是否升高可以准确检测血清肿瘤标志物。本发明应用SELDI-TOF-MS技术及生物信息学方法筛选出诊断效率高的肿瘤标志物，为临床上肿瘤的诊断提供动物实验基础，具有较高的灵敏度、特异度和正确率。并且可以完善及改良蛋白质指纹图谱技术，降低检査费用，使之更适合于临床应用。本发明与其他非侵入性胰腺癌的诊断方法比较具有以下优点(l)本发明提供的质谱模型，为早期检测胰腺癌提供了新的途径和方法，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。(2)与以往的传统的非侵入性方法比较具有极高的特异性与敏感性，其敏感性与特异性均达到卯％以上，是一种在蛋白质组学水平上的诊断，对胰腺癌的早期发现，早期诊断方法与标准提供了新的依据。(3)本发明模型的构建方法设计合理，可行，是为降低我国胰腺癌的病死率、提高胰腺癌的治愈率、进一步筛查胰腺癌提供了一种新的方法。图1为质核比(m/z)位于U753Da.健康组与胰腺癌组裸小鼠血清蛋白质指纹图谱的对比。图2为质核比(m/z)位于8615Da.健康组与胰腺癌组裸小鼠血清蛋白质指纹图谱的对比。图3为质核比(m/z)位于S256Da.健康组与胰腺癌组裸小鼠血清蛋白质指纹图谱的对比。具体实施例方式本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例1制备血清样品l:主要仪器和试剂:CM10型蛋白质芯片96孔蛋白质芯片工作支架即Bio-proeessor分析纯尿素、乙酸钠、乙睛、DTT和cHAPS缓冲盐(sigma公司)能量吸收分子SPA、实施步骤取全血lml，在4度低温离心(4000转/分钟)10分钟，取上清液，再次离心10分钟，取上清血清。10plU9血清处理液中加入血清5uL，摇床上振荡使充分混合。用BindingBuffer将U9处理后的血清稀释至200u1用于上样。取上述经U9处理并稀释过的血清100nl加到芯片上，芯片与血清充分反应1小时后去除样品。每孔加入200h1相应的BindingBuffer,摇床上振荡5分钟(600rpm，室温)后除去液体。重复该过程2次。用水(纯度HPLC级)200pl快速清洗每个孔1次，用力甩干并将Bio-Processor倒扣在清洁的吸水纸上轻拍以去除多余的水。将芯片从Bio-processor中取出，自然干燥。每孔点加50%饱和的SPA溶液lpl，待其自然干燥后重复点加1次。自然干燥即可上机检测。结果参见图1-3。图1中(A)显示m/z为11753的蛋白波峰在健康组血清中的表现，(B)显示m/z为11753的蛋白波峰在胰腺癌组血清中的表现。图1显示质核比11753蛋白在胰腺癌小鼠血清中呈高表达。图2中(A)显示m/z为8615的蛋白波峰在健康组血清中的表现，(B)显示m/z为8615的蛋白波峰在胰腺癌组血清中的表现。图2显示质核比8615蛋白在胰腺癌小鼠血清中呈高表达。图3中(A)显示m/z为8256的蛋白波峰在健康组血清中的表现，(B)显示m/z为8256的蛋白波峰在胰腺癌组血清中的表现。图3显示质核比8256蛋白在胰腺癌小鼠血清中呈高表达。实施例2上机检测主要仪器、软件PBS—II表面加强激光解吸电离一飞行时间质谱仪(SELDI—TOF—MS)、分析软件ProteinChipSoftware3.0(美国Ciphergen公司):支持向量机(supportveetormachines,SVM)、判另U分析(discriminantanalysis)禾口时间序歹U分析(time-sequenceanalysis)软件运用Matlab6.5数据处理软件(MathworkS公司)开发；实施步骤质谱仪参数设定:激光强度165，灵敏度7，数据收集范围2000一30000m/z(蛋白质质量和电荷比值，即质荷比)，每次收集数据前以标准蛋白质芯片校正分子量。利用表面加强激光解吸电离一飞行时间质谱技术检测血清样本，获得血清蛋白质谱。实施例3数据收集和生物信息学分析原始数据先以ProteinchipSoftware3.0软件校正，使总离子强度及分子量达到均一，并过滤噪音，初始噪音过滤值5，二次噪音过滤值2，以10%为最小阐值进行聚类。经上述数据预处理后，Mann-Whitney秩检验比较各组血清蛋白质质谱数据(由ProteinchipSoftware3.0自带的BiomarkerWizard3.2.0软件完成)，寻找各组之间表达有差异的蛋白质峰。各组血清蛋白质质谱比较的数据导入Matlab6.5数据处理软件的SVM、判别分析软件。选择两组间差别最显著的10个蛋白质峰数据进行分析。筛选出Youden指数最高的秩和比峰组合，用SVM留一法和判别分析留一法建立分期模型。每组分析样本设为n个，则所有样本中随机抽取n—l个样本设为训练集用于建立模型，剩余1个样本设为测试集进行交叉验证。如此抽样、训练和验证过程重复n次，以得到最接近真实值的结果。最后同时输出SVM、原始判别及二者交叉验证的结果。并以SPSS13.0统计软件包进行统计分析，比较不同蛋白质峰排列组合的判别分析结果,选出最佳排列组合。3个实施例的结果都参见图1、图2、图3。图中横坐标为蛋白质质荷比(m/z)，纵坐标为相对峰值(相对含量)。图1显示质核比11753蛋白在胰腺癌小鼠血清中呈高表达。图2显示质核比8615蛋白在胰腺癌小鼠血清中呈高表达。图3显示质核比8256蛋白在胰腺癌小鼠血清中呈高表达。3个蛋白质峰(11753、8615、8256m/z)组合构建为胰腺癌预测模型(表2)。胰腺癌预测模型鉴别空白对照组与胰腺癌组裸小鼠血清的敏感性95%(19/20);特异性95%(19/20);准确率95%(38/40)。表2.1空白对照组与模型组3个蛋白质峰比较(;x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2.2胰腺癌预测模型I对空白对照组与胰腺癌模型组的交叉验证结身<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注敏感性95%(19/20);特异性95°/。(19/20);准确率95%(38/40)总结以上各部实验的结果，得出了以下结论质荷比分别为11753、8615、8256的三个蛋白质峰值是否升高可以准确判断实验裸鼠是否患有胰腺癌，具有较高的灵敏度、特异度和正确率。这就为进一步的临床研究提供了重要依据，为在人体中采用该新技术方法早期筛査胰腺癌打下了坚实的基础。权利要求1.一种血清肿瘤标志物的检测方法，其特征是通过以下步骤实现(1)制备血清样品，(2)质谱数据的测定，(3)数据收集和生物信息学分析；所述步骤(1)取上清液，离心，在U9血清处理液中加入血清，振荡混合，用结合缓冲液将U9处理后的血清稀释，取稀释的血清加到CM10型蛋白质芯片上，反应后去除血清样品，每孔加入结合缓冲液，振荡后除去液体，重复2次，用水清洗每个孔，去水，取出芯片，自然干燥，每孔点加50％饱和的能量吸收分子SPA溶液，重复点加1次，自然干燥即可上机检测；所述步骤(2)是利用表面加强激光解吸电离—飞行时间质谱技术检测步骤(1)的血清样本，进行质谱数据收集，激光强度165，灵敏度7，数据收集范围2000—30000m/z，每次收集数据前以标准蛋白质芯片校正分子量；所述步骤(3)是由三个质荷比位于11753Da、8615Da、8256Da的血清蛋白质组成的质谱模型，利用生物信息学分析检测血清肿瘤标志物。2.根据权利要求1所述的一种血清肿瘤标志物的检测方法，其特征是步骤(3)所述的生物信息学分析，是将原始数据以ProteinchipSoftware3.0软件校正，以10%为最小阐值进行聚类，Mann-Whitney秩检验比较正常裸鼠与胰腺癌裸鼠的血清蛋白质质谱数据，建立判别模型，用留一法交叉验证。全文摘要本发明提供一种血清肿瘤标志物的检测方法，通过应用表面加强激光解吸电离—飞行时间质谱技术分析血清蛋白成分的差异，建立胰腺癌的血清蛋白质指纹图谱，由三个质荷比位于11753Da、8615Da、8256Da的血清蛋白质组成的质谱模型，利用生物信息学分析检测血清肿瘤标志物。本发明应用SELDI-TOF-MS技术及生物信息学方法筛选出诊断效率高的胰腺癌肿瘤标志物，为临床上胰腺癌的诊断提供动物实验基础，具有较高的灵敏度、特异度和正确率，并且可以完善及改良蛋白质指纹图谱技术。本发明方法设计合理，可行，是为降低我国胰腺癌的病死率、提高胰腺癌的治愈率、进一步筛查胰腺癌提供了一种新的方法。文档编号G01N27/64GK101363838SQ200810120689公开日2009年2月11日申请日期2008年9月2日优先权日2008年9月2日发明者刘达人,曹利平,亮汪,王贵锋,阙日升申请人:浙江大学