专利名称：隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及其应用。
背景技术：
隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是由隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)引起的一种世界范围内广泛流行的人兽共患寄生虫病，可以感染包括人类在内的哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类等170多种动物。对免疫功能正常的宿主可引起自限性腹泻，对免疫功能受损的宿主则呈慢性腹泻并常常危及生命，给人类健康和生命安全带来了严重威胁，也给畜牧业生产造成了巨大的损失。隐孢子虫最先由Tyzzer于1907年在小鼠胃腺粘膜组织切片中发现。其中，微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是最主要的人兽共患病病原。迄今为止，研究人员已在实验室筛选了上千种化学药物和抗生素，仍未找到理想的抗隐孢子虫药物。因此隐孢子虫病的免疫预防和治疗就显得十分重要，但目前仍缺乏有效的隐孢子虫病预防疫苗。在以往的隐孢子虫疫苗研究中，人们通常在重组疫苗中编码一个全长的隐孢子虫抗原蛋白。但是，此类单一的疫苗候选分子的免疫保护效果并不理想，其原因可能是隐孢子虫基因组巨大，生活史复杂，抗原种类繁多，单一的抗原无法彻底阻断病原在宿主体内的生活周期，导致单一抗原、单一表位的免疫保护效果不够理想。考虑使用多抗原疫苗时，由于载体容量有限，并且大分子蛋白可能会造成动物免疫病理反应，所以在单一载体中加入多个抗原存在很大的局限性。近年来，国际寄生虫学界开始尝试利用抗原表位预测工具进行抗原表位预测，构建多表位疫苗(multi-印itope vaccine)，多表位疫苗也称鸡尾酒式疫苗，是同时携带多个与目标抗原相关的表位及辅助性表位的疫苗。与传统疫苗相比，多表位疫苗具有独特的优势，能被多种遗传背景的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)分子所识别、结合，从而得到高效的递呈，尤其在细胞免疫方面具有显著的优势，以应对病原微生物的变异以及免疫反应中诸多的不利因素。在抗疟疾多表位疫苗研制领域，已设计合成了多个基因工程疫苗和合成肽疫苗，取得了较好的免疫保护效果，其中不少已进入II期或III期临床试验。在隐孢子虫领域目前尚无这方面的报道。为使机体获得最佳的免疫保护，构建多表位疫苗时需综合考虑机体的免疫应答特征和疾病的特殊性，针对性地选择目的抗原表位。体液免疫主要通过B细胞产生抗体来发挥作用，故可以选择特异性B细胞表位来定向诱导宿主的体液免疫应答。细胞免疫应答包括CD4+辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞，分为Thl与Th2两个亚群)应答和⑶8+细胞毒性T细胞(cytotoxicT lymphocyte, CTL)应答。因此，可根据机体对病原体的免疫应答特点，选择特异性的Thl、Th2或CTL表位来诱导机体免疫应答向Thl、Th2或CTL应答类型定向发展。细胞免疫在宿主抗隐孢子虫感染过程中起着至关重要的作用。研究显示微小隐孢子虫初次和再次感染均引起强烈的细胞免疫反应，其中CD4+辅助性T细胞参与控制感染， CDS+细胞毒性T细胞则有很强的清除寄生虫的作用。
发明内容
本发明要解决缺少有效的隐孢子虫多表位疫苗的技术问题，提供一种隐孢子虫 CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白，该混合多表位基因和融合蛋白可用于制备抗隐孢子虫病的多表位疫苗。此外，还需要提供一种隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种隐孢子虫混合多表位融合蛋白，包含SEQ ID NO. USEQ ID NO. 3中任意一条或两条氨基酸序列。所述SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 3 都富含 CTL 和 Th 表位，SEQ ID NO. 1 中含有 4 个CTL表位和2个Th表位，SEQ ID N0. 3中含有3个CTL表位和1个Th表位。优选的，所述隐孢子虫混合多表位融合蛋白还包含SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列， 该序列中含有4个Th表位。增加SEQ ID N0. 2序列可适当提高免疫肽分子量，以使免疫小鼠产生更高的血清抗体效价、具有更好免疫原性。优选的，所述SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3三段序列之间设有柔性氨基酸组成的接头序列，该接头序列能使各段富含CTL和Th表位的氨基酸序列在空间上互相独立，防止各表位多肽分子由于空间结构发生变化而阻碍其和MHC(主要组织相容性复合体，具有抗原呈递作用)分子的结合；同时接头序列可适当提高免疫肽分子量，以增强多表位融合蛋白的免疫原性。更优选的，所述融合蛋白具有SEQ ID N0. 7所示的氨基酸序列。在本发明的另一方面，提供了一种隐孢子虫混合多表位基因，其包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列。优选的，所述隐孢子虫混合多表位基因具有编码SEQ ID N0. 7所示氨基酸序列的核苷酸序列。更优选的，所述隐孢子虫混合多表位基因具有SEQ ID N0. 8所示的核苷酸序列。在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述隐孢子虫混合多表位基因的重组载体。所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体，重组表达载体包括重组原核表达载体、重组真核表达载体。在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗，包含上述隐孢子虫混合多表位基因和表达载体。在本发明的另一方面，还提供了一种隐孢子虫混合多表位融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。在本发明中，将融合蛋白与弗氏不完全和完全佐剂、Montanide ISA 206等充分混勻制备亚单位疫苗。在本发明的另一方面，还提供了一种隐孢子虫混合多表位基因在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。在本发明中，将隐孢子虫混合多表位基因克隆到真核表达载体如pVAXl、pcDNA3. 1 等，或共同插入细胞因子基因，构建成核酸疫苗。本发明隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因，克隆到真核表达载体后形成的核酸疫苗，经动物免疫保护试验结果表明，与对照组相比，本发明核酸疫苗组排出卵囊数量明显减少，开始排出卵囊时间延后，卵囊排出持续时间明显缩短，提示该核酸疫苗对小鼠隐孢子虫鼠基因型感染有很好的免疫保护效果。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例2隐孢子虫PI、P2和P3基因片段的PCR扩增产物电泳结果图；图2是本发明实施例2隐孢子虫混合多表位融合基因P1-2和CpT的PCR扩增产物电泳结果图；图3是本发明实施例2重组质粒pMD-CpT双酶切产物电泳结果图；图4是本发明实施例3重组原核表达质粒pGEX-CpT的双酶切鉴定电泳图；图5是本发明实施例3重组蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳图；图6是本发明实施例3重组蛋白表达产物经纯化后的SDS-PAGE电泳结果图；图7是本发明实施例4隐孢子虫混合多表位基因PCR扩增产物电泳鉴定图；图8是本发明实施例4重组克隆载体pMD18T_CpT(e)的双酶切鉴定电泳结果图；图9是本发明实施例4重组真核表达质粒pVAX-1-CpT的双酶切鉴定图；图10是本发明实施例5重组真核表达质粒pVAX-1-CpT作为核酸疫苗免疫后小鼠隐孢子虫卵囊排出曲线图。
具体实施例方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京科学出版社，200 中所述的方法进行。本发明利用生物信息学技术，对微小隐孢子虫疫苗候选抗原与宿主MHC I类分子 H2-Kd、H2-Ld和H2-Dd以及MHC II类分子H2_Ad、H2_Ed结合的表位分别进行预测，筛选出理想的抗原表位；选取多个富含CTL和Th表位的不同抗原片段，构建包含一个或多个抗原片段、且富含CTL和Th表位的多价多表位基因，各抗原片段之间用柔性氨基酸链接。将该多表位基因克隆到原核表达载体中进行原核表达；将该多表位基因克隆到真核表达载体， 构建核酸疫苗，观察其对小鼠隐孢子虫感染的免疫保护效果。动物免疫保护试验结果显示， 与对照组相比，核酸疫苗组排出卵囊数量明显减少，开始排出卵囊时间延后，卵囊排出持续时间明显缩短，提示该核酸疫苗对小鼠隐孢子虫鼠基因型感染有很好的免疫保护效果。实施例1隐孢子虫T细胞抗原表位的预测和筛选从GenBank下载微小隐孢子虫抗原CP15 (登录号L34568)、CP15/60 (登录号L08612)的氨基酸(Amino Acid, AA)和基因序列，从实验室获得隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidiummousegenotype) P23 抗原氨基酸及基因序列。运用 SYFPEITHI (http // www. syfpeithi. de/home. htm)、ProPred-1(http://www. imtech. res. in/raghava/ propredl/)和 NetMHC 3. O (http: //www. cbs. dtu. dk/services/NetMHC/) 3 个表位预测服务器，分别对上述隐孢子虫抗原同鼠源9个氨基酸残基的H2-d (包括H2-Kd、H2-Ld和 H2-Dd)型MHC I类分子结合的限制性CTL表位进行预测。具体方法为预测H2_Kd、 H2-Ld限制性表位时，将抗原氨基酸序列分别输入服务器，保存SYFPEITH I预测分值大于20的9肽；同时保存ftOPred-I返回结果的前15位；寻找二者的重复序列。按照文献[Panagiotopoulos C，Qin H，Tan R，et al. Identification of a β -cell-specific HLA class I restricted epitope in type 1 diabetes[J]. Diabetes，2003，52 (11) 2647-2651]报道的方法，计算两者所含MHC I类分子结合9肽的得分并排序，选取得分明显大于其他肽段的序列。结合NetMHC 3. O预测结果，进行综合分析。预测H2_Dd限制性表位时，保存ProPred-I返回结果的前15位，结合NetMHC 3. O预测结果进行综合分析。运用RANKPEP (http //bio. dfci. harvard. edu/RANKPEP/) ,MHCPred (http //www. jenner. ac. uk/MHCPred)、MHC2Pred (http: //www. imtech. res. in/raghava/mhc2pred/)禾口 MHC BindingPrediction(http://epitope, liai. org :8080/tools/matrix/iedb_input ？ matrixClass = I，II) 4个表位预测服务器预测3个隐孢子虫抗原同鼠源H2_d (包括H2_Ad 和H2-Ed)型MHC II类分子结合的Th表位。具体方法是，将隐孢子虫抗原的氨基酸序列分别以FASTA格式输入以上服务器，返回的表位数据存至word文档。若氨基酸序列长度大于 1000个AA残基时，保存得分高的前20个表位，否则取前15个表位。保存RANKPEP显示为红色的返回结果。找出4个服务器预测结果重复率大于60%的片段(即有5个以上重复氨基酸残基)取其并集，将序列向两端各延长1-6个序列作为鼠源H2-d型分子结合的候选表位。结果经过预测，发现微小隐孢子虫CP15抗原5-59AA区段(SEQ ID NO. 1)、隐孢子虫鼠基因型P23抗原的1-113AA区段(SEQ ID N0. 2)、微小隐孢子虫CP15/60抗原的 11-95AA区段(SEQ ID N0. 3)分别含有4、0、3个CTL表位，包括H2_Kd型表位2个，H2_Ld 型3个，H2-Dd型2个；分别含有2、4、1个Th表位。与其他区段相比，上述区段所含的T细胞表位较多，是CTL和Th表位富集区域，故选择这3段序列构建CTL和Th混合多表位基因， 并将CP15抗原5-59AA区段、P23抗原的1-113AA区段、CP15/60抗原的11-95AA区段编码的核苷酸序列 SEQ ID N0. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6，依次命名为 PI、P2 和 P3。 实施例2隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因的扩增和鉴定(1)引物的合成根据筛选的隐孢子虫抗原CP15、P23和CP15/60表位富集区域编码的核苷酸序列， 按照重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by overlap extension, gene S0Eing)PCR技术方法要求，设计3对引物，分别扩增基因片段PI、P2和P3。引物序列见表1，在Pl上游引物(PlF)的5’端加上适当的保护性碱基、限制性内切酶EcoR I序列；在P2的上游引物 (P2F)和Pl的下游引物(PlR)的5’端加上互补的一个15氨基酸多肽接头的DNA序列；在 P2的下游引物(P2R)和P3上游引物(P3F)的5’端加上柔性氨基酸接头GS的DNA序列；在 P3下游引物(P3R)的5’端加上限制性内切酶Ml I序列、终止密码子TAA和保护性碱基。 引物交由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。
表IPCR引物序列
目的片段来源引物名称引物序列(5’ —3)添加序列扩增产物大小 (bp)PlFCCGGAATTCCCGACCATGAAATTGGATGAGGnGTTG (SEQ ID NO. 9)EcdR. ICP15PlRCGACCCGCCACCGCCGCTGCCACCTCCGCCTGMCCGCCTCCACLinker (GGGGS) 3225CACGTAAATGGGTACGAACAG (SEQ ID NO. 10)P2FGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCLinker (GGGGS) 3P23GATGGGTTGTTCATCATCAAAGCC (SEQ ID NO. 11)393P2RCATGGATCCGGCATCAGCTGGCTTGTCTT (SEQ ID NO. 12)Linker GS/ Ββ λ ICP15/60P3FGCCGGATCCATGGGTAACTTGAAATCCTGTTGTTC (SEQ ID NO. 13)Linker GS/ Badl I276P3RCCCGTCGACTTATTCATCCAAAGCAATATTTCTGSa J I(SEQ ID NO. 14)在表1中，引物序列的加粗字体为酶切位点或Linker序列。(2)目的基因的扩增与连接以实验室保存的隐孢子虫重组质粒pMD-18T-CP15、pMD_18T_P23、 PMD-18T-CP15/60的DH5 α转化菌为模板，用表1的引物通过PCR分别扩增目的片段Ρ1、Ρ2、 Ρ3。结果如图1所示，扩增片段大小与预期大小相符。图1中，M:100bp DNA分子量标准； 1 :P1扩增产物；2 :P2扩增产物；3 :P3扩增产物。序列测定结果显示，Pl大小为22^p，P2 大小为39!3bp，P3大小为276bp，未发生序列变异。PCR产物用胶回收试剂盒回收，通过gene SOEing PCR技术连接Pl、P2片段，命名为P1-2。用胶回收试剂盒回收P1-2，再次通过gene SOEing PCR技术连接P1-2和P3，命名为CpT。电泳结果显示，P1-2和CpT的大小与预期相符(见图2)。图2中，M :100bp DNA 分子量标准；1 :P1"2扩增产物；2 =CpT扩增产物。用胶回收试剂盒回收CpT，采用TA克隆方法将目的基因与pMDIS-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5 α，挑取阳性克隆，用PCR、酶切和测序法验证。经EcoR I和Ml I酶切鉴定正确(见图3)后，进行序列测定，结果显示其大小为837bp(SEQ ID NO. 8)，其中16_拟8 位核苷酸为编码区序列，该编码区序列中，16-18位核苷酸ATG为起始密码子，拟6-拟8位核苷酸TAA为终止密码子，整个序列未发生序列变异。鉴定正确的重组质粒命名为pMD-CpT。 图3中，Ml IOObp DNA分子量标准；M2 =Marker IV DNA分子量标准；1 重组质粒pMD_CpT 的EcoR I和Ml I双酶切产物。CpT的具体序列为CCGGAATTCCCGACCATGAAATTGGATGAGGTTGTTGAGCTTTTACCAGCACGTAAAAGACGTAAGATA GCCAGAGGTTGTCTTAACAGAAGAACTGCAGCTTTTATCGCAAAGCTCCGCAAATCTAAGGCTGAATGTCCAATGGGAGAGAAACCTGTTGCTGTTCGTACCCATTTACGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGT CGATGGGTTGTTCATCATCAAAGCCAGAAACTAAAGTTGCTGAAAATAAATCTGCAGCAGATGCTAACAAACAAAGA GAATTAGCTGAAAAGAAGGCTCAATTAGCCAAGGCTGTAAAGAATCCAGCTCCAATCAGCAACCAAGCTCAACAAAA GCCAGAAGAACCAAAGAAGTCCGAGCCTGCTCCAAATAACCCTCCAGCTGCTGATGCGCCAGCAGCCCAAGCTCCTG CTGCCCCTGCCCCTGCTGCCCCTGCTTCACAGGATAAGCCAGCTGAGGCTCCAGCTGCTGAAGCTCCAGCTGCTGAA CCTGCTGCTCAACAAGACAAGCCAGCTGATGCCGGATCCATGGGTAACTTGAAATCCTGTTGTTCTTTTGCCGATGA ACACTCCCTAACCTCTACTCAACTAGTAGTTGGAAATGGTTCAGGAGCTTCAGAAACTGCTTCCAACCACCCCCAAG AAGAAGTTAATGATATTAATACTTTTAATGTAAAGTTAATAATGCAAGATAGAAGTAAGCTTGACTGTGAGGTAGTA TTTGATAGCACAAGTATTTCGCTTTCTGGAGATGGAAAATGCAGAAATATTGCTTTGGATGAATAAGTCGACGGG(S EQ ID NO. 8)共编码270个AA，序列为MKLDEVVELLPARKRRKIARGCLNRRTAAFIAKLRKSKAECPMGEKPVAVRTHLRGGGGSGGGGSGGGG SMGCSSSKPETKVAENKSAADANKQRELAEKKAQLAKAVKNPAP I SNQAQQKPEEPKKSEPAPNNPPAADAPAAQ APAAPAPAAPASQDKPAEAPAAEAPAAEPAAQQDKPADAGSMGNLKSCCSFADEHSLTSTQLVVGNGSGASETASNH PQEEVNDINTFNVKLIMQDRSKLDCEVVFDSTSISLSGDGKCRNIALDE(SEQ ID NO. 7)实施例3隐孢子虫混合多表位基因的原核表达(1)原核表达质粒的构建与鉴定取pGEX-4T-l质粒和pMD_CpT质粒，分别同时用EcoR I和Ml I酶切。酶切产物用胶回收试剂盒回收后用T4DNA连接酶连接。连接产物转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞， 筛选阳性菌落。碱裂解法提取重组质粒，经PCR、EcoR I和Ml I双酶切鉴定及测序鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组原核表达质粒命名为pGEX-CpT。重组原核表达质粒pGEX-CpT经 EcoR I和Ml I双酶切鉴定结果如图4所示，图4中，1 pGEX-CpT的EcoR I和Ml I双酶切产物；M =Marker IV DNA分子质量标准，图4表明重组原核表达质粒pGEX_CpT经EcoR I 和Ml I双酶切鉴定正确。(2)原核表达质粒的诱导表达将pGEX-CpT转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，挑取阳性单菌落，培养至 D600nm达0. 5左右时，以终浓度为1. Ommol/L的IPTG诱导7h，期间每隔Ih取样，进行浓度为 12%的SDS-PAGE电泳，观察蛋白表达情况。经IPTG诱导证后表达量达到最高(见图5)， SDS-PAGE分析蛋白的分子量比预计的57ku略大。在图5中，1_3 重组质粒转化菌IPTG诱导证产物；4 重组质粒转化菌未诱导表达产物；M 蛋白质标准分子量。取IPTG诱导证的表达菌，经液氮冻融3次并进行超声波裂解，收集上清液，沉淀加8mol/L尿素溶解，离心后分别收集上清液和沉淀，经GST柱纯化后用SDS-PAGE分析重组蛋白的存在形式(见图6)。图6中，M 蛋白质标准分子量；1 :pGEX-CpT转化菌诱导证菌液；2 :pGEX-CpT转化菌诱导证菌液超声裂解后的上清；3 :pGEX-CpT转化菌诱导证菌液超声裂解后的沉淀溶于8mol/L尿素中；4 :pGEX-CpT转化菌诱导证菌液超声裂解后的沉淀溶于PBS。BandScan软件分析显示，表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的12. 3 %，主要以包涵体形式表达。实施例4隐孢子虫混合多表位基因真核重组表达质粒的构建(1)引物的设计和合成
为使隐孢子虫多表位基因CpT正确克隆到真核表达质粒中并正常表达，根据 PVAXl载体多克隆位点上酶切位点及三联密码子要求重新设计引物扩增CpT(e)，引物引入限制性酶切位点EcoR I和)(ba I及Kozak序列，在EcoR I后补充碱基保证三联体密码子不错位。该引物序列的上游引物 CpT F(e)为CCGGAATTCCCGACCATGGCTATGAAATTGGATGAGG TTGTTG(SEQ IDN0. 15)；下游引物 CpT R(e)为CCCTCTAGATTATTCATCCAAAGCAATATTTCT (SEQ ID NO. 16)。(2)目的基因的扩增、克隆和鉴定以pMD-CpT重组质粒转化菌为模板，利用引物CpT F(e)/CpT R(e)，扩增目的片段 CpT(e)。经过30个循环的PCR扩增，获得了 CpT(e)基因，大小与预计相符(见图7)。图7 中，M =IOObp DNA分子质量标准；1 :CpT(e)PCR扩增产物。用胶回收试剂盒回收CpT (e)，采用TA克隆方法将目的基因与pMD18_T载体连接， 转化至大肠杆菌DH5 α，挑取阳性克隆，用PCR、EcoR I/Xba I双酶切和测序法进行验证， 鉴定正确的重组质粒命名为PMD-CpT (e)。重组质粒pMD-CpT (e)经EcoR I/Xba I双酶切后得到2条带，与预计片段大小相同(见图8)。图8中，Ml IOObp DNA分子量标准；M2 Marker IV DNA分子量标准；1 重组质粒pMD-CpT(e)的EcoR I和Xba I双酶切产物。经测序鉴定序列未发生碱基突变。(3)真核重组表达质粒的构建大量提取重组质粒pMD-CpT (e)和真核表达质粒pVAX_l，用EcoR I和)(ba I分别进行酶切，酶切产物经胶回收试剂盒回收后用T4DNA连接酶连接，连接产物转入大肠杆菌 DH5a感受态细胞，筛选阳性菌落，碱裂解法提取重组质粒，经PCR、酶切及测序鉴定阳性克隆，将鉴定正确的真核重组表达质粒命名为pVAX-l-CpT。pVAX-I-CpT经EcoR I和)(ba I 双酶切鉴定，得到与预计片段大小相符的片段(见图9)。图9中，Ml =Marker IV DNA分子量标准；M2 =IOObp DNA分子量标准；1 真核重组表达质粒pVAX_l_CpT的EcoR I和Xba I双酶切产物。pVAX-1-CpT经测序鉴定未发生碱基突变，插入的序列符合开放阅读框的三联体密码子顺序。用碱裂解法大量提取pVAX-1-CpT质粒，聚乙二醇(PEG8000)沉淀法纯化质粒DNA， GEHeal thcare NanoVue紫外可见光分光光度计测定质粒浓度。 实施例5动物免疫保护试验将30只4周龄BALB/c小鼠分成3组，每组10只，包括pVAX-I-CpT试验组和 pVAX-Ι空载体、生理盐水对照组。试验组用重组真核表达质粒pVAX-1-CpT经生理盐水稀释后进行背部皮下多点免疫，每只小鼠注射质粒0. 05mg ；2个对照组以相同的方法分别注射pVAX-Ι空载体和生理盐水，pVAX-1免疫剂量亦为0. 05mg/只小鼠，生理盐水对照组接种剂量为0.05mL/只小鼠。每2周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫2周后，每只小鼠经口接种IX IO6个隐孢子虫鼠基因型卵囊。感染后每隔2d采取粪便10g，加40mL水溶解，铜纱网过滤，滤液3000r/min离心lOmin，收集沉淀。力卩IOmL饱和蔗糖混勻，1500r/min离心 IOmin0用铁丝圈蘸取液面表层至载玻片上，盖上盖玻片，用10X40倍显微镜镜检，对50个视野内的隐孢子虫卵囊进行计数。结果与对照组相比，试验组开始排出卵囊时间延后。至感染后31d，核酸疫苗pVAX-1-CpT仅于感染后第IOd检测到卵囊；pVAX-Ι空载体组于感染后第IOd检测到卵嚢， 第16d达到高峰，至试验结束即接种后第31d，仍有卵囊排出；而生理盐水对照组于感染后 第7d开始检测到卵嚢，13-19d达到高峰，至感染后第31d仍有卵囊排出(图7)。与对照组相比，试验组所排出卵囊数量明显減少。各组小鼠粪便中隐孢子虫卵囊 排出情况如图10所示，31天各组总共检测到的相对卵囊数依次为pVAX-l-CpT免疫组2 个；pVAX-Ι空载体对照16个；生理盐水空白对照20个，差异非常显著。与对照组相比，试验组卵囊排出持续时间明显減少。pVAX-1-CpT试验组仅于感染 后第IOd检测到卵囊；pVAX-Ι空载体组排卵囊持续时间超过21d ；生理盐水对照组排卵囊 时间超过24d(见图10)。图10结果表明本发明重组真核表达质粒pVAX-1-CpT制成的核酸疫苗具有很好的 免疫保护效果。以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范 围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>中国农业科学院上海兽医研究所<120>隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及其应用<160>16<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>55<212>PRT<213>Cryptosporidium parvum<220><221>MISC_FEATURE<222>(1). . (55)<223>CP15 抗原片段<400>1Met Lys Leu Asp Glu Val Val Glu Leu Leu Pro Ala Arg Lys Arg Arg151015Lys lie Ala Arg Gly Cys Leu Asn Arg Arg Thr Ala Ala Phe lie Ala202530Lys Leu Arg Lys Ser Lys Ala Glu Cys Pro Met Gly Glu Lys Pro Val354045Ala Val Arg Thr His Leu Arg5055<210>2
<211>113
<212>PRT
<213>Cryptosporidium mouse genotype
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1). . (113)
<223>P23 抗原
<400>2
Met Gly Cys SerSerSerLysProGluThrLysValAlaGluAsnLys
151015
Ser Ala Ala AspAlaAsnLysGlnArgGluLeuAlaGluLysLysAla
202530
Gln Leu Ala LysAlaValLysAsnProAlaProlieSerAsnGlnAla
354045
Gln Gln Lys ProGluGluProLysLysSerGluProAlaProAsnAsn
505560
Pro Pro Ala AlaAspAlaProAlaAlaGlnAlaProAlaAlaProAla
65707580
Pro Ala Ala ProAlaSerGlnAspLysProAlaGluAlaProAlaAla
859095
Glu Ala Pro AlaAlaGluProAlaAlaGlnGlnAspLysProAlaAsp
100105110
Ala
<210>3
<211>85
<212>PRT
<213>Cryptosporidium parvum
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1). . (85)
<223>CP15/60抗原片段
<400>3
Met Gly Asn LeuLysSerCysCysSerPheAlaAspGluHisSerLeu
151015
Thr Ser Thr GlnLeuValValGlyAsnGlySerGlyAlaSerGluThr
202530
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354045
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505560
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<223>Xba I 酶切位点<400>16ccctctagat tattcatcca aagcaatatt tct3权利要求
1.一种隐孢子虫混合多表位融合蛋白，其特征在于，包含SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3 中任意一条或两条氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的隐孢子虫混合多表位融合蛋白，其特征在于，还包含SEQID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的隐孢子虫混合多表位融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列。
4.一种隐孢子虫混合多表位基因，其特征在于，包含编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的隐孢子虫混合多表位基因，其特征在于，所述混合多表位基因具有编码SEQ ID NO. 7所示氨基酸序列的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的隐孢子虫混合多表位基因，其特征在于，所述混合多表位基因具有SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。
7.—种重组载体，其特征在于，包含权利要求4所述的隐孢子虫混合多表位基因。
8.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求4所述的隐孢子虫混合多表位基因和表达载体。
9.权利要求1所述的隐孢子虫混合多表位融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。
10.权利要求4所述的隐孢子虫混合多表位基因在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种隐孢子虫CTL和Th混合多表位融合蛋白，其包含SEQ ID NO.1、SEQID NO.3中任意一条或两条氨基酸序列。本发明还公开了隐孢子虫混合多表位基因，其包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列。本发明隐孢子虫混合多表位基因和融合蛋白，能制成疫苗，对小鼠隐孢子虫感染具有很好的免疫保护效果，适于作为抗隐孢子虫病的多表位疫苗。
文档编号A61K39/002GK102276725SQ20101020011
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者周鹏, 李艳, 米荣升, 陈兆国, 黄燕 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所