一种检测玉米赤霉烯酮的胶体金淬灭量子点免疫层析试纸条及其制备方法与流程

本发明涉及一种快速检测谷物食品中玉米赤霉烯酮的方法，特别是一种检测玉米赤霉烯酮的胶体金淬灭量子点免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术：

玉米赤霉烯酮，是一种主要是由串珠镰刀菌、三线镰刀菌、玉米赤霉等菌种产生的酚的真菌毒素。玉米赤霉烯酮具有雌性激素作用，主要作用于生殖系统，影响家禽和家畜的雌激素水平，造成家畜生殖系统疾病，主要表现为生殖器肿胀[6]、充血，死胎和流产，精神萎顿，食欲减退，腹痛腹泻等问题，同时还对神经系统、心脏、肾脏、肝和肺都会有一定的毒害作用。目前，对动物玉米赤霉烯酮中毒尚无特效药治疗，而一般动物玉米赤霉烯酮中毒的直接原因是饲料中有霉变的特别是由赤霉污染的玉米、小麦、大豆等。因此，为了保障消费者健康必须建立灵敏度高、特异性强、简单快速的测定方法对玉米赤霉烯酮进行监控。

基于玉米赤霉烯酮的理化性质，目前检测zen的方法主要包括色谱分析方法和免疫分析方法。其中色谱分析方法主要包括薄层色谱法(thin-layerchromatography，tlc)、气相色谱法(gaschromatography，gc)、高效液相色谱法(liquidchromatography，hplc)等，免疫分析方法主要包括酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)、免疫层析法(immunochromatographic，ica)、化学发光免疫分析法(chemiluminescenceimmunoassay，clia)等。仪器检测方法法是目前应用最多的检测方法，具有准确度高、灵敏度好等优点。但该方法的缺点是，需要昂贵的仪器及专业的人员进行操作，样品处理步骤繁锁，需要衍生，回收率低等，所以不适合广泛的推广使用。

量子点(quantumdots，qds)，又称为半导体纳米晶，主要由ⅱ～ⅵ族或者ⅲ～ⅴ族元素组成，如碲化镉(cdte)、硒化镉(cdse)等。与传统荧光材料相比，qds的优点有：具有量子效应和良好的发光性；具有较宽的激发波长和较窄的发射波长；稳定性好；具有良好的生物兼容性；荧光寿命较长。

量子点荧光淬灭免疫层系试纸条是基于荧光供体(量子点)与荧光受体(胶体金)的能量共振转移(fret)实现的。即当荧光供体(量子点)的发射光谱与荧光受体(胶体金)的吸收光谱有一定重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象。量子点荧光淬灭免疫层析技术是在免疫分析技术的基础上，利用荧光量子点作荧光供体与包被抗原混合，固定于nc膜上，胶体金作荧光受体与抗体结合，当抗体与抗原特异性结合时，胶体金就标记于待测抗原上，在紫外灯的照射下与量子点发生能量共振转移。其中，质控线(c线)颜色的有无决定着试纸条的有效性，而检测线(t线)的有无则表示着目标物的有无。该技术操作简单快速、结果容易判定、安全无污染，具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明创造旨在提出一种检测谷物食品中玉米赤霉烯酮的胶体金淬灭量子点免疫层析试纸条。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一种检测玉米赤霉烯酮的胶体金淬灭量子点免疫层析试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和pvc背板，在pvc背板上按顺序依次粘附有样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有玉米赤霉烯酮抗原和量子点-鸡卵白蛋白结合物构成的检测线4和量子点-鸡卵白蛋白结合物构成的质控线5，两条线间隔距离为5mm。

本发明还公开了上述胶体金淬灭量子点免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：

1.玉米赤霉烯酮腹水的纯化

本实验所用玉米赤霉烯酮腹水由实验室自制，采用辛酸—硫酸铵法纯化腹水中的抗体，具体操作步骤如下：

1)取1ml腹水，加入2ml醋酸盐缓冲溶液(0.06mol/l，ph4.0)，混匀后用1mol/lnaoh溶液调ph至4.8。

2)在搅拌的状态下缓慢加入33μl正辛酸，放置于4℃下静置2h。

3)4℃下，15000rpm离心30min，弃掉沉淀，收集上清液。

4)向上清液中加入约为上清液体积1/10的pbs溶液(0.1mol/lpbs，ph7.4)，用1mol/lnaoh溶液调ph至7.4。

5)在冰浴状态下向溶液中缓慢加入硫酸铵，每毫升溶液加入0.277g，加完后搅拌30min。

6)4℃下，5000rpm离心15min，弃掉上清，沉淀用pbs(0.01mol/lpbs，ph7.4)溶解，4℃透析过夜。

7)收集透析完的溶液，4℃下，5000rpm离心10min，收集上清液，稀释纯化前的体积，即1ml。

2.被检物抗原(zen-ova)的制备

(1)半抗原的合成：准确称取10mg玉米赤霉烯酮于圆底烧瓶中，加入200μl甲醇使其充分溶解，随后加入20mg羧甲基羟胺(cmo)，1ml无水吡啶,氩气保护下室温搅拌24h，反应过程中用tlc检测反应程度，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝9:1(v/v)。反应结束后50℃真空干燥，4℃保存备用。

(2)抗原(zen-ova)的制备：准确称取玉米赤霉烯酮半抗原偶联物9.78mg和edc14mg，然后向里面加入1mldmf，搅拌均匀后在4℃的条件下活化过夜。称取10mgova并将其溶于2ml(130mmol/l,ph＝8.1)的碳酸氢钠缓冲液中，预冷，并在冰浴条件下逐滴加入活化好的产物，在室温的条件下反应2h后再在4℃条件下反应过夜。将所得产物用pbs溶液透析72h，测定浓度且根据每次不同的剂量进行分装并在-20℃下保存。

3.备量子点-鸡卵白蛋白偶联物的制备：

使用活化酯法制备量子点-鸡卵白蛋白(qds-ova)偶联物。

(1)偶联反应。取50μl量子点于离心管中，加入0.6mg鸡卵白蛋白和23μledc溶液(10mg/ml)，混匀，并用硼酸盐缓冲液将溶液体积补充至400μl。然后用铝箔纸包裹安道管，于摇床避光震摇反应3h。

(2)离心纯化。将反应液于4℃条件下，10000rpm离心3min，以除去标记过程中形成的聚沉物；将上清液转移到滤膜中，于4℃条件下，8000rpm离心3min，去除溶液中的盐离子；最后将滤膜倒置在另一个离心管中，4℃条件下，8000rpm离心3min，收集滤膜内的溶液。4℃避光保存备用。

4.胶体金-玉米赤霉烯酮抗体(aunps-zen-ab)标记物的制备

(1)准确移取1ml胶体金溶液置于进口安道管中，加入5μl0.2mol/lk2co3溶液，轻摇安道管混匀，调节ph值至最佳值。

(2)将5μl1mg/ml的玉米赤霉烯酮抗体(zen-ab)加入到上述溶液中混合均匀，放置在4℃冰箱中1h。

(3)向其中加入20μl浓度为20％的bsa溶液以稳定金标抗体，再加入10μl20％的peg20000溶液，封闭胶体金表面未与抗体连接的其他位点，室温下静置30min。

(4)将安道管配平，4℃2000rpm条件下离心15min，未连接上抗体的金粒子团聚，形成沉淀，吸取上清液转移至另一安道管中。

(5)再次以4℃，10000rpm的条件离心30min，这时金标抗体形成沉淀。

(6)吸走上清液，保存沉淀，用金标工作液重悬。

5.硝酸纤维素膜的包被

用上海金标的双维平面划膜仪将步骤3制备的zen-ova用pbs溶液稀释3倍后与用pbs溶液稀释6倍后的qds-ova标记物包被于硝酸纤维素膜3上作为检测线5，包被量为0.75μl/cm；将用pbs溶液稀释12倍后的qds-ova包被于硝酸纤维素膜3上作为质控线6，包被量为0.75μl/cm，37℃烘干，封装备用。

6.取8μl步骤4制备的aunps-zen-ab标记物，添加于样品溶液中；

7.在pvc背板上按顺序依次粘附样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，得到所述的玉米赤霉烯酮胶体金淬灭量子点免疫层析试纸条。

上述材料中，水溶性量子点购自武汉珈源量子点技术开发有限公司，样品垫和硝酸纤维素膜购自美国millipore公司，吸水垫和pvc背板购自上海金标生物科技公司。

本发明纯化了被检物腹水，得到了被检物单克隆抗体，备用。制备zen-ova混合qds-ova标记物为检测线的包被抗原，采用qds-ova标记质控线。利用竞争法来检测玉米赤霉烯酮，根据检测线条带的深浅判断待测样品中是否含有目标物。若质控线条带无颜色，则该试纸条失效。

与现有国内外检测玉米赤霉烯酮的方法相比，本发明具有以下突出的优点：1、本发明的胶体金淬灭量子点免疫层析试纸条是利用抗原抗体的特异性反应实现的，因此特异性高，灵敏度好。2、本发明的检测试纸条检测时间快速(15分钟)且不需要任何特殊仪器及设备，检测成本低。3、本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。

附图说明

构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：

图1为本发明检测试纸条的组装示意图。

图2为本发明检测试纸条的结果判定方法示意图。

图3为玉米赤霉烯酮检测限的确定(玉米赤霉烯酮的浓度从左到右分别为0、0.25、0.5、1、2、5μg/l)。

图4为玉米样品中添加玉米赤霉烯酮的食品样品检测结果。每组玉米赤霉烯酮的浓度从左到右分别为0、1.5、3、6、12、30μg/kg。

图5为小麦样品中添加玉米赤霉烯酮的食品样品检测结果。每组玉米赤霉烯酮的浓度从左到右分别为0、1.5、3、6、12、30μg/kg。

附图标记说明：

1、样品垫、2、硝酸纤维素膜3、吸水垫、4、检测线、

5、质控线、6、pvc板

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明创造中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造。

实施例l(制备实施例)

(一)玉米赤霉烯酮腹水的纯化

本实验所用玉米赤霉烯酮腹水由实验室自制，采用辛酸—硫酸铵法纯化腹水中的抗体，具体操作步骤如下：

1)取1ml腹水，加入2ml醋酸盐缓冲溶液(0.06mol/l，ph4.0)，混匀后用1mol/lnaoh溶液调ph至4.8。

2)在搅拌的状态下缓慢加入33μl正辛酸，放置于4℃下静置2h。

3)4℃下，15000rpm离心30min，弃掉沉淀，收集上清液。

4)向上清液中加入约为上清液体积1/10的pbs溶液(0.1mol/lpbs，ph7.4)，用1mol/lnaoh溶液调ph至7.4。

5)在冰浴状态下向溶液中缓慢加入硫酸铵，每毫升溶液加入0.277g，加完后搅拌30min。

6)4℃下，5000rpm离心15min，弃掉上清，沉淀用pbs(0.01mol/lpbs，ph7.4)溶解，4℃透析过夜。

7)收集透析完的溶液，4℃下，5000rpm离心10min，收集上清液，稀释纯化前的体积，即1ml。

(二)玉米赤霉烯酮半抗原的合成

准确称取10mg玉米赤霉烯酮于圆底烧瓶中，加入200μl甲醇使其充分溶解，随后加入20mg羧甲基羟胺(cmo)，1ml无水吡啶,氩气保护下室温搅拌24h，反应过程中用tlc检测反应程度，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝9:1(v/v)。反应结束后50℃真空干燥，4℃保存备用。

(三)玉米赤霉烯酮抗原(zen-ova)的制备

(1)准确称取玉米赤霉烯酮半抗原偶联物9.78mg和edc14mg，然后向里面加入1mldmf，搅拌均匀后在4℃的条件下活化过夜。称取10mgova并将其溶于2ml(130mmol/l,ph＝8.1)的碳酸氢钠缓冲液中，预冷，并在冰浴条件下逐滴加入活化好的产物，在室温的条件下反应2h后再在4℃条件下反应过夜。将所得产物用pbs溶液透析72h，测定浓度且根据每次不同的剂量进行分装并在-20℃下保存。

利用该抗原与量子点-鸡卵白蛋白qds-ova混合，包被硝酸纤维素膜上的检测线。

实施例2(制备实施例)

量子点荧光淬灭免疫层析试纸条的组装及制备方法

1、试纸条组装：

本发明的试纸条组成如下：样品垫1、硝酸纤维素膜2、吸水垫3和pvc板6，在pvc板6上按顺序依次粘附有样品垫1、硝酸纤维素膜2、吸水垫3；所述的硝酸纤维素膜2上分别包被有玉米赤霉烯酮抗原构成的检测线4和羊抗兔二抗构成的质控线5。

2、备量子点-鸡卵白蛋白偶联物的制备：

使用活化酯法制备量子点-鸡卵白蛋白(qds-ova)偶联物。

(1)偶联反应。取50μl量子点于离心管中，加入0.6mg鸡卵白蛋白和23μledc溶液(10mg/ml)，混匀，并用硼酸盐缓冲液将溶液体积补充至400μl。然后用铝箔纸包裹安道管，于摇床避光震摇反应3h。

(2)离心纯化。将反应液于4℃条件下，10000rpm离心3min，以除去标记过程中形成的聚沉物；将上清液转移到滤膜中，于4℃条件下，8000rpm离心3min，去除溶液中的盐离子；最后将滤膜倒置在另一个离心管中，4℃条件下，8000rpm离心3min，收集滤膜内的溶液4℃保存备用。

3胶体金-玉米赤霉烯酮抗体(aunps-zen-ab)标记物的制备

(1)准确移取1ml胶体金溶液置于进口安道管中，加入5μl0.2mol/lk2co3溶液，轻摇安道管混匀，调节ph值至最佳值。

(2)将5μl1mg/ml的玉米赤霉烯酮抗体(zen-ab)加入到上述溶液中混合均匀，放置在4℃冰箱中1h。

(3)向其中加入20μl浓度为20％的bsa溶液以稳定金标抗体，再加入10μl20％的peg20000溶液，封闭胶体金表面未与抗体连接的其他位点，室温下静置30min。

(4)将安道管配平，4℃2000rpm条件下离心15min，未连接上抗体的金粒子团聚，形成沉淀，吸取上清液转移至另一安道管中。

(5)再次以4℃，10000rpm的条件离心30min，这时金标抗体形成沉淀。

(6)吸走上清液，保存沉淀，用金标工作液重悬。

4硝酸纤维素膜的包被

用上海金标的双维平面划膜仪将用pbs溶液稀释3倍后的玉米赤霉烯酮抗原与用pbs溶液稀释6倍后的qds-ova等体积混合包被于硝酸纤维素膜3上作为检测线5，包被量为0.75μl/cm；将用pbs溶液稀释12倍后的qds-ova包被于硝酸纤维素膜3上作为质控线6，包被量为0.75μl/cm，37℃烘干，封装备用。

5试纸条的组装

将样品垫1、硝酸纤维素膜2、吸水垫3按图1所示的顺序依次粘附在pvc板6上，切成3.7mm宽的小条，真空封装。

实施例3(应用实施例)

1、量子点标记免疫层析试纸条使用方法

谷物样品的预处理

5g谷物样品磨碎后置于50ml离心管中，加入5ml70％的甲醇溶液，高速混匀5min，用磷酸盐缓冲液(ph7.5)补充体积至30ml后于4℃条件下，5000g离心5min，吸取上清液，直接用于试纸条检测。

2、检测步骤

用移液枪吸取200μl待检样品提取液于安道管中，并加入8μlaunps-zen-ab，混匀后，滴加到试纸条的加样孔里，15分钟后观察结果。

3、结果判定

如图2所示，若待测样品试纸条检测线荧光消失，则判断为阴性样品，即不含玉米赤霉烯酮；若待测样品试纸条检测线荧光浅于质控线颜色或与质控线颜色一致，则判断为阳性样品，即待测样品中含有玉米赤霉烯酮；阳性结果和阴性结果，质控线均显绿色荧光条带，若质控线绿色荧光条带消失，则试纸条检测失效。

实施例4(应用实施例)

本发明的应用效果举例

本实施例中所指的蛋白同化激素量子点标记免疫层析试纸条检测方法参照实施例3所述的操作步骤，其检测结果如下。

1、灵敏度试验

如图3所示，按实施例3所述方法进行试验。当玉米赤霉烯酮标准品浓度低于0.25μg/l时，试纸条检测线无荧光条带，显色结果与质控线颜色目测比较有明显差别；当玉米赤霉烯酮标准品浓度为0.25μg/l时，试纸条检测线出现荧光条带，显色结果与质控线颜色目测比较差别较小；当玉米赤霉烯酮标准品浓度继续增大，检测线逐渐变亮；玉米赤霉烯酮标准品浓度为0.5μg/l时，检测线显色结果与质控线颜色目测一致。因此确定方法的目视检测限为0.25μg/l。

2、加标样品的检测

如图4所示，向玉米样品中添加玉米赤霉烯酮标准品，样品中最终浓度为0,1.5,3,6,12,and30μg/kg，向5g样品中添加5ml70％甲醇-pbs溶液，震荡5min后用pbs溶液补充体积至30ml,混匀后5000rpm离心5min后，取上清液进行检测。按实施例3所述方法进行实验，检测结果如图4。

如图5所示，向小麦样品中添加玉米赤霉烯酮标准品，样品中最终浓度为0,1.5,3,6,12,and30μg/kg，向5g样品中添加5ml70％甲醇-pbs溶液，震荡5min后用pbs溶液补充体积至30ml,混匀后5000rpm离心5min后，取上清液进行检测。按实施例3所述方法进行实验，检测结果如图5。

实验表明本发明的试纸条准确性好、灵敏度高，而且样品前处理方法简单，整个检测过程不超过20min，适用于大量样品的快速筛选，可作为是蛋白同化激素多残留快速检测的有效筛检手段。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。