专利名称：一种尖孢镰刀菌芝麻专化型致病力的鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种采用室内纸钵培养芝麻幼苗鉴定并评价尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株致病力的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
尖孢镰刀菌芝麻专化型是导致芝麻发生枯萎病害的一种致病性真菌，对芝麻生长危害严重。在我国芝麻生产中，由该菌引起的枯萎病常年发病率在15%左右，严重时可达 30%以上，对产量和品质影响较大。为探明尖孢镰刀菌芝麻专化型病原菌致病特征，我们开展了芝麻枯萎病菌株收集工作，并建立了我国尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株库。开展菌株库主要菌株的致病性鉴定研究是阐明芝麻枯萎病病原菌致病机理的关键和基础。但是由于芝麻病害研究基础薄弱，目前为止尚未见尖孢镰刀菌芝麻专化型病原菌致病力室内鉴定和评价方法的文献报道，国内外对芝麻枯萎病抗性的鉴定也仅采用大田病圃进行。利用菌饼侵染芝麻萌发种子鉴定芝麻枯萎病病原菌的方法在我国已有专利申报，但由于芝麻胚根发育慢、植株直立生长易受试验条件影响、材料可持续期短以及接菌不均一等问题，加上尖孢镰刀菌具有侵染周期长、发病较慢的特点，该方法不适宜用来鉴定和评价尖孢镰刀菌芝麻专化型病原菌的致病力。此外，由于芝麻根系不发达，伤根处理对植株生长影响过大等因素， 试验也证明常用的灌根接菌法、伤根接菌法、胚根接菌法等方法不适合于芝麻枯萎病病原菌致病力评价，更无法很好地用于病原菌遗传多样性分析及生理小种鉴定研究。研究并确定尖孢镰刀菌芝麻专化型病原菌致病性鉴定评价方法已成为芝麻枯萎病研究的瓶颈问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种尖孢镰刀菌芝麻专化型致病力的鉴定方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种尖孢镰刀菌芝麻专化型致病力的鉴定方法，通过以下步骤实现(1)种子预处理选取分别具有抗病和感病的2个芝麻品种的健康饱满种子，清水冲洗后，在超净工作台上，先用70%酒精处理30s，无菌水冲洗1次；然后用3%次氯酸钠处理15min，用无菌水冲洗3-5次，之后在120r/min，25°C条件下振荡过夜，以催芽使种子露白；(2)种子接菌培养取分生孢子悬浮液，倒入2倍体积的无菌蛭石中混合拌勻，然后按1 3的体积比例将拌有病原菌的蛭石与无菌土混勻，分装，将步骤(1)已露白的无菌芝麻种子播种在纸钵中，每钵均勻摆放10粒，每个品种种植3个重复，用拌菌的混合土壤轻覆种子表面，放至人工气候箱，250C，12h/天光暗交替培养，湿度保持在70-90 % ；以相同体积无菌水为对照，其他培养条件相同；(3)进行致病性鉴定。步骤( 分生孢子悬浮液制备方法为取出保存的尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株接种到PDB液体培养基中，在160r/min，28°C条件下摇菌3d，用两层无菌纱布过滤，制备出尖孢镰刀菌分生孢子悬浮液，用无菌水稀释配制成浓度为1 X IO6个/mL的分生孢子悬浮液， 以备接种。
步骤O)中分生孢子悬浮液的浓度为1 X IO6个/mL。
步骤C3)具体步骤为1)接菌后定期检查每钵幼苗的出苗及生长情况，确保幼苗生长环境正常；幻接菌第21天后调查每钵幼苗的发病情况，记录发病株数及发病等级。
本发明的方法在拌菌处理过程中，利用蛭石松散吸水性强不结块的特点，使用灭菌蛭石与一定体积菌液混合，通过搅拌可使菌液均勻的分布于蛭石颗粒表面，与无菌土混合后能够保证病菌孢子均勻地混合到无菌土壤中，使菌种在土壤中均勻分布，确保致病性测定可靠、准确；另外，使用经灭菌催芽后的种子进行试验，避免因种子萌发不整齐而导致的试验误差采用本发明的方法在播种前进行土壤接菌处理，不对芝麻根系进行伤根处理， 保证芝麻幼苗生长处于自然状态，避免了中期接菌操作给植株造成的机械损伤、水渍胁迫等问题的出现，确保研究结果可靠、准确；本发明的方法采用室内人工气候箱培养幼苗，鉴定周期为3周，能够满足尖孢镰刀菌芝麻专化型的侵染时期，可确保病菌侵染过程表现完整。本发明的方法简便易行，植株发病结果稳定，重复性好，试验结果可靠，可准确地反映尖孢镰刀菌芝麻专化型在不同芝麻品种上的致病性差异，亦可反映菌株间的致病力差异。
芝麻幼苗枯萎病等级划分标准0级长势良好无病症，地上部茎叶正常，根茎部维管束正常。I级病株茎叶萎蔫，根茎部维管束红褐色。II级病株叶片干枯至全株死亡。
病情指数的计算公式为
病情指数=Σ (发病等级X相应发病株数)/总株数
该指数数值越大，表明该病菌的致病性越强。
致病力评价根据病情指数判定每个菌株致病性有无，以及致病力等级。尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株致病力等级划分为四级0级(无致病力)平均病指为0 级(弱致病力)平均病指0. 1 20 ；2级(中等致病力)平均病指20. 1 35 ;3级(强致病力)平均病指35. 1 100。
图1是将培养好的分生孢子悬浮液倒入无菌蛭石中拌勻；
图2是将拌菌后的蛭石与无菌土混勻；
图3是将拌勻的菌土分装至纸钵中；
图4是将灭菌后催芽露白的种子播于接有尖孢镰刀菌的无菌土中；
图5是接菌3天后芝麻出苗情况；
图6是接菌3周后2个对照生长情况，图6Α为豫芝11 (抗病)，图6Β为冀9014 (感病)；
图7是接强致病力菌株3周后的处理发病情况，图7Α为豫芝11 (抗病)，图7Β冀 9014(感病)；
图8是接中等致病力菌株3周后的处理发病情况，图8A为豫芝11 (抗病)，图8B 为冀9014(感病)；
图9是接弱致病力菌株3周后的处理发病情况，图9A为豫芝11 (抗病)，图9B冀 9014(感病)。
具体实施例方式实施例1本实施例为尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株No. HSFO 10012的致病力鉴定及评价方法1)PDB培养基制备称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂，煮沸 20-30min,能被玻璃棒戳破即可，用四层纱布过滤至烧杯中，加入葡萄糖20g，补足水分至 IOOOml，搅拌混勻，分装于三角瓶中，121 °C灭菌20分钟；2)No. HSFO 10012菌株分生孢子悬浮液制备取出保存的No. HSFO10012菌株，挑取少量菌液接种到PDB液体培养基中，在160r/min，条件下振荡培养3d，然后用两层无菌纱布过滤，制备出No. HSFO 10012菌株分生孢子悬浮液，用无菌水配制成浓度1 X IO6个/ mL分生孢子悬浮液，以备接种；3)种子预处理选取豫芝11和四川荣县黑芝麻2个芝麻品种的饱满健康种子，在超净工作台上，先用70%酒精处理30s，再用3%次氯酸钠处理15min，然后用无菌水冲洗 3-5次，之后在120r/min，25°C条件下振荡过夜，以催芽使种子露白；4)种子接菌培养取一定体积的No. HSFO 10012菌株分生孢子悬浮液(浓度为 IX IO6个/mL)，倒入2倍体积的无菌蛭石中混合拌勻(图1)，然后按1 3的体积比例将拌有病原菌的蛭石与无菌土混勻(图2)，分装于各纸钵中(图3)，将已露白的无菌芝麻种子播种在纸钵中(图4)，每钵均勻摆放10粒，每个品种种植3个重复，用拌菌的混合土壤轻覆种子表面，放至人工气候箱，250C，12h/天光暗交替培养，湿度保持在90 %，以相同体积无菌水为对照，其他培养条件相同；5)菌株致病性调查接菌后定期检查每钵幼苗的出苗及生长情况(图5)，确保幼苗生长环境正常；6)接菌第21天后调查每钵幼苗的发病情况(图7)，记录发病株数及发病等级，计算病情指数。数据分析显示，对于豫芝11品种，该菌的平均病情指数为38. 3 ；对于冀9014 品种，该菌的平均病情指数为73. 3 ；7)致病力评价尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株致病力等级划分为四级0级(无致病力)平均病指为O ;1级(弱致病力)平均病指0. 1 20 ；2级(中等致病力)平均病指20. 1 35 ;3级(强致病力)平均病指35. 1 100。根据致病力划分标准，No. HSFO 10012菌株对于上述抗病品种和感病品种均属于强致病力菌株。
具体实施例方式实施例2为尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株No. HSFO 10008的致病力鉴定及评价方法1)PDB培养基制备称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂，煮沸 20-30min,能被玻璃棒戳破即可，用四层纱布过滤至烧杯中，加入葡萄糖20g，补足水分至 1000ml，搅拌混勻，分装于三角瓶中，121 °C灭菌20分钟；2)No. HSFO 10008菌株分生孢子悬浮液制备取出保存的No. HSF010008菌株，挑取少量菌液接种到PDB液体培养基中，在160r/min，条件下振荡培养3d，然后用两层无菌纱布过滤，制备出No. HSFO 10008菌株分生孢子悬浮液，用无菌水配制成浓度1 X IO6个/ mL分生孢子悬浮液，以备接种；
3)种子预处理选取豫芝11和四川荣县黑芝麻2个芝麻品种的饱满健康种子，在超净工作台上，先用70%酒精处理30s，再用3%次氯酸钠处理15min，然后用无菌水冲洗5 次，之后在120r/min，25°C条件下振荡过夜，以催芽使种子露白；
4)种子接菌培养取一定体积的No. HSFO 10008菌株分生孢子悬浮液(浓度为 IX IO6个/mL)，倒入2倍体积的无菌蛭石中混合拌勻(图1)，然后按1 3的体积比例将拌有病原菌的蛭石与无菌土混勻(图2)，分装于各纸钵中(图3)，将已露白的无菌芝麻种子播种在纸钵中(图4)，每钵均勻摆放10粒，每个品种种植3个重复，用拌菌的混合土壤轻覆种子表面，放至人工气候箱，250C，12h/天光暗交替培养，湿度保持在70 %，以相同体积无菌水为对照，其他培养条件相同；
5)菌株致病性调查接菌后定期检查每钵幼苗的出苗及生长情况(图5)，确保幼苗生长环境正常；
6)接菌第21天后调查每钵幼苗的发病情况(图8)，记录发病株数及发病等级，计算病情指数。数据分析显示，对于豫芝11品种，该菌的平均病情指数为16. 7 ；对于冀9014 品种，该菌的平均病情指数为26. 7 ；
致病力评价尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株致病力等级划分为四级0级(无致病力)平均病指为O ;1级(弱致病力)平均病指0. 1 20 ；2级(中等致病力)平均病指 20. 1 35 ;3级(强致病力)平均病指35. 1 100。
根据致病力划分标准，No. HSFO 10008菌株对于上述抗病品种属于弱致病力菌株， 对于感病品种属于中等致病力菌株。
实施例3为尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株No. HSFO 10012的致病力鉴定及评价方法
1)PDB培养基制备称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂，煮沸 20-30min,能被玻璃棒戳破即可，用四层纱布过滤至烧杯中，加入葡萄糖20g，补足水分至 IOOOml，搅拌混勻，分装于三角瓶中，121 °C灭菌20分钟；
2)No. HSFO 08005菌株分生孢子悬浮液制备取出保存的No. HSF008005菌株，挑取少量菌液接种到PDB液体培养基中，在160r/min，条件下振荡培养3d，然后用两层无菌纱布过滤，制备出No. HSFO 08005菌株分生孢子悬浮液，用无菌水配制成浓度1 X IO6个/ mL分生孢子悬浮液，以备接种；
3)种子预处理选取豫芝11和四川荣县黑芝麻2个芝麻品种的饱满健康种子，在超净工作台上，先用70%酒精处理30s，再用3%次氯酸钠处理15min，然后用无菌水冲洗 3-5次，之后在120r/min，25°C条件下振荡过夜，以催芽使种子露白；
4)种子接菌培养取一定体积的No. HSFO 08005菌株分生孢子悬浮液(浓度为 IX IO6个/mL)，倒入2倍体积的无菌蛭石中混合拌勻(图1)，然后按1 3的体积比例将拌有病原菌的蛭石与无菌土混勻(图2)，分装于各纸钵中(图3)，将已露白的无菌芝麻种子播种在纸钵中(图4)，每钵均勻摆放10粒，每个品种种植3个重复，用拌菌的混合土壤轻覆种子表面，放至人工气候箱，25°C，12h/天光暗交替培养，湿度保持在80%。以相同体积无菌水为对照，其他培养条件相同；5)菌株致病性调查接菌后定期检查每钵幼苗的出苗及生长情况(图5)，确保幼苗生长环境正常；6)接菌第21天后调查每钵幼苗的发病情况(图9)，记录发病株数及发病等级，计算病情指数。数据分析显示，对于豫芝11品种，该菌的平均病情指数为6. 7 ；对于冀9014品种，该菌的平均病情指数为20. 0。致病力评价尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株致病力等级划分为四级0级(无致病力)平均病指为O ;1级(弱致病力)平均病指0. 1 20 ；2级(中等致病力)平均病指 20. 1 35 ;3级(强致病力)平均病指35. 1 100。根据致病力划分标准，No. HSFO 08005菌株对于上述抗病品种和感病品种均属于弱致病力菌株。
权利要求
1.一种尖孢镰刀菌芝麻专化型致病力的鉴定方法，其特征在于通过以下步骤实现(1)种子预处理选取分别具有抗病和感病的2个芝麻品种的健康饱满种子，清水冲洗后，在超净工作台上，先用70%酒精处理30s，无菌水冲洗1次；然后用3%次氯酸钠处理 15min，用无菌水冲洗3-5次，之后在120r/min，25°C条件下振荡过夜，以催芽使种子露白；(2)种子接菌培养取分生孢子悬浮液，倒入2倍体积的无菌蛭石中混合拌勻，然后按 1 3的体积比例将拌有病原菌的蛭石与无菌土混勻，分装，将步骤(1)已露白的无菌芝麻种子播种在纸钵中，每钵均勻摆放10粒，每个品种种植3个重复，用拌菌的混合土壤轻覆种子表面，放至人工气候箱，25°C，12h/天光暗交替培养，湿度保持在70-90% ；(3)进行致病性鉴定。
2.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌芝麻专化型致病力的鉴定方法，其特征在于步骤( 分生孢子悬浮液制备方法为取出保存的尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株接种到PDB液体培养基中，在160r/min，28°C条件下摇菌3d，用两层无菌纱布过滤，制备出尖孢镰刀菌分生孢子悬浮液，用无菌水稀释配制成浓度为1 X106f/mL的分生孢子悬浮液，以备接种。
3.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌芝麻专化型致病力的鉴定方法，其特征在于步骤O)中分生孢子悬浮液的浓度为lX106f/mL。
4.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌芝麻专化型致病力的鉴定方法，其特征在于步骤C3)具体步骤为1)接菌后定期检查每钵幼苗的出苗及生长情况，确保幼苗生长环境正常；2)接菌第21天后调查每钵幼苗的发病情况，记录发病株数及发病等级。
全文摘要
本发明涉及一种尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株对寄主芝麻致病力的鉴定方法，通过以下步骤实现(1)种子预处理；(2)种子接菌培养取分生孢子悬浮液，倒入2倍体积的无菌蛭石中混合拌匀，然后按1∶3的体积比例将拌有病原菌的蛭石与无菌土混匀，分装，将步骤(1)已露白的无菌芝麻种子播种在纸钵中，每钵均匀摆放10粒，每个品种种植3个重复，用拌菌的混合土壤轻覆种子表面，放至人工气候箱，25℃，12h/天光暗交替培养，湿度保持在80％左右；以相同体积无菌水为对照，其他培养条件相同；(3)进行致病性鉴定。本发明的方法简便易行，病原菌致病性表现稳定，结果可靠，重复性好，可准确地反映尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株对芝麻幼苗有无致病力及其致病强度。
文档编号A01C1/08GK102487630SQ20111041232
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者仇存璞, 张海洋, 杜华, 苗红梅, 魏利斌 申请人:河南省农业科学院