一种结核分枝杆菌生物被膜检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于结核分枝杆菌致病机制及耐药性研究技术领域，具体涉及一种利用Sytox green/Sytox orange检测结核分枝杆菌生物被膜方法。
【背景技术】
[0002]结核病是一种古老的传染病，是由结核分枝杆菌引起的一种人兽共患、慢性、消耗性疾病。目前结核病是仅次于艾滋病的全球三大传染性疾病之一。结核病的最常发病部位为肺部，可通过空气传播。随着二十世纪四十年代一系列抗结核药物的出现，结核病得到有效控制，但是耐药菌株随之出现，近年来又出现多耐药菌株、泛耐药菌株，加之部分患者混合感染有艾滋病，导致结核病感染率、发病率和死亡率呈逐年上升趋势。所以近年来结核分枝杆菌的致病机制以及耐药性的研究成为热点。
[0003]在自然环境中细菌以浮游或者生物被膜两种形式存在，细菌生物被膜是指细菌附着于惰性或者活性实体的表面繁殖分化并分泌一些多糖基质将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物。大量研究证明，结核分枝杆菌可以形成生物被膜，且生物被膜的形成与免疫逃避有密切联系，并可以显著增强结核分枝杆菌的耐药性，不同结核分枝杆菌的成膜能力与其耐药性成正相关。
[0004]进行结核分枝杆菌生物被膜定量检测，有助于临床和药物研究人员筛选出有效的抗结核潜在药物，为结核分枝杆菌治病机制以及耐药性研究奠定基础。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了更精确地研究结核分枝杆菌的成膜能力和耐药性，而提供一种结核分枝杆菌生物被膜检测方法。
[0006]—种结核分枝杆菌生物被膜检测方法，它包括:
1)PBS洗涤结核分枝杆菌生物被膜；
2)制备Sytoxgreen PBS溶液，加入生物被膜，涡旋震荡，制备悬液，避光孵育；
3)用酶标仪检测悬液；
所述的酶标仪测悬液，激发波长/发射波长分别为485nm/535nm ；
所述的 Sytox green PBS 溶液是用 PBS 5001 倍稀释 Sytox green ；
所述的避光孵育时间为lOmin。
[0007]本发明提供了一种结核分枝杆菌生物被膜检测方法,采用Sytox green/Sytoxorange荧光染色方法，用酶标仪检测悬液，进行结核分枝杆菌生物被膜检测，检测方法步骤简单，对仪器的要求低；能在短时间内，检测结核分枝杆菌生物被膜的生长情况，得到的生长曲线具有良好的线型关系。可以对生物被膜进行更为精准地定量检测，且较银染等其他染色方法更加快捷；有助于临床和药物研究人员筛选出有效的抗结核潜在药物，为结核分枝杆菌致病机制以及耐药性研究奠定基础。
【附图说明】
[0008]图1结核分枝杆菌生物被膜生长14天的照片；
图2结核分枝杆菌生物被膜生长21天的照片；
图3结核分枝杆菌生物被膜生长28天的照片；
图4结核分枝杆菌生物被膜生长35天的照片；
图5结核分枝杆菌生物被膜生长42天的照片；
图6结核分枝杆菌生物被膜结晶紫定量生长曲线图；
图7结核分枝杆菌生物被膜Sytox green定量生长曲线图。
[0009]实施例1结核分枝杆菌生物被膜的培养
参照文献(Anil K.0jha etc, Growth of Mycobacterium tuberculosis b1filmscontaining free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria)在 50ml 灭菌血清瓶中进行结核分枝杆菌生物被膜培养，培养8瓶。具体操作如下:a.将结核分枝杆菌标准株单菌落接入还有150ml 7H9B培养基的锥形瓶中，150rpm/min摇动培养I周，生长至对数期；b.用紫外分光光度计测菌液的0D600吸光度值为1.1，向10份菌液中加入I份新鲜7H9B培养基，测0D600吸光度值至0.9，符合0D600值为0.7-1.0 ；c.分装15ml苏通培养基至灭菌血清瓶中，向瓶中加入步骤b中0.5ml稀释好的菌液，拧紧瓶盖，37度静置培养。
[0010]实施例2结晶紫染色检测结核分枝杆菌生物被膜生长不同时期的被膜产量
分别在第14天，第21天，第28天，第35天，42天取I瓶生物被膜进行结晶紫染色定量，方法如下:a.用微量移液器将生物被膜下面的培养基吸干，用2ml PBS轻轻洗2次，将浮游菌洗掉。b.在生物安全柜中50摄氏度干燥5min后，将Iml 1%结晶紫溶液滴至生物被膜上，孵育lOmin。c.将生物被膜用3ml去离子水漂洗后，13000g离心5min，弃上清，重复3次，d.加入2ml 95%乙醇，孵育lOmin，用移液器反复吹打，涡旋震荡。e.用B1-RadSmartSpec Plus分光光度计分别测步骤d.悬液A570nm的吸光度读数，每个样本测7次，求平均值，做生长曲线图(见图6)。结果表明，在生物被膜开始培养5周内，结核分枝杆菌生物被膜一直呈生长状态。
[0011]实施例3 Sytox green/Sytox orange染色检测结核分枝杆菌生物被膜生长不同时期的被膜产量
1.分别在第14天,第21天,第28天,第35天，42天取I瓶生物被膜进行Sytox green染色定量，方法如下:a.用微量移液器将生物被膜下面的培养基吸干，用2ml PBS轻轻洗I次，将浮游菌洗掉。b.加入用PBS 5001倍稀释的Sytox green 5ml至生物被膜上，反复吹打后，避光孵育lOmin。c.采用Tecan infinite 200 PRO,悬液分别在激发波长/发射波长分别为485nm/535nm的读数，每个样本重复测9次，求平均值，做生长曲线图(见图7)。结果表明，在生物被膜开始培养5周内，结核分枝杆菌生物被膜一直呈生长状态,且随着时间的延长生长速度变缓。测得的生长曲线可以如实反映生物被膜的生长情况。
[0012]具有实验时间耗时少，步骤简单的优势。本发明技术更适合应用于结核生物被膜产量的测定。
【主权项】
1.一种结核分枝杆菌生物被膜检测方法，它包括: 1)PBS洗涤结核分枝杆菌生物被膜； 2)制备Sytoxgreen PBS溶液，加入生物被膜，涡旋震荡，制备悬液，避光孵育； 3)用酶标仪检测悬液。
2.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌生物被膜检测方法，其特征在于:所述的酶标仪检测，激发波长/发射波长分别为485nm/535nm。
3.根据权利要求1或2所述的一种结核分枝杆菌生物被膜检测方法，其特征在于:所述的 Sytox green PBS 溶液是用 PBS 5001 倍稀释 Sytox green。
4.根据权利要求3所述的一种结核分枝杆菌生物被膜检测方法，其特征在于:所述的避光孵育时间为lOmin。
【专利摘要】本发明提供了一种结核分枝杆菌生物被膜检测方法，采用Sytox green/Sytox orange荧光染色，用酶标仪检测悬液，进行结核分枝杆菌生物被膜检测，检测方法步骤简单，对仪器的要求低；能在短时间内，检测结核分枝杆菌生物被膜的生长情况，得到的生长曲线具有良好的线型关系。可以对生物被膜进行更为精准地定量检测，且较银染等其他染色方法更加快捷；有助于临床和药物研究人员筛选出有效的抗结核潜在药物，为结核分枝杆菌致病机制以及耐药性研究奠定基础。
【IPC分类】G01N21-64, G01N1-30
【公开号】CN104819965
【申请号】CN201410779996
【发明人】于录, 杨志强, 宾文, 范君文, 庞旭东, 汪杨, 申凤鸽, 张巧丽, 王超, 安雅男
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2014年12月17日