一种共固定化细胞因子及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种共固定化细胞因子及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及将药物固定在可降解材料上用于制备治疗疾病的药物领域，具体涉及ー种共固定化细胞因子及其制备方法和应用。
背景技术：
子宫颈癌(Carcinoma of Cervix)是全球女性所患恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的常见恶性肿瘤，在一些发展中国家妇女中其发病率仍属第I位。它是通常发生在宫颈阴道部或移行带的鳞状上皮细胞及颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤。近50年来，随着社会经济和卫生事业的发展，子宫颈癌在发达国家的发病率已大幅度下降，但是在发展中国家，子宫颈癌的发病率和死亡率仍居高不下。据国际癌症研究中心近年估计其5年患病为15518万人，其中100余万在发展中国家，30余万在发达国家(齐祥意.对宫颈癌的浅见[J].中国现代药物应用，2010，4(3) :227-228.)。 现有医学技术对子宮颈癌还没有彻底治愈的方法，但会根据患者的不同情况施以不同的治疗方法与药物。在临床上常见的宫颈癌治疗方法有手术治疗，药物治疗和物理治疗。化学药物和放射药物的选择性不高，既能抑制和杀伤肿瘤细胞，也可损伤体内正常组织和细胞，在治疗中出现明显的毒副作用，治疗效果不理想；而物理疗法，如激光、冷冻、电灼等治疗较多出现活动性渗血，造成下腹隐痛不适，出现阴道流液甚至感染等副作用，给病人带来极大的生理上和心理上的痛苦。2006年以来，子宮颈癌预防性Gardasil疫苗已在全球49个国家获得批准，获批国家规模还在不断扩大。在加拿大，推荐Gardasil疫苗给9-13岁女性使用。相关研究发现其显著降低宫颈癌发病率的潜力，并且经济实惠(Morris SK, Nguyen CK. The humanpapillomavirus vaccine in Canada[J]. Can J Public Health,2008,99(2) :114-116.),但是仍然存在很多问题，例如子宮颈癌预防性疫苗成本较高，难以在发展中国家广泛推广，另外接种的年龄、对象、阶段以及潜在的毒副作用尚未清楚，而治疗性疫苗尚停留在I/II期临床试验阶段，目前还没有在人体进行相关试验，真正应用于广大癌患者还需要相当长的一段时间(沈亮，张辉.子宮颈癌疫苗的研究进展[J].国际妇产科学杂志，2009，36 (2)113-116.;朱雪琼，石ー复.HPV疫苗预防子宮颈癌临床研究进展[J].实用肿瘤杂志，2010，25(1) 12-15)。同时，随着细胞凋亡及其与癌症治疗的相关性已逐渐成为科学家们的研究热点，宫颈癌细胞凋亡的研究也成为肿瘤细胞生物学的重要组成部分。近年来，针对凋亡在肿瘤对化疗药物敏感性中作用的研究越来越多，通过诱发凋亡来治疗恶性肿瘤已成为研究恶性肿瘤的新热点，因此，研发长效、控释、低毒的抗肿瘤制剂成为当今癌症药物治疗研究的主要目标。细胞凋亡(Apoptosis)亦称程序化死亡(Programmedcell death, PO))或凋亡性细胞死亡(Apoptosis cell death, ACD),是 Kerr (Kerr JFR, Wyllie AH, CurrieAR. Apoptosisa basic biological phenomenon with wide-ranging implications intissue kinetics[J]. Br J Cancer,1972,26 (4) :239-257 ；Searle J, Lawson TA, AbbottPJ, et al. An electron-microscope study of the mode of cell death induced bycancer chemotherapeutic agents in populations of proliferating normal andneoplastic cells[J], J Path, 1975,116(3) :129-138)等于 1972 年首先提出的ー种不同于细胞坏死的细胞死亡方式，是在一定的生理或病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控，激活内源性核酸内切酶而发生的细胞自动消亡的过程。由于细胞凋亡与很多疑难疾病发病机制和治疗关系密切，其研究引起了广大生物医学工作者的极大的兴趣，关于细胞凋亡现象和机制的研究从80年代以来，已经取得了许多重要的进展(AshkenaziA, Dixit VM.Death receptors !signaling and modulation [j」·Science, 1998,281 (5381) :1305-1308 ；Andreas Strasser, Liam 0' Connor,Vishva M Dixit. Apoptosissignaling [J]. Annu. Rev. Bioehem, 2000, 69 :217-245 ； Joza N, Susin SA, Daugas E, etal. Essential role of the mitochondrial apoptosis—inducing factor in programmedcell death[J],Nature,2001, 410(6828) :549-554 ；Hunot S, Flavell RA. APOPTOSIS Death of a monopoly [J]. Science, 2001, 292 (5518) :865-866),成为生物医学等领域研究
的最新热点之一。细胞因子药物由于其强大的抗癌作用与免疫调节等作用多年来一直倍受关注。肿瘤坏死因子-α (TNF-α)是人体内对肿瘤有直接杀伤作用的一种细胞因子，由激活的单核巨噬细胞产生，可使瘤体縮小或消失，在体内体外均能有效杀伤肿瘤细胞(丁守怡，许小幸，吴荣，等.肿瘤坏死因子对肿瘤细胞杀伤作用的观察[J].齐鲁医学杂志，1999，14(1)
3-5.;杜德极.关于增强肿瘤坏死因子的抗肿瘤作用研究及应用[J].中国药房，1994，2(5) :35-36.;陈振南，李声伟，高家让，等.人肿瘤坏死因子-a基因转染与干扰素-Y联合应用对舌癌细胞生长的影响[J].华西口腔医学杂志.2002，20 (I) :55-57.;胡长坤.干扰素的抗肿瘤作用[J].国外医学肿瘤学分册，1992，19 (5) :1-274.)，对多种肿瘤的中晩期患者有一定治疗作用，但在临床应用中发现有明显的毒副反应，如发热、寒战、恶心呕吐、头痛、肝肾功能改变等。干扰素-Y (IFN-y)是在病毒感染后机体细胞产生的ー种抗病毒的糖蛋白，是广谱抗病毒物质，它以诱导方式在细胞内抗RNA或DNA病毒。它本身无毒性，也不影响正常细胞功能，但可抑制快速分裂的细胞，如各种肿瘤细胞，临床可用于肿瘤的辅助治疗。干扰素的毒副作用发生率比较高，最常见的是发热及流感样综合征，患者体重减轻、脱发、情绪激动，骨髄抑制致血细胞、血小板減少，轻度贫血，偶可发生神经系统损伤，影响内分泌系统功能，亦有产生干扰素抗体者。高效治疗和高毒副作用之间的矛盾成为临床应用的严重阻碍。因此，如何减低用药剂量，減少毒副作用，提高治疗效果是解决问题的关键。有研究证实，IFN-Y可增强TNF诱导的细胞凋亡，有协同促进TNF-a杀伤肿瘤细胞的功能，能一定程度减低TNF-a的用量和毒副作用。关于IFN-Y协同TNF-对肿瘤的杀伤效应的机理，目前有研究认为IFN-Y能上行性调节靶细胞表面的TNF受体的数量，使靶细胞对TNF的敏感性增加。TNF-a和IFN-y所作用细胞周期的不同也增强了对靶细胞的杀伤。IFN-Y与TNF-a协同抗肿瘤，可在一定程度上减轻TNF的毒副反应，我们的前期研究也证明了两者的协同作用抑制率明显高于単独使用任何一种细胞因子的抑制率，同时降低了単一细胞因子的剂量(王文文，陶慧敏，李志斌，等.共固定化TNF-a/IFN-Y对宫颈癌HeLa细胞的长效抑制作用[J].离子交换与吸附，2009，25 (2) :130-136)。与此同时，医用材料方面的研究显示，高分子药物因分子量大不易被分解，故能提高药物的长效性并降低药物毒副作用(关燕清，邱李莉，廖瑞雪，等.高分子药物研究进展[J].华南师范大学学报(自然科学版)，2005，(2) :125-135)，同时，高分子药物可以通过改变剂型，控制药物释放速度，避免因间歇给药引起的血药浓度波形变化，从而使释放到体内的药物浓度处于相对稳定状态(姚康德，孙珊，彭涛.智能性药物释放体系[J].高分子通报，1992, (2) :116-122. ；P. M. Bungay, H. K. Lonsdale, M. N. de Pinho. SyntheticMembranes :Science, Engineering and Applicat ions(Hardcover) [M]. D. Reidelpublishing company, 1986 :581-582.;翟颐华 ，邹国林.高分子聚合物在药物上的应用[J].中国生化药物杂志，1996，17 (6) :51-59)，还可以通过释放体系使药物送达到体内特定部位，而对身体的其它部位不起作用(关燕清，邱李莉，廖瑞雪，等.高分子药物研究进展[J].华南师范大学学报(自然科学版)，2005，(2) :125-135)。有研究表明，利用生物医用高分子作载体，化学結合或物理包埋抗癌药物，可使药物缓慢作用并增强杀伤肿瘤细胞的活性(邓先模，李孝红.生物医用高分子在癌症药物治疗中的应用[J].高分子通报，1999，
(3):94-98)。正因为高分子药物具有缓释、长效优势，已成为新型药物的发展方向之一。生物材料(Biomaterials)在医学中又称为生物医用材料(Biomedicalmaterials),指用于生理系统疾病的诊断、治疗、修复或替换生物体组织或器官，增进或恢复其功能的材料。随着越来越多的生物材料被广泛的应用和材料科学、生命科学与生物技术的发展，使得人类得以在分子水平上去认识材料和机体间的相互作用，因此目前对生物材料以及它们与细胞之间的相互作用的研究成为目前十分热门的课题。其研究主要方面为材料的生物相容性，但是鉴于细胞凋亡可以被很多因素(包括很多已经广泛应用的生物材料)诱导产生，并且细胞凋亡与很多疾病发病机制和治疗关系密切，由此我们认为探索生物材料诱导的细胞凋亡对于生物材料的临床应用极其重要，应该给予生物材料诱导的细胞凋亡以极大的关注，井深入研究其现象和机制(吴科达.生物材料诱导细胞凋亡的研究进展[J]·生物医学工程学杂志，2005，22 (2) =413-419) ο聚氨酯热塑性弾性体又称热塑性聚氨酯橡胶，简称TPU，国际上称为Thermoplastic polyurethane,有的译为聚氨基甲酸酷、聚脲烧等,我国习惯将此类聚合物通称为聚氨酷(图I)。它具有独特的嵌段分子结构，是ー种(AB)n型嵌段线性聚合物，A为高分子量(1000-6000)的聚酯或聚醚，B为含2-12直链碳原子的ニ醇，AB链段间化学结构是用ニ异氰酸酷，通常是ニ苯甲烷ニ异氰酸酯(MDI)连接。聚氨酯结构中含有类似酰胺基团(-HN-C0-)及酯基团(-C0-0R)的结构(郦华兴，叶晓丽.新型软质热塑性聚氨酯弾性体世界橡胶业，2007，4 (8) :6-8)。TPU之间的性能差别是很大的，这取决于初始原材料，大多数的TPU的对比是通过多类型的聚合物ニ醇或多羟基化合物(软链段)来进行的(董晓武.新一代柔软的聚氨酯(TPU) [J],橡胶參考资料，2006:36-38)，可通过调节聚氨酯软硬段成分比例改变其弾性、硬度、亲水性等，根据需要设计出性能各异的产品，根据A段分为聚酯型和聚醚型两类。其制品具有无可比拟的特性——独特的粘结性、润湿性、柔韧性、耐磨性、光泽性等，并且，聚氨酯材料具有良好的生物相容性和血液相容性，抗凝血、无毒、不致癌，具有优异的力学性能，因此防水透气性聚氨酯薄膜及涂层在医疗方面的应用越来越广，可用作伤ロ敷料、外科手术服及保护性衣物、医用手套、医用覆盖物等(Holme I. PorousPolymers&Fusible Films[J]. Journal of Coated Fabrics,1986,15(1) 198-205 ；Johnson L, Schultze D. Breathable TPE Films for Medical Applications[J]. MedicalDevice&Diagnostic Industry, 2000, (7) :30-37 ;钱伯章.世界热塑性弾性体的现状和发展趋势[J].世界橡胶エ业，2005，24 40-46)。从上世纪50年代聚氨酯首次应用于生物医学起，五十多年来，聚氨酯弾性体在医学上的用途日益广泛。1958年聚氨酯首次用于骨折修复材料，而后又成功地应用于血管外科手术缝合用补充涂层；70年代开始，聚氨酯作为ー种医用高分子材料已倍受重视；到了80年代，用聚氨酯弾性体制造人工心脏移植手术获得成功(章俊，胡兴斌，李雄.生物医用高分子材料在医疗中的应用[J].医学技木，2008，(I) :30-35)，二十一世纪初，聚氨酯已经涉及到医用材料大大小小很多领域，可以说聚氨酯是最具有价值的医用合成材料之一，使聚氨酯材料在生物医学上的应用得到进ー步的发展(黎兵，张海龙，李智华，等.聚氨酯材料在生物领域上的研究进展及应用[J].聚氨酷，2008，(4) :96-100)。那么，如何将医用高分子材料聚氨酯与细胞因子的強大抗肿瘤效果结合起来，应用到细胞凋亡中治疗子宫颈癌呢？ 尽管聚氨酯弾性体是公认的生物相容性相对较好的高分子生物医用材料，但是其生物相容性还不够理想，表面改性是ー种能直接有效地改善材料表面性能，提高其生物相容性的方法(詹红彬，陈红.聚氨酯表面性能对其生物相容性的影响[J].材料科学与工程学报，2007，25(4) :640-643)，由此，对聚氨酯进行改性以提高其生物相容性成为国内外学者研究的重要课题之一。另外，生物材料与生物体接触后，与机体首先发生作用的是材料的表面，因此改善聚氨酯弾性体表面的组成和结构是此课题要解决的关键问题。有研究表明，经表面处理的聚氨酯由于具有良好的物理机械性能和血液相容性被广泛用作血液接触材料及组织工程中的支架材料(詹红彬，陈红.聚氨酯表面性能对其生物相容性的影响[J].材料科学与工程学报，2007，25 (4) =640-643 ;王雪力，侯理，谭竞，等.生物相容性聚氨酯支架材料的研究[J].高分子材料科学与工程，2008，24(2) :144-151.)。早在上世纪90 年代初，由 Matsuda 等(Sugawara T,Matsuda T. 1994 ；Matsuda T,Sugawara T. 1995a ；Sugawara T, Matsuda Τ. 1995b ；Matsuda Τ, Sugawara Τ. 1996)人为代表的几个研究小组首先提出光化学固定法，该法是所有用于生物医用高分子材料表面改性的方法中，生物相容性最理想、通用性最強、最简单实用的ー种新方法。这种光化学固定方法及其固定的新的生物材料已经成为生物材料学家所关注和研究的焦点。光化学固定法是指利用紫外或可见光(300_800nm)将具有特定功能的分子或组分偶联到材料表面的方法，其原理是利用带有双官能团一般来说，其ー为热活性基团，另ー为光活性基团的光偶联剂将生物活性化合物分子偶联到材料表面来达到改性表面的目的。目前，光化学固定化技术已广泛应用于各个领域。该技术可对有益的各种生物大分子表面进行固定化修饰，并接枝在生物相容性材料的表面，由于独立的有机官能团的存在，从而可以大大提高生物大分子的活性。
我们曾利用光固定化方法(图2，3)将干扰素-α接枝上聚氨酯，成功接枝后的聚氨酯具有一定的抗菌功能，通过红外光谱、拉曼光谱等测量仪证明了使用光固定手段聚氨酯能光固定化细胞因子，同时保证了其有效成分的纯度，并且使用场发射扫描电镜、激光扫描共聚焦显微镜观测共固定后的聚氨酯材料，确定其仍保持原有的物理化学特性(李岳川.纳米级抗菌避孕材料的研制[D].华南师范大学，2006;关燕清，彭长连，李岳川.ー种纳米级抗菌抗病毒避孕套[P].中国200610036660，2007)。由此，本发明在原有基础上，主要运用形态学、病理学、物理化学等多种方法，在同一剂量与相同作用时间下，对共固定化细胞因子的两种类型聚氨酯(聚酯型聚氨酯和聚醚型聚氨酷)诱导的细胞凋亡，细胞周期的分布进行分析，研究不同聚氨酯材料对细胞周期阻滞的影响，进而筛选适合用于临床靶向治疗宫颈癌的载体聚氨酯材料。

发明内容
本发明的目的在于根据现有细胞因子用于医学临床应用中存在的高毒副作用等问题，提供一种药效高、毒副作用小的共固定化细胞因子。本发明另一目的在于提供上述共固定化细胞因子的制备方法。本发明还有ー个目的在于提供上述共固定化细胞因子的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现ー种共固定化细胞因子，包括聚氨酯和偶联在聚氨酯上的细胞因子，所述细胞因子为 TNF- α 和 IFN- Y。作为ー种优选方案，所述聚氨酯为聚酯型聚氨酯或聚醚性聚氨酷。本发明共固定化细胞因子的制备方法包括如下步骤(I)将TNF-α和IFN-Y分别加入含N-琥珀亚酰胺的ニ甲基酰胺/PBS溶液中，冰浴条件下搅拌反应，反应完毕后分别离心，得到光活性TNF-a和IFN-Y，冷冻干燥；(2)以培养板孔径为标准，在聚氨酯薄膜上裁剪出圆形小膜，经消毒后贴附于培养板孔内，将光活性TNF- a和IFN- Y混合加到培养板内聚氨酯薄膜上，避光干燥，经光固定化后，用PBS洗板，培养板孔内即为共固定化细胞因子。作为ー种优选方案，步骤⑴中所述TNF- a和IFN- Y的摩尔比为I 10 10 1，最优选为I : I。作为ー种优选方案，步骤⑴中所述ニ甲基酰胺/PBS溶液的pH为7. 4，ニ甲基酰胺和PBS的体积比为4 I，所述N-琥珀亚酰胺与TNF-a和IFN-Y的摩尔比为10 I以上，最优选为100 I。作为ー种优选方案，步骤⑴中所述冰浴温度为O 10°C，搅拌时间为24 96h。作为ー种优选方案，步骤⑵中所述光活性TNF- a和IFN- Y的总量为20ng/cm2。作为ー种优选方案，步骤⑵中所述光固定化是用15 120W紫外灯在2 15cm 距离处照射IOs 20min。作为ー种优选方案，步骤(2)中所述用PBS反复洗板的次数为20次以上。本发明共固定化细胞因子对HeLa细胞的増殖有显著抑制性，因此可用于制备预防或治疗宫颈癌的药物。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(I)本发明将TNF- α和IFN- Y共固定化到聚氨酯材料上，使TNF- α和IFN- Y发挥协同抗肿瘤作用，增强了对靶细胞的杀伤，还可在一定程度上减轻TNF-α的毒副作用，提闻了药效;(2)本发明使用聚氨酯材料作为基体材料，由于聚氨酯成本低、生物相容性好，可生物分解吸收，因此用于制备治疗或预防宫颈癌的药物，具有缓释、高效、长效、安全等优点，市场前景广阔。


图I为聚氨酯(TPU)的基本组成图；图2为光活性TNF- a /IFN- Y合成图；图3为光固定生物材料制备图；图4为光学显微镜观察HeLa细胞形态学变化(HE染色，1000X)，其中，第一行为聚苯こ烯PSt组(Α:空白组，B:游离TNF-α/IFN-Y组，C :共固定TNF-a/IFNi组)；第ニ行为聚酯型聚氨酯组(D :空白组，E :游离TNF- a /IFN- Y组，F :共固定TNF- a /IFN- Y 组)；第三行为聚醚性聚氨酯组(G :空白组，H :游离TNF-a /IFN-Y组，I :共固定TNF-a /IFN-y 组)；图5为流式分析TNF-a /IFN-Y诱导HeLa细胞及空白对照3d死亡类型比例图，其中，第一行为聚苯こ烯PSt组(A :空白组，B :游离TNF-α /IFN-Y组，C :共固定TNF-a /IFN-y组)；第二行为聚酯型聚氨酯组(D:空白组，E :游离TNF-a/IFN-Y组，F :共固定TNF- a /IFN- Y组)；第三行为聚醚性聚氨酯组(G:空白组，H :游离TNF-a/IFN-Y组，I 共固定 TNF-a/IFN-Y 组)；图6为三种材料诱导的细胞凋亡率(X土s，η = 3)；图7为TNF-a/IFN-Y诱导HeLa细胞及空白对照3d DNA含量直方图，其中，第一行为聚苯こ烯PSt组(A:空白组，B :游离TNF-α/IFN-Y组，C :共固定TNF-a/IFNi组)；第二行为聚酯型聚氨酯组(D :空白组，E :游离TNF-a/IFNi组，F :共固定TNF-a/IFNi组)；第三行为聚醚性聚氨酯组(G :空白组，H :游离TNF-a /IFN-Y组，I :共固定TNF-a /IFN-y 组)；图8为HeLa细胞凋亡周期阻滞分布图(X土s，η = 3)，其中，A是二次利用聚苯こ烯PSt组，B是聚酯型聚氨酯组，C是聚醚性聚氨酯组。
具体实施例方式以下结合实施例来进ー步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。试剂与材料重组人干扰素-Y购自珠海丽珠生物工程制药厂，重组人肿瘤坏死因子-α购自上海赛达生物药业有限公司，ニ甲基甲酰胺(DMF)、N-(4-叠氮苯甲酸基)琥拍亚酰胺购自sigma公司。碘化丙唳(Propidium iodide, PI)和RNA酶由中山大学附属第一医院检验室提供。24孔组织培养板为BIOFIL公司产品。RPMI medium 1640、胰酶为GIBC0BRI公司产品。新生牛血清购自展晨生物科技有限公司。TPU薄膜购自东莞市雄林塑胶有限公司，人宫颈癌HeLa细胞株，由中山大学医学院动物中心提供，经本实验室传代培养。仪器Nikon显微镜，日本Olympus公司光学倒置显微镜，美国BD公司生产的FACSCalibur流式细胞仪，广州三元公司Thermo CO2培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂78_1磁力加热搅拌器，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅。
实施例I共固定化细胞因子的制备I.游离TNF-α与IFN-Y的制备利用PBS 溶液分别溶解 IFN- Y (45 μ g, O. 02 μ mol)与 TNF- a (40 μ g, O. 02 μ mol)，并调整至所需浓度后，使用一次性过滤膜分别进行过滤灭菌，分装备用。2.光活性TNF- α与IFN- Y的合成将IFN- Y (45 μ g, O. 02 μ mol)与 TNF- a (40 μ g, O. 02 μ mol)分别加入 20ml 含N-琥珀亚酰胺(60 μ g，O. 02 μ mol)的ニ甲基酰胺DMF/PBS (pH7. 4，体积比为4 I)溶液中，在4°C (冰浴)的条件下搅拌反应48h。合成结束后,分别用超滤离心管(Milipore MolecutII，IOKNa)，在4000rpm/min的转速下，离心30min以纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥备用。使用前，加入PBS溶液溶解，并调整至所需浓度。、3.光固定化聚苯こ烯材料的制备光活性IFN- Y和光活性TNF- α分别以两种浓度(20ng/ml和200ng/ml)加入24孔组织培养聚こ烯基板(PSt)，4°C下避光冷冻干燥后，在紫外灯(15W)下2cm处照射15min,利用叠氮基十分活泼的特性，将光活性IFN- Y和光活性TNF- α共固定到PSt材料上。光固定化后，用PBS溶液(ρΗ7. 4)反复洗涤基板30次。4.共固定化聚氨酯薄膜材料的制备以24孔培养板孔径为标准，在TPU膜上裁剪出圆形小膜，经蒸馏水清洗以及75体积％こ醇消毒后，贴附于洁净无菌培养板孔内。将光活性IFN- Y和TNF- α以20ng/ml浓度混合加到24孔培养板内TPU薄膜上，把基板置于4°C冰箱，避光自然干燥后，紫外灯(15W)下2cm处照射15min。光固定化后，用PBS(pH7. 4)溶液反复洗涤基板30次。实施例2游离细胞因子对HeLa细胞生长的抑制与光固定化细胞因子对HeLa细胞生长抑制的对比I.人子宫颈癌细胞(HeLa细胞系)的培养使用RPMI 1640培养基(含10%新生小牛血清、0. 03mg/ml青霉素、0. 05mg/ml链霉素，pH7. 2-7. 4)，在37°C，5% CO2培养箱中进行常规继代培养。取处于对数生长期的细胞，用含胰蛋白酶0.25% (W/V)和EDTA 0. 02% (W/V)的PBS (-)溶液消化，井先后使用血清培养基和无血清培养基洗涤。最后，以无血清培养基调整为IXlO6ceIVml的细胞悬液。2.游离细胞因子对HeLa细胞生长的抑制对24孔组织培养聚こ烯基板(PSt)作以下2个分组处理A板(TNF_ a /IFN- Y )将游离IFN- Y和TNF- α分别以20ng/ml和200ng/ml的浓度加到PSt上；B板(TNF- α /IFN- Y ):接枝共固定化TNF-α/IFN-Y ;同时作不加任何细胞因子的空白对照组。3.光固定化细胞因子对HeLa细胞生长抑制用75% (V/V)的こ醇溶液对已光固定化的24孔组织培养二次利用聚苯こ烯基板进行灭菌(浸泡IOmin)，然后用无菌水反复冲洗3-4遍(或加入已灭菌的TPU薄膜)。最后，每孔都加入Iml含lX105cell/ml的细胞悬液，各作12个平行孔，在37°C，5% CO2培养箱培养。实施例3光电子能谱分析共固定细胞因子材料元素含量将制备好的光固定TNF-α /IFN-Y生物材料，放4°C冰箱干燥，用X-射线光电子能谱仪检测分析光固定生物化材料其表面元素含量。表I共固定生物材料表面兀素含量
Atomic percent (%)
Substrate
CON TPU(polyester)86.339.674.00
TPU(polyester)-AzPh-TNF-a/IFN-y 60.3034.005.70 TPU(polyether)90.745.463.80 TPU(polyether)-AzPh-TNF-a/IFN-Y 68.2424.357.41 PSt-AzPh-TNF-a/IFN-y(recycle)73.3216.1010.58为了检测光活性TNF- a /IFN- y是否通过光化学固定法结合到生物材料表面，以及二次利用的共固定聚苯こ烯材料表面TNF-a /IFN-Y残余情况，我们采用X射线光电子能谱分析(X_ray photoelectron spectroscopy, XPS),即化学分析用电子能谱(ElectronSpectroscopy for Chemical Analysis, ESCA)进行分析检测，获得待测物 C、0、N 含量,从表I中可看出，光活性TNF-α/IFN-γ共固定到生物材料上改变了材料中N的含量，上图聚酯型(polyester) TPU、聚醚型(polyether) TPU接枝后N含量均有上升,从原先N比例的4. 00%,3. 80%到接枝后分别是5. 70%、7. 41%，N含量上升程度分别是I. 7%、3. 61%，由此可见光活性TNF- a /IFN- Y [通过叠氮基断裂将TNF- a /IFN- Y连接到N- (4_叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺的热活性基团上]中的芳香叠氮基团经过紫外光辐射激发，发生不可逆光分解，叠氮基分解为氮气和活性能量极高的氮烯中间物，这种中间物将高分子中碳氢键打开，氮和碳发生亲核反应，并夺去的氢与碳原子形成仲胺，芳香叠氮基团以共价键接到高分子材料，初步达到生物材料表面改性的效果。另外，參照实验室原先对纯聚苯こ烯N含量的检测值0%和共固定TNF-a /IFN-Y聚苯こ烯N含量14. 24%，二次利用的共固定TNF-a/IFN-Y聚苯こ烯材料N含量相比纯聚苯こ烯材料上升了 10. 58%，比一次利用的共固定TNF-a /IFN-Y聚苯こ烯材料N含量只下降了 3. 68%，可见共固定TNF-a/IFN-γ具有二次利用的应用前景，从另ー个角度也可看出，光化学共固定法在众多表面改性的方法中效果显著，不同材料共固定效率也存在不同。那么共固定TNF- a /IFN- Y生物材料对HeLa细胞的体外抑制活性与空白组和游离组相比如何，下面将采用HE染色法观察细胞形态变化、Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率以及流式分析仪检测细胞凋亡阻滞的周期段。实施例4石腊标本制备和苏木素-伊红(Hematoxyin-eosin, HE)染色
将肿瘤细胞(细胞总数为I. 2X107)用PBS缓冲液充分洗涤，在IOOOrpm下离心lOmin，将收集到I. 5ml的塑料离心管中，10%中性缓冲甲醛固定液固定12h，80%こ醇加少许伊红上色lmin，各级こ醇(95 %、95 %、100 %,100%,100%)脱水15min，ニ甲苯透明道各IOmin,浸蜡三次各30min，取出塑料离心管冷却后，用手术刀将塑料离心管切开取出蜡块，取最大面包埋于蜡模中。3 μ m连续切片。切片常规用ニ甲苯脱蜡，经各级こ醇至水洗ニ甲苯(I、II)各5min，经无水こ醇脱水2min后，再经体积分数95%、80%、75%的こ醇各lmin，然后用蒸馏水洗2min ;苏木素染色5min,自来水洗Imin ;盐酸こ醇分化30s ；自来水浸泡15min或温水(约50°C ) 5min ；置伊红液2min;常规脱水、透明、封片；体积分数95%的こ醇脱水各lmin，无水こ醇脱水lmin，然后在ニ甲苯石碳酸(3 I)中浸lmin，两道ニ甲苯透明各lmin，最后用中性树脂封固。将相同密度(5X 105个/ml)的HeLa细胞作用在不同的生物材料3d后，HE染色后，光学显微镜(IOOOX)下观察空白组、游离TNF-α/IFN-Y (20ng/ml)组、共固定TNF-a/IFN-y (20ng/ml)组细胞形态，细胞核呈蓝黑色，胞浆呈红色，从图4(A、D、G)可看出，未经药物处理的HeLa细胞保持原有的生长状态细胞核完整，染色均匀，细胞膜完好，胞核呈椭圆形，核仁位于核中央，清晰可见；图4(B、C、E、F、H、I)中HeLa细胞均被游离药物或者共固定药物处理过，凋亡状态的细胞(用红色箭头标记)比例明显增多，单个散在分布，细胞变圆，变小，细胞核固缩、碎裂，染色加深，集聚等凋亡征象，染色体被染成深蓝色或蓝黑色，细胞膜皱褶，卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体，细胞膜的连续性破坏，可见细胞凋亡形态学变化。图4(A-I)有个别细胞，呈均质红染的无结构物质，核染色消失，为坏死细胞，这是由于细胞坏死时细胞膜通透性増加，细胞膜破裂，因此细胞不完整，溶酶体膜破裂，使周围组织坏死，呈均质红染的无结构物质，核染色消失；另外，从三组空白图4(A、D、G)可以看出未经药物处理的HeLa细胞在不同材料(聚苯こ烯、聚酯型聚氨酯、聚醚型聚氨酯)作用3d后形态学变化也存在一定的差异，三组空白中也存在凋亡的细胞，除了细胞本身的自然凋亡，也有可能是生物材料诱导细胞凋亡。实施例5Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡情况将每孔的培养液分别吸取到IOml的玻璃离心管，再加入胰酶到培养板上，消化贴附在培养基板上的细胞。将消化完的溶液移到离心管中与前面的培养液混合，在1500rpm的转速下离心5min。倒掉上清液，调整细胞浓度为5X105 I X IO6个/ml，取Iml细胞，1500rpm,4°C离心IOmin,弃上清；加入Iml冷的PBS,轻微震荡使细胞悬浮，IOOOrpm,4°C离心lOmin，弃上清(重复3、4次);将细胞重悬于200 μ I Binding Buffer ;加入10 μ IAnnexin V-FITC和5μ I ΡΙ，轻轻混匀，避光室温反应15min或4°C反应30min ;加入300μ1Binding Buffer ;在Ih内上机检测。通过Annexin V-FITC/PI双染法定量检测三种表面改性的生物材料对HeLa细胞的诱导凋亡率，如图5所示，在相同的作用时间(3d)和相同的TNF-a/IFN-γ浓度(20ng/ml)作用下,三种材料聚苯こ烯PSt、聚酯型(polyester)TPU、聚醚型(polyether)TPU空白対照的凋亡率最低，平均分别是为14. 3%U9. 2%,23. 7% ;游离药物组三种材料的平均凋亡率依次为28. 8%,38. 3%,57. 2%，对应的共固定TNF-a /IFN-Y材料实验组诱导细胞平均凋亡率依次是42. O %、47. 3 %、45. 6 %。为了方便比较，我们将数据进行处理，转换成柱形图6进行探讨。从柱形图6三组空白对照不同的凋亡率可推測，生物材料本身存在诱导细胞凋亡的效果，这与前人文献的报导相吻合，且具有材料特异性，本文研究的三种生物材料自发诱导HeLa细胞凋亡的效果也存在差异。从PSt (2)组和polyester TPU组可看出，在相同的作用时间3d里，共固定TNF-α/IFN-Y生物材料对诱导宫颈癌细胞凋亡效果(recycle PSt组 42. 0%、polyester TPU 组 47. 3%)比游离 TNF-a/IFN-Y 组(recycle PSt 组 28.8%、polyester TPU 组 38. 3 % )和空白对照组(recycle PSt 组 14. 3 %、polyester TPU 组
19.2%,)明显，而polyether TPU组中，在相同的作用时间3d里，共固定TNF-a/IFN-Y生物材料对诱导宫颈癌细胞凋亡效果(45.6% )比空白对照组(23.7% )高，但效果不如游离TNF- a /IFN- Y组(57. 2% )明显，由此可见，不同生物材料共固定TNF- a /IFN- Y后在相同的条件下，对HeLa细胞的诱导凋亡效果存在一定的差别，其中，三种共固定TNF-a / IFN-y生物材料中，以共固定聚酯型(Polyester)TPU促进HeLa细胞凋亡的效果最为明显。另外从回收利用的共固定聚苯こ烯PSt组看，与实验室前期一次利用的数据[15，44]对比，诱导细胞凋亡率下降34.6%，但仍有42.0%的细胞凋亡率，亦属可观，反映了光化学固定法是ー种比较理想的将抗癌药物与生物材料相结合的表面改性方法，同时，共固定TNF-α /IFN-y具有高效的抑癌效率。实施例6流式细胞仪检测细胞周期游离及共固定化细胞因子诱导HeLa细胞不同时间后，分别用O. 25% (W/V)胰蛋白酶消化，4°C，1000r/min离心5_10min，收集细胞，弃上清。分别加入4°C预冷PBS (-)各3ml漂洗沉淀，2次，4°C，1000r/min离心5min，彻底去上清。然后分别加入lml-20°C预冷的75%こ醇，轻微震荡使细胞悬浮，_20°C过夜固定。測定前离心除去こ醇，以PBS洗涤沉淀一次。加入100 μ g/ml的无DNA酶污染的RNA酶(RNase A)消化30min离心，加入PI染料4°C避光染色Ih后，上机检测。图7是HeLa细胞在共固定化20ng/ml TNF- a /IFN- Y的生物材料(PSt⑵、聚酯型(polyester) TPU、聚醚型(polyether) TPU)与可溶性20ng/ml细胞因子的生物材料诱导3d后及3d空白对照通过流式细胞仪测出的DNA含量直方图。这是紧接Annexin V-FITC/PI双染检测HeLa细胞与共固定生物材料作用效果后的进ー步检测，通过荧光素如PI、Hoechst等亲DNA的特性，分析悬浮细胞中DNA含量，针对凋亡细胞的周期进行定量分析。由于凋亡细胞的核改变，造成各种荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。因此，这种DNA可染性的降低被认为是凋亡细胞的标志之一。PI染色检测凋亡的原理主要是通过PI与细胞核DNA结合，測定细胞内DNA含量。在固定的细胞中加入一定量的PI染液，细胞所含的DNA量越多，流式检测到的荧光信号就越强，坐标图上细胞的横坐标就越大。亚二倍体峰的出现，实际上是由于细胞凋亡时DNA含量低于正常细胞，使其直方图上表现为ー个荧光強度比正常细胞要小的峰(亚Gl峰)，即凋亡细胞特有的峰。从图7(A-I)中，都可以看到亚Gl峰以及明显的Gl峰，回收的共固定化TNF-α/IFN-Y聚苯こ烯对HeLa细胞仍有明显的阻滞作用。将数据用origin软件将其转换成柱形图，方便比较。从图8中可以直观的看出样品中各细胞周期的具体情况。图8-A和图8-B显示，共固定TNF-α/IFN-Y聚苯こ烯(recycle)和聚酯聚氨酯相比空白对照(前者72.9%，后者76. 1% )主要将细胞凋亡阻滞在Gl期(前者74.8%，后者78.3% )，共固定TNF-a/IFN-y聚醚聚氨酯细胞阻滞在Gl期含量略微比空白组高，实验室前期工作也显示，共固定TNF- a /IFN- Y聚苯こ烯同样主要将细胞凋亡阻滞在Gl期，由此掲示出不同高分子材料经光固定化细胞因子后具有类似的周期调控机理(主要阻滞在Gl期)。细胞周期Gl期是ー个生长期，在这ー时期主要进行RNA和蛋白质的生物合成，并且为下阶段S期的DNA合成做准备，如合成各种与DNA复制有关的酶，线粒体、核糖体等都增多了，内质网在更新扩大，来自内质网的高尔基体、溶酶体等也增加了，HeLa细胞的2个中心粒也彼此分离并开始复制，为S期储备物质和能量，共固定TNF- a /IFN- Y将细胞凋亡阻滞在Gl期，体现出高分子载体药物的优越性。在共固定聚酯聚氨酯材料组中，游离细胞因子诱导的S期细胞相对含量(23. 8% )较空白对照(19.1%)的高，Gl期阻滞(共固定组73. 5%，空白组76. 1% )降低，可看出游离状态TNF- a /IFN- Y与聚酯聚氨酯材料结合后主要将细胞凋亡阻滞在S期，说明游离细胞因子诱导HeLa细胞凋亡的作用机理可能不同于共固定细胞因子，而在共固定聚醚聚氨酷材料组中，可溶性细胞因子诱导的Gl期细胞相对含量(83. 1% )较空白对照(75. 7% ) 的高，S期(共固定12. 5%，空白18. 1% )降低，可看出游离状态TNF-α/IFN-Y与聚醚聚氨酯材料结合后主要将细胞凋亡阻滞在Gl期，由此可见，游离TNF- a /IFN- Y诱导HeLa细胞凋亡的作用机理可能存在材料特异性。
统计学方法所有数据均用X土S表示，用spsslO. O统计软件进行方差统计。
权利要求
1.一种共固定化细胞因子，其特征在于包括聚氨酯和偶联在聚氨酯上的细胞因子，所述细胞因子为TNF- a和IFN- y。
2.根据权利要求I所述的共固定化细胞因子，其特征在于所述聚氨酯为聚酯型聚氨酯或聚醚性聚氨酯。
3.权利要求I或2所述共固定化细胞因子的制备方法，其特征在于包括如下步骤(I)将摩尔比为I 10 10 I的TNF-a和IFN-Y分别加入含N-琥珀亚酰胺的二甲基酰胺/PBS溶液中，冰浴条件下搅拌反应，反应完毕后分别离心，得到光活性TNF- a和IFN- y，冷冻干燥；(2)以培养板孔径为标准，在聚氨酯薄膜上裁剪出圆形小膜，经消毒后贴附于培养板孔内，将光活性TNF-a和IFN-Y混合加到培养板内聚氨酯薄膜上，避光干燥，经光固定化后，用PBS洗板，培养板孔内即为共固定化细胞因子。
4.根据权利要求3所述共固定化细胞因子的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述TNF- a和IFN- y的摩尔比为I : I。
5.根据权利要求3所述共固定化细胞因子的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述二甲基酰胺/PBS溶液的pH为7. 4，二甲基酰胺和PBS的体积比为4 I，所述N-琥珀亚酰胺与TNF-a和IFN-Y的摩尔比为10 I以上。
6.根据权利要求3所述共固定化细胞因子的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述冰浴温度为0 10°C，搅拌时间为24 96h。
7.根据权利要求3所述共固定化细胞因子的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述光活性TNF-a和IFN-Y的总量为20ng/cm2。
8.根据权利要求3所述共固定化细胞因子的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述光固定化是用15 120W紫外灯在2 15cm距离处照射IOs 30min。
9.根据权利要求3所述共固定化细胞因子的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述用PBS反复洗板的次数为20次以上。
10.权利要求I或2所述共固定化洗板因子在制备预防或治疗宫颈癌的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种共固定化细胞因子及其制备方法和应用。本发明共固定化细胞因子包括聚氨酯和偶联在聚氨酯上的细胞因子，所述细胞因子为TNF-α和IFN-γ。本发明共固定化细胞因子是通过光化学偶联法将细胞因子固定在聚氨酯上。本发明共固定化细胞因子可以使TNF-α和IFN-γ发挥协同作用，具有高效诱导细胞凋亡的特性，而且使用聚氨酯作为载体材料，由于聚氨酯的生物相容性极好，可生物分解吸收，具有缓释、高效、长效、成本低等优点，用于制备治疗或预防宫颈癌的药物，市场前景广阔。
文档编号A61K38/19GK102675464SQ20101019993
公开日2012年9月19日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者关燕清, 刘俊明, 郑哲 申请人:华南师范大学