荧光成像的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属分析化学领域，具体地说是杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、r成像 的方法。
【背景技术】
[0002] 活细胞成像技术是生命科学领域重要的研宄手段，可以解释活细胞中的多种生命 和生理现象。随着生命科学的发展，对细胞内的活性物种、细胞信号传导及细胞凋亡等方面 的信息研宄越来越深入。美国加州大学戴维斯分校（UCDavis)生物光子学科学技术中心 (CBST)的科研人员首次通过荧光标记成功地对活肿瘤细胞内部的纳米尺寸区室的运动进 行了成像。研宄成果为未来理解癌症和一大批其他疾病的分子原因和生物力学的突破进展 带来了希望，还能促进神经科学和干细胞研宄。荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分 析的一种高灵敏的可视化分析技术。目前用于活细胞成像分析的荧光探针多为有机小分子 荧光染料，在实际应用中，这些有机荧光染料分子存在着荧光寿命较短、容易猝灭、生物相 容性及稳定性差的缺点。实现长时间、实时、动态连续测定，提高可视化分析的选择性和精 确度是迫切需要解决的问题。合适的细胞内荧光探针需要具备：（1)高量子产率的发光信 号；（2)长激发波长以，避免紫外线对细胞的损伤；（3)长发射波长，避免自发性荧光干扰， 方便使用典型的荧光显微镜滤光设置；（4)被动的和不可逆转地加载到细胞内的性质。
[0003] 细胞内的小分子物种包括各种活性氧物种（单线态氧、过氧化氢、超氧负离子自 由基等)、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+及阴离子等是人们研宄关注的焦点，它们调控着细胞的诸多功 能与性质，在细胞内起着非常重要的作用，因此实现活体细胞内各种生理活性小分子物种 的实时在线动态检测对生命科学研宄有重要的价值。 锌是继铁之后在人体中含量最丰富的过渡金属，浓度范围从纳摩尔到毫摩尔，在生理 功能中的独特作用，对生物样品中锌离子的检测和成像最值得研宄。锌对维持正常细胞功 能到人体生长发育是必不可少的，同时承担中枢神经系统中信号传输功能，包括高水平的 锌离子通过刺激神经末梢大量地局部进入突触囊泡。从暂时性缺血后神经终端持续发作到 头部创伤。多离子通道和受体行为，如N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA)和a-氨基-3-轻 基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体均受锌离子释放影响。然而，关于细胞内的锌的分布、积累 和迀移知之甚少，主要的挑战在于将锌探针的体内应用。
[0004] 高灵敏、高选择的金属离子，特别是重金属/过渡金属离子在细胞环境中的检测 探针尤为关注。发光探针应用在生物医学成像上，需要评价其在细胞内的性质并优化其光 物理性能。体内外检测锌离子的荧光探针已有了长足发展。然而，一些报道的锌离子探针 水溶性差，且受其他金属离子干扰。而且目前大多数的探针建立在蒽、荧光素和喹啉等荧光 团基础上，其发射波长小于550nm，应用在细胞环境中易收到自发荧光的干扰。
[0005] 阴离子特别是氟离子探针在生物、环境和化学过程中有广泛的研宄。氟离子在化 学、工业、食品、卫生保健领域中的重要性无容置疑，但越来越多的氟应用在合成材料和生 物催化中导致其有害和不可避免的释放。在阴离子识别中，因氟离子的高水合作用焓而最 具挑战性的。在实际应用中，能分析检测氟离子的多模式比色和荧光探针很受重视。已报 道的具有去质子化功能基的氟离子探针能够有选择地分辨具有相似碱度和相似表面电荷 密度的阴离子基底。此外，大多数阴离子探针对水和电解质的兼容性问题也是需要解决的。 各种结构的选择性识别和检测阴离子的探针构建，包括氨基化合物、吡咯、尿素、硫脲、正电 荷的咪唑嗡盐，胍盐，吡啶等被用于阴离子识别。但是，具有良好光稳定性、合适的水溶性、 对细胞无毒且细胞膜通透性好、在细胞内具有强的荧光发射的氟离子探针，并用于细胞成 像的成功例子非常少。
[0006] 杯芳烃是一类新型大环化合物，以经典杯芳烃为先导已发展出氧杂杯芳烃、硫杂 杯芳烃等新型化合物。以杯芳烃为分子平台，研制出各种荧光探针化合物。杯芳烃化合物 已应用于很多领域，包括阴/阳离子配合物的传感、污染修复和催化等。杯芳烃应用在生物 体系，包括可用于模拟离子通道、模拟酶、蛋白质表面识别，用于核磁共振成像试剂平台、给 药系统、固体脂质纳米粒子和抗菌剂等。杯[4]芳烃衍生物在限制细胞活性、致免疫性和毒 性等方面已有研宄。然而，在细胞摄取及细胞命运过程中没有相关报道。通过杯[4]芳烃 荧光衍生物探针可方便地用于研宄摄取和定位细胞器，为研宄和开发杯[4]芳烃药物和药 物传输系统提供有用的信息。
[0007] 目前报道的杯芳烃荧光探针文献不超过百篇，能应用于细胞中分子/离子荧光成 像的仅有6篇。AnjaMueller等在2011年报道了利用一种阳离子荧光标记的杯[4]芳烃， 用于细胞中溶酶体成像；RakeshK.Pathak等在2012年报道了一种含亚氨基的三唑基-杯
[4]芳烃结构的Zn2+荧光探针，利用探针-Zn2+配合物实现对活性HeLa细胞中组氨酸和半胱 氨酸的荧光成像。同年他们还报道了利用该杯芳烃_Cd2+配合物用于细胞中半胱氨酸的荧 光成像，但都是基于焚光猝灭成像，即焚光影像消失；RakeshKumarPathak等于2013年报 道了的双喹啉修饰的硫杂杯[4]芳烃荧光探针，应用于细胞中Fe3+荧光成像；2008年Ruth Lalor等报道了 4-氯-7-硝基-2, 1，3-苯并氧杂恶二唑（NBD-C1)修饰的杯[4]芳烃荧光 探针，研宄了探针对仓鼠细胞标记性能。除此之外，在硫杂、氧杂杯芳烃荧光探针中，能用于 活性细胞荧光染色的鲜有报道，能同时实现对细胞中微量Zn2+和!^荧光成像的方法未见报 道。杯芳烃荧光探针应用于细胞研宄的最大挑战在于必须具备很好的水溶稳定性和很好的 细胞渗透性，同时对细胞无毒性，才具有应用于细胞成像试剂的基本条件。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于利用两种硫杂杯[4]芳烃荧光探针对Zn2+和的选择性、高灵 敏荧光增强的检测识别作用，研宄出能高选择、高灵敏地对活体细胞中微量Zn2+和F1勺荧 光染色和成像方法。
[0009] 本发明杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、r成像的方法，分别以1，3-交 替-5, 11，17, 23-四叔丁基-25, 27-二[(7-羟基-8-香豆素亚氨基）乙氧基]-26, 28-二 (2-甲氧基乙氧基）硫杂杯[4]或1，3-交替-5, 11，17, 23-四叔丁基-25, 27-二[(7-羟 基-8-香豆素亚氨基）乙氧基]-26, 28-硫杂杯[4]冠-5,简称探针1、探针2,化学结构式 为：
【主权项】
1. 杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn 2+、r成像的方法，其特征是分别以1，3-交 替-5, 11，17, 23-四叔丁基-25, 27-二[(7-羟基-8-香豆素亚氨基）乙氧基]-26, 28-二 (2-甲氧基乙氧基）硫杂杯[4]或1，3-交替-5, 11，17, 23-四叔丁基-25, 27-二[(7-羟 基-8-香豆素亚氨基）乙氧基]-26, 28-硫杂杯[4]冠-5,简称探针1、2,化学结构式为：
作为细胞内微量Zn2+、r的荧光成像探针，探针与活性细胞相容，能渗透到细胞内，通过 探针1、探针2分别对细胞内Zn2+或F染色后，用荧光倒置显微镜检测出清晰的蓝色荧光细 胞图像，探针1、探针2是活细胞中Zn 2+、r的荧光成像试剂。
2. 根据权利要求1所述的杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn 2+、r成像的方法，其特征 是分别用探针1、探针2对细胞内Zn2+进行染色和成像的具体方法为：（1)活性细胞培养： 活性细胞经复苏接种于含10%胎牛血清和含1%双抗的培养基（RPMI 1640)中，在37°C，5% CO2及饱和湿度为100%的培养箱中培养、传代，接种于12孔板中，密度约为2X 10 4个/ml ; (2)探针对细胞染色：将步骤（1)细胞浸入10 ymol ? I71探针1或2的培养基（90%培养 基，9% H20，1% THF，v/v)混合溶液中，培养箱中孵育30 min，用新鲜培养基清洗细胞，荧光 显微镜下明场和暗场拍照；（3)细胞内探针对Zn2+染色：将上述步骤（2)中经探针1或2染 色后的细胞再浸入含10 U mol Zn2+的培养基溶液，培养箱中孵育30 min，用新鲜培养 基清洗细胞，荧光显微镜下暗场拍照，细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。
3. 根据权利要求1所述的杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn 2+、r成像的方法，其特征 是分别用探针1、探针2对细胞内进行染色和成像的具体方法为（1)活性细胞培养：活性 细胞经复苏接种于含10%胎牛血清和含1%双抗的培养基（RPMI 1640或高糖DMEM)中，在 37°C，5% CO2及饱和湿度为100%的培养箱中培养、传代，接种于12孔板中，密度约为2 X 10 4 个/ml ;(2)探针对细胞染色：将步骤（1)细胞浸入10 ymol吨4探针1或2的培养基（90% 培养基，9% H20，1% THF，v/v)混合溶液中，培养箱中孵育30 min，用新鲜培养基清洗细胞， 荧光显微镜下明场和暗场拍照；（3)细胞内探针对r染色：将上述步骤（2)中经探针1或2 染色后的细胞再浸入含50 y mol吨4 r的培养基溶液，培养箱中孵育60 min，用新鲜培养 基清洗细胞，荧光显微镜下暗场拍照。
4. 按照权利要求1、2或3所述的杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn 2+、r成像的方法， 其特征是在对细胞染色成像中，探针1、探针2以及Zn 2+、r都能渗透到活体细胞内，细胞呈 圆滑饱满状，与细胞具有良好的相容性，在24小时内未见细胞凋亡，对细胞无毒性；探针与 细胞染色后荧光显微镜不能拍到细胞的荧光影像；而经探针染色后再分别与Zn 2+或F离子 二次染色后，荧光显微镜检测到清晰的蓝色荧光细胞分布，拍到清晰的细胞轮廓荧光影像。
5.按照权利要求2或3所述的杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn 2+、r成像的方法，其 特征是所用的细胞为活性人体癌细胞：PC3细胞为人体前列腺癌细胞，HeLa细胞为人体子 宫颈癌细胞；试剂为分析纯和生化试剂，水为二次蒸馏水或生理盐水；拍照设备为荧光倒 置相差显微镜，在激发波长范围为330~385nm的蓝色通道激发下，观察到细胞呈现清晰的 蓝色荧光影像。
【专利摘要】本发明建立了一种杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法，利用两种选择性键合Zn2+、F-的硫杂杯[4]芳烃荧光探针，化学名称分别为：1,3-交替-5,11,17,23-四叔丁基-25,27-二[（7-羟基-8-香豆素亚氨基）乙氧基]-26,28-二（2-甲氧基乙氧基）硫杂杯[4]和1,3-交替-5,11,17,23-四叔丁基-25,27-二[（7-羟基-8-香豆素亚氨基）乙氧基]-26,28-硫杂杯[4]冠-5，分别作为人体活性癌细胞内微量Zn2+、F-的荧光成像试剂，探针与活性细胞相容，能渗透且无毒性。通过探针1、2分别对细胞内Zn2+、F-染色后，用荧光倒置显微镜检测拍摄到清晰的蓝色荧光细胞图像。
【IPC分类】G01N21-64
【公开号】CN104819966
【申请号】CN201510132677
【发明人】曾晞, 李丽, 曾莉, 朱勤, 牟兰
【申请人】贵州大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年3月25日