一株具有促生作用的棘孢木霉及其培养方法与应用与流程

本发明涉及一株具有促生作用的棘孢木霉及其培养方法与应用，属于微生物
技术领域：
。
背景技术：
：木霉菌(trichodermaspp.)属于丝状真菌，适应性广，对立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)、腐霉菌(pythiumspp.)、镰刀菌(fusariumspp.)等多种土传性植物病原微生物具有较好的防治效果，在生物防治和环境保护领域具有很好的应用前景，是目前研究较多应用较广泛的生防菌之一。木霉菌可通过拮抗、重寄生、分泌抗生素等多种机制控制病原菌的侵染和病害的发生。国内外关于利用木霉菌防治植物病害，特别是根腐病、枯萎病、菌核病和纹枯病等土传病害的报道很多，且取得了较好的防治效果。目前国内对木霉菌的研究主要集中在哈茨木霉trichodermaharzianum、深绿木霉trichodermaatroviride、绿色木霉trichodermavirens、里氏木霉trichodermareesei和长枝木霉trichodermalongibrachiatum。而棘孢木霉trichodermaasperellum是2005年我国新记录的木霉菌菌种，对其开发利用尚处于起步阶段。近年来，棘孢木霉的生防机制引起国内外学者的广泛关注。夏伟等分离获得1株棘孢木霉菌株14，证实该菌株通过竞争和抗生双重作用可有效抑制立枯丝核菌菌丝生长。cotxarrem等报道棘孢木霉菌株t34能有效防治番茄枯萎病。chet&inbar证实一些木霉菌能够产生fe2+螯合物抑制植物病原菌生长。tondje等发现棘孢木霉具有防治可可黑荚病的潜力。目前，棘孢木霉作为一种微生物制剂，在农业生产中的应用效果及作用机理引起了许多学者的广泛关注及研究。如，中国专利文献cn105255949a(申请号：201510756577.x)公开了一种小规模木霉菌固态发酵方法，该方法是一种固态发酵方法。解决了现有小规模发酵木霉菌存在产孢量少，发酵后期出现自溶现象的问题。该方法虽然利用了农业废弃物，但是木霉菌对作物是否有促生效果没有涉及。中国专利文献cn105400700a(申请号：201510619895.1)提供了一种甲砜甲苯降解菌棘孢木霉的制备及对工业废水的处理方法，所述的制备方法为利用固态发酵的方法制备棘孢木霉，先将秸秆粉和水、氮源充分混合，并搅拌均匀，然后接入棘孢木霉1285，将菌种与固体基质混合均匀；室温下自然发酵，发酵基质温度超过50℃时进行翻动并通气降温；当基质中甲砜甲苯降解酶活力不再增加时即发酵结束。该方法得到的棘孢木霉能对工业废水中的甲砜甲苯进行充分降解，用于工业废水处理，是否能适用于作物有待研究。中国专利文献cn103740634a(申请号：201410003169.2)公开了一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂及其制备方法与它的用途，棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂制备方法包括耐砷活性保持培养、纯化培养、摇瓶种子培养、发酵种子培养、控制发酵与后处理等步骤。该发明棘孢木霉菌厚垣孢子明显促进土壤中砷的挥发，减少土壤中砷的总量，可以有效地修复受砷污染的土壤，但对作物促生没有任何效果。因此，研究发现新的、孢子数量高的棘孢木霉，并对作物的有很好的促生作用效果，是目前亟待解决的一个技术问题。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一株具有促生作用的棘孢木霉及其培养方法与应用。本发明的技术方案如下：一株棘孢木霉(trichodermaasperellum)木-8菌株，2015年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.11528。根据本发明，一株棘孢木霉(trichodermaasperellum)木-8的固体发酵方法，步骤如下：(1)取棘孢木霉(trichodermaasperellum)木-8接种于pda培养基中，在25℃～28℃的条件下，活化培养3-4天，制得活化菌株；(2)取步骤(1)的活化菌株接种于摇瓶种子培养液中，在温度25℃～28℃、转速120-150rpm的条件下，振荡培养24-36h，制得摇瓶种子液；(3)将摇瓶种子液按0.3～0.5％的体积百分比接种于接种于一级种子培养基中，恒温振荡培养24～36h，制得一级种子液；(4)将步骤(3)制得的一级种子液按6～10％的质量百分比接入固体发酵培养基，扩大培养96h～120h，烘干，制得棘孢木霉发酵物。根据本发明优选的，得到的棘孢木霉发酵物中基质孢子数为1×109～1×1010cfu/g。根据本发明优选的，步骤(1)中所述的pda培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1000ml，操作步骤为：将马铃薯去皮，切小块，放入烧杯中，加水煮沸30min，过滤去除马铃薯残渣，向滤液中加入葡萄糖、琼脂，融化，定容至1000ml，最后溶液121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。根据本发明优选的，步骤(2)中所述的摇瓶种子培养液，每升组分如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1l，高温高压灭菌。根据本发明优选的，步骤(3)中，所述一级种子培养基，每升组分如下：麸皮20g，玉米粉10g，硫酸铵10g，水定容至1l，ph自然，121℃、20min高温高压灭菌。根据本发明优选的，步骤(3)中，恒温培养温度为25℃～28℃，振荡频率为150～180r/min。根据本发明优选的，步骤(4)中，一级种子液的接种量为固体发酵培养基质量的8～10％。根据本发明优选的，步骤(4)中，接入一级种子液后调节固体发酵培养基含水量至55％-65％。根据本发明优选的，步骤(4)中，扩大培养温度为26～28℃。根据本发明优选的，步骤(4)中，所述烘干条件为：在温度40℃～50℃下烘干时间1h-2h。根据本发明优选的，所述的固体发酵培养基，原料重量份如下：稻壳10份、玉米秸秆30份、麸皮40份、玉米粉20份、无机盐1～3份、蔗糖0.5-1份、水55～65份。进一步优选的，所述的无机盐包括硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸亚铁，硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁与硫酸亚铁质量比为：(0.5-1)：0.5：0.25：0.003。根据本发明优选的，所述的固体发酵培养基是按以下方法制备得到：a.按质量比取稻壳、玉米秸秆、麸皮、玉米粉，混合均匀，得固体物料；b.按质量比取蔗糖、(nh4)2so4、kh2po40.5％、mgso40.25％、feso40.003％，混合均匀，得糖盐混合物；c.将步骤b中的糖盐混合物溶于水中，然后与步骤a中的固体物料按1:1.2的质量比混合均匀，ph自然；将混合好的固体培养基经过121℃、20min高温高压蒸汽灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；本发明优选的，所述稻壳、玉米秸秆采用干燥粉碎颗粒，然后过5目-10目筛。本发明的棘孢木霉固体发酵培养基以农业废弃物稻壳、玉米秸秆、麸皮、取代常规固体发酵培养基中的黄豆粉，以玉米粉为氮源，有利于棘孢木霉的生长，缩短发酵周期，避免发酵周期过长导致感染杂菌。稻壳和玉米秸秆粉分别是大米收获后的外壳以及玉米秸秆磨成的粉。一方面这些农业废弃物能够起到提高固体培养基透气性的作用，另一方面，玉米秸秆粉中含有大量的碳水化合物及蛋白质和脂肪，能够促进棘孢木霉菌体生长及孢子的产生。一株棘孢木霉(trichodermaasperellum)木-8在作物中的应用，作为微生物肥料的功能菌株，微生物肥料中棘孢木霉活菌数2～10×108cfu/g。本发明具有的有益效果：1.本发明的棘孢木霉cgmccno.11528，该棘孢木霉对作物具有明显促生作用，能够明显促进黄瓜苗生长，增加茎粗24.90％和株高63.80％，大大提高了经济效益。2.本发明的固体发酵培养基及其培养发酵物，固体发酵培养基通过加入稻壳、玉米秸秆粉、麸皮，并优化玉米粉，使其保证足够有机质的同时，也能增加固体发酵培养基质内的通气量，使棘孢木霉的生产和基质孢子数大大提高，有效基质孢子数可达1×1010cfu/g。3.本发明的固体发酵培养基的制备方法，该制备方法发酵条件适宜，生产一批次棘孢木霉发酵物周期约9～12天，能够有效缩短生产周期，使生产效率得到极大的提高。附图说明图1为本发明棘孢木霉对黄瓜苗期生长应用的效果图；图2为棘孢木霉对黄瓜生物量影响的效果图。具体实施方式下面通过实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。以下结合实施案例对本发明进行详细说明，但本发明可以有权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。以下实施例中所采用原料和设备均为市售商品，其中各种培养基按常规方法配制。液体发酵在恒温振荡器上完成，高压灭菌处理在立式高压灭菌锅内完成，固体发酵在30cm×20cm×4cm托盘内完成。棘孢木霉(trichodermaasperellum)木-8菌株的筛分：1.1土壤来源从临沂市临沭县周边经济作物种植地，采集土壤，并采用稀释平板法进行分离培养。1.2培养基1)pda配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。称取200g马铃薯，去皮洗净并切成小块，放入盛有1000ml蒸馏水的锅里。煮30min后，用大烧杯(杯口蒙上纱布)进行过滤，只留滤液并加水补足1000ml，等水沸腾时加入称量好的20g琼脂，加热至琼脂完全融化时再加入称量好的20g葡萄糖，直到葡萄糖全部溶解即可。2)twa+w配方：琼脂15-20g，蒸馏水1000ml，灭菌后倒入培养皿中，加入灭菌的剪成4-6cm的麦杆。量取1000ml蒸馏水加入锅中，沸腾时加入称取的15-20g琼脂，加热至琼脂完全融化即可。然后分装到250ml容量的三角瓶里，每瓶不超过150ml。待培养基灭菌后，倒入灭菌后的培养皿(其中加有灭菌的剪成4-6cm的麦杆)中。1.3.1土样采集采样时，每个点先去除土壤表面植被、枯枝落叶，将表层1-2cm的土层铲去然后取土，每份土样随机采集3个点，取出的各层土壤充分混匀后置入无菌取样袋中，带回实验室放于4℃保存，尽量在一个月内分离，最迟不超过3个月。1.3.3土壤真菌的分离--稀释平板法利用twa+a培养基分离：(1)称取10g(可因土样含水量的多少酌情增减)土壤样品，加入到盛有90ml灭菌水的三角瓶中，将三角瓶置于摇床上120转/分，振荡30分钟，使土壤颗粒均匀分散于蒸馏水中，得到稀释倍数为10的土壤悬浮液；(2)从中吸取1ml置入装有9ml灭菌水的试管中，为稀释倍数为102的悬浮液。(3)灭菌的水琼脂－麦秆培养基冷却至45℃左右时，加入链霉素达到最终浓度为30μg/ml，氯霉素50μl倒入培养皿凝固。(4)每皿加入300μl稀释后的土壤悬浮液，涂布均匀，每个土样重复3皿。(5)25℃生化培养箱培养1周后，体视镜及显微镜下多次观察，挑单孢到pda培养基上纯化菌种。1.3.4土壤真菌的纯化纯化过程中采用初次划线+多次纯化，初次划线即在土壤分离培养基上挑单孢，在适宜培养基上划线接种，同时要详细记录各属级物种的菌落数。接种后2-3d观察生长状况，若分离出多个不同的菌落再次挑单孢纯化，如此反复直到得到纯的目的菌落。2平板对峙培养(1)将木霉菌和供试病原菌菌种同时扩大培养，培养三天，使其生长势一致，采用平板对峙培养法，用直径5mm的打孔器取新鲜培养的木霉属真菌和病原菌的菌丝块。(2)将木霉属真菌与病原菌分别同时接入pda平板(培养皿直径9cm)，两者相距5cm，3次重复。(3)分别以病原菌和木霉属真菌在pda上的纯培养为对照，25℃恒温培养，逐日观察菌落的生长和木霉属真菌的抑制作用。(4)连续观察，待对照菌株菌丝长满培养皿时测量处理病原菌菌落直径，计算抑菌率。筛选生长速度快、抑制率高的木霉菌株作为最佳生防菌进行进一步研究。抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-对峙菌落直径)/对照菌落直径]×100％实施例1一株棘孢木霉(trichodermaasperellum)木-8菌株，2015年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.11528。固体发酵培养基制备棘孢木霉固体发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：a.按照上述质量比称取稻壳、玉米秸秆、麸皮、玉米粉，混合均匀，得固体物料；b.按照上述质量比称取蔗糖、(nh4)2so4、kh2po40.5％、mgso40.25％、feso40.003％，混合一起，得无机盐混合物；c.将步骤b中无机盐混合物溶于水中，与步骤a中固体物料按质量比1:1.2混合均匀，ph自然；将混合好的固体培养基经过121℃、20min高温高压蒸汽灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；棘孢木霉(trichodermaasperellum)木-8菌株培养方法：(1)菌种活化：将4℃保存的棘孢木霉菌种接种在pda培养基平板上，28℃培养3天，备用；(2)制备摇瓶种子液：将活化好的棘孢木霉菌种，用接种环提取一环接种于装有200ml液体种子培养基的三角瓶中，将三角瓶置于恒温振荡培养箱中，28℃，120rpm，振荡培养24h后，既得摇瓶种子液；(3)制备一级种子：将摇瓶种子液按0.3％比例接种于一级种子培养基，28℃，150rpm，搅拌培养24h后，既得一级种子液；(4)固体发酵：将培养制备好的一级种子液按照8％接种量接入经过灭菌处理的固体发酵培养基，搅拌均匀，保持物料含水量55％，温度26℃培养96h，40℃低温烘干，得到棘孢木霉发酵物。实施例2同实施例1所述的棘孢木霉(trichodermaasperellum)木-8菌株培养方法，不同之处在于：(1)菌种活化：将4℃保存的棘孢木霉菌种接种在pda培养基平板上，28℃培养4天，备用；(2)制备摇瓶种子液：将活化好的棘孢木霉菌种，用接种环提取一环接种于装有200ml液体种子培养基的三角瓶中，将三角瓶置于恒温振荡培养箱中，28℃，150rpm，振荡培养36h后，既得摇瓶种子液；(3)制备一级种子：将摇瓶种子液按0.5％比例接种于一级种子培养基，28℃，150rpm，搅拌培养36h后，既得一级种子液；(4)固体发酵：将培养制备好的一级种子液按照10％接种量接入经过灭菌处理的固体发酵培养基(由实施例1制备)，搅拌均匀，保持物料含水量65％，温度28℃培养96h～120h，50℃低温烘干，得到棘孢木霉发酵物。对比例1中国专利文献cn106434374a公开的一株棘孢木霉hd228，该棘孢木霉对镉胁迫的水稻有促生作用和解毒作用，对没有镉胁迫的水稻苗长增长率只有10％左右。试验例1棘孢木霉在促进黄瓜苗期生长应用的效果验证(一)试验处理：(1)试验作物：黄瓜(2)微生物菌剂：实施例2和实施例3制备的棘孢木霉发酵物，分别记为处理1、处理2，用9×9的塑料营养钵装入临沭土壤，将处理1、处理2的木霉发酵物拌入5cm左右的表层土中，施用量为1g/盆，土壤4kg/盆，再种植黄瓜苗。(3)空白对照：临沭土壤，不接种木霉的麸皮培养物。(二)试验方法：本试验在国家缓控释肥工程技术研究中心菌剂实验室及智能玻璃温室内进行。每盆栽种黄瓜苗1棵，共设3个处理，每个处理3个重复；处理1、处理2分别施用棘孢木霉发酵物1g/盆，对照加等量的接种木霉的麸皮培养物，待黄瓜苗生长至3-4片复叶时，挖出来，看实验效果，结果如表1和图1。表1棘孢木霉对黄瓜苗期生长应用的效果与对照组相比，棘孢木霉发酵物能够明显促进黄瓜苗生长，增加茎粗24.90％和株高63.80％，促生效果显著，大大提高了经济效益。试验例2棘孢木霉不同添加量对黄瓜生长过程中生物量的影响(一)试验处理：(1)试验作物：黄瓜(2)微生物菌剂：施用实施例2制备的棘孢木霉发酵物，施用量为0.3g/株记为处理1，施用量为0.5g/株记为处理2，施用量为1g/株记为处理3；用9×9的塑料营养钵装入临沭土壤，将处理1、处理2、处理3的木霉发酵物拌入5cm左右的表层土中，土壤4kg/盆，再种植黄瓜苗。(3)空白对照：临沭土壤，不接种木霉的麸皮培养物，施用量：1g/株。(二)试验方法：本试验在国家缓控释肥工程技术研究中心菌剂实验室及智能玻璃温室内进行。于黄瓜苗移栽定殖时穴施拌土，整个生育期只施用一次；每盆1棵苗，共设4个处理，每处理四重复；处理1、处理2、处理3分别施用棘孢木霉发酵物0.3g/株、0.5g/株、1g/株；试验于2016年3月26日定植，2016年5月19日收获，共54天；看实验效果，结果如表2和图2。表2棘孢木霉对黄瓜生物量的影响处理试验设计平均生物量g/株增产％对照不接种木霉的麸皮培养物100.62----处理1棘孢木霉发酵物0.3g/株149.1848.26处理2棘孢木霉发酵物0.5g/株155.2454.28处理3棘孢木霉发酵物1g/株155.2654.30结论：棘孢木霉菌能够促进黄瓜坐果，使营养生长提前转化为生殖生长；增产作用明显。当前第1页12