用于以酶促方式使玉米赤霉烯酮解毒的多肽，以及分离的多核苷酸，以及相关的添加剂、用途和方法与流程

本发明涉及用于以酶促方式使玉米赤霉烯酮解毒的多肽，编码使玉米赤霉烯酮解毒的多肽的分离的多核苷酸，用于制备使玉米赤霉烯酮解毒的单加氧酶的转基因宿主细胞，用于以酶促方式使玉米赤霉烯酮解毒的添加剂及其用途，以及用于以酶促方式使玉米赤霉烯酮解毒的方法。

真菌毒素是丝状真菌产生的次生代谢物。其一个重要的代表是世界范围传播的玉米赤霉烯酮(zen)(以前称为f-2毒素)，其由许多镰孢菌真菌产生。这些真菌尤其侵染栽培植物，例如各种各样的谷类，其中真菌侵染通常出现在收获之前，其中真菌生长或真菌毒素产生可以在收获之前发生，或者在不适当的贮藏的情况下也可以在收获之后发生。fao估计，在世界范围内25％的农产品被真菌毒素污染，这导致巨大的经济损失。在一项最近在世界范围内进行的研究中，从2009年1月至2011年分析了总共23，781个样品，其中81％经测试为对于至少一种真菌毒素来说阳性和45％对于zen来说阳性。可以在世界的所有地区中，同样地在所有经测试的谷物类别和饲料类别，例如玉米、大豆粉、小麦、麦麸、ddgs(干酒糟)中，以及在预制饲料混合物中，以直至100％的频率发现zen。

zen是一种非甾类的、雌激素的、大环的、通过聚酮化合物物质代谢途径合成的内酯，其具有下述结构式：

和iupac命名名称“(2e，11s)-15，17-二羟基-11-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18)，2，14，16-四烯-7，13-二酮”。对于zen和zen代谢物，存在有不同的命名法，其中在该文献中尽可能采用metzler的命名法(2011，mycotox.res.，27：1-3)。除了zen之外，在自然界中还存在有许多zen衍生物，其通过zen的酶促或化学修饰而形成。此外，zen代谢物尤其在人或动物机体中形成。

zen，同样地还有zen衍生物，例如α-zel或β-zel，由于其高的化学和物理稳定性而还可以在经加工的食物或饲料例如面包、啤酒或干酒糟中检测到。

虽然zen具有相对低的急性毒性并且具有直至20,000mg/kg体重的口服ld50值，但是在较长期摄入的情况下可以在动物或人中出现亚急性和/或亚慢性的毒性效应，例如致畸形的、致癌的、免疫抑制的和动情的效应。zen与雌激素受体结合并且可以引起激素紊乱，因此通常将相比于zen而言所形成的代谢物降低理解为“玉米赤霉烯酮的解毒或脱毒”。

摄入被zen污染的饲料导致哺乳动物中的发育障碍，其中猪，特别是幼猪对于zen是极其敏感的。超过0.5ppm的在饲料中的zen浓度导致发育障碍，其中例如超过1.5ppm的浓度可以导致猪中的超雌激素活性，和12ppmzen的浓度被认为对牛中的流产负责。由于玉米赤霉烯酮通过粘膜，特别是通过胃粘膜，但也通过口腔粘膜被迅速吸收，因此立即的和尤其是定量的解毒是必要的。在zen的口服给药后30分钟已经可以在血液中检测到它们。为了达到尽可能完全的解毒，已证明使用经分离的酶相对于微生物而言是有利的，因为它们具有更高的比活性或更快的作用。由于zen的有害效应，因而在欧盟存在有在食物中的强制性的zen上限以及对于在饲料中的zen上限的推荐(ecno：1881/2006)。

为了减少食物或饲料的zen污染的最初策略是限制真菌生长，例如通过遵循“良好的农业实践经验”。这尤其包括，种子没有害虫和真菌侵染，或者及时从田地中移除农业废料。此外，还可以通过使用杀真菌剂来减少田地上的真菌生长。在收获之后，应当将收获物储藏在低于15％的残留水分含量和低的温度下，以阻止真菌生长。同样地，应当在再加工之前去除由于真菌侵染而被污染的物料。尽管有着这一系列措施，但i.rodriges和k.naehrer(2012)仍然报道了，即使在具有最高农业标准的地区，例如usa和中欧，在2009年至2011年中，分别有29％和39％的经测试的玉米样品被zen污染。

用于从饲料或食物中去除zen的其他可能性为真菌毒素的吸附或转化。为此所必需的是，真菌毒素与吸附剂的结合在宽的ph范围内是强的且特异的，并且在胃肠区域内的整个消化过程中保持稳定。虽然对于黄曲霉毒素可以有效地使用几种非生物吸附剂，例如活性炭、硅酸盐或合成的聚合物，例如消胆胺，但是它们用于其他真菌毒素则受到限制。吸附剂的主要缺点是其他有时候对于营养供给来说必需的分子的非特异性结合。在文献中同样也描述了生物吸附剂，例如酵母或酵母提取物，然而生物吸附剂像非生物吸附剂一样也类似地受到限制。

通过物理和化学处理来对zen进行解毒也受到限制。通过热处理，不能有效地使zen钝化，但是可以通过挤出和用氧化剂进行处理，例如在80℃下用10％的过氧化氢溶液处理16小时，来使zen含量降低83.9％。在饲料和食物的制备中挤出方法和氧化剂例如臭氧或过氧化氢的使用，由于高的成本、品质损失、有时候低的效率和低的特异性而受限。

从ep0938575b1中知晓了红球菌属(rhodococcus)和诺卡氏菌属(nocardia)的细菌，特别是球状红球菌(r.globerulus)、红串红球菌(r.erythropolis)和球形诺卡氏菌(n.globerula)的zen降解特性。

vekiru等人(appl.andenviron.microb.，2010，76，7，2353-2359)描述了通过噬真菌毒素丝孢酵母(trichosporonmycotoxinivorans)这种微生物将zen生物转化为动情性较低的代谢物zom-1。

下面所使用的术语取自专业用语并且总是以传统的意义进行使用，除非另外指出。因此，术语“多核苷酸”涉及具有所有长度和序列的每一种类型的遗传物质，例如单链和双链dna和rna分子，包括调控元件、结构元件、基因群、质粒、全基因组及其片段。名称“多肽”包括蛋白质，例如酶、抗体，以及具有直至500个氨基酸的多肽，例如肽抑制剂，蛋白质的结构域，还有具有小的序列长度例如少于10个氨基酸的短多肽，例如受体、配体、肽激素、标签等。名称“在多核苷酸或多肽中的‘位置’”涉及在所述多核苷酸或多肽的序列中单个特定的碱基或氨基酸。

现在，本发明旨在提供这样的多肽以供使用，用所述多肽可成功实现将玉米赤霉烯酮快速地且可靠地转化为玉米赤霉烯酮衍生物，所述玉米赤霉烯酮衍生物的毒性和动情效应被降低至这样的程度，即它可以对于各自的最终使用者来说无危险地残留在饲料或食品中。

为了解决该任务，本发明的特征主要在于，所述多肽为将在玉米赤霉烯酮的位置7处的酮基团转变成酯基团的单加氧酶。单加氧酶为属于ec-分类的i组的酶，其催化来自o2的氧原子掺入到相应的底物(在本情况下，玉米赤霉烯酮)中。更准确而言，在玉米赤霉烯酮的情况下，将氧原子掺入在玉米赤霉烯酮的环结构的位置7处，由此获得毒性强度较低的玉米赤霉烯酮衍生物(izom)。令人惊讶地证实，该解毒在仅单个酶促反应步骤中进行；并且反应产物izom尽管具有仍然存在的封闭的环结构和在位置7处的碳-氧双键，但是具有低大约100倍的毒性并且几乎不再显示出动情效应。

迄今为止假定，内酯环系统的裂解对于zen的有效解毒来说是必需的。然而，令人惊讶地已证实，通过将在玉米赤霉烯酮的位置7处的酮基团转变成酯基团也可实现极为有效的解毒，在所述重排中不发生环系统的裂解。

根据本发明的一个进一步方案，对所述单加氧酶进行选择，从而使得其为baeyer-villiger单加氧酶。baeyer-villiger单加氧酶系统的使用确保了，反应可以仅仅在所希望的位置7处发生，因为只有该位置可供用于所谓的baeyer-villiger氧化，即通过掺入氧原子来将酮转变成酯。

根据本发明的一个进一步方案，对所述多肽进行选择，从而使得它在一步反应中使至少70％的玉米赤霉烯酮解毒。这成功实现，特别地是因为反应产物izom令人惊讶地具有低大约100倍的毒性。

由于玉米赤霉烯酮分子的具体结构和特别是由于在玉米赤霉烯酮分子的位置7处存在的酮基团，借助于baeyer-villiger单加氧酶的一个亚组，即环己酮单加氧酶，成功实现在玉米赤霉烯酮的位置7处有针对性地掺入所希望的氧原子，正如这相应于本发明的一个进一步方案一样。通过该掺入而产生的酯基团令人惊讶地导致，所形成的环状代谢物(izom)具有比玉米赤霉烯酮明显更低的毒性。

当所述多肽为选自seqidno.1、2和3的氨基酸序列或者其功能性变体时，成功实现将玉米赤霉烯酮特别完全地转变成毒性更低的衍生物izom，其中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间存在至少60％，优选地至少70％，更优选地至少80％，和最优选地至少90％的序列同一性。由于至少一个这样的保守氨基酸序列例如seqidno.1、2和3的序列或者其功能性变体的存在，成功实现提供这样的多肽以供使用，除了zen的快速且完全的转变外，所述多肽还具有相比于迄今已知的转化zen的多肽而言特别高的活性值。

术语“序列同一性”是指序列同一性百分比。对于氨基酸序列和核苷酸序列，相互间的序列同一性可以目视测定，但是优选地用计算机程序来计算出来。将具有seqidno.1、2和3的氨基酸序列以及具有seqidno.3、4和5的核苷酸序列定义为参考序列。还在序列区段内进行序列比较，其中参考序列的连续序列被理解为区段。对于核苷酸序列来说，序列区段的长度通常为18至600个核苷酸，优选地45至200个核苷酸，更优选地100至150个核苷酸。对于肽序列来说，序列区段的长度通常为3至200个氨基酸，更优选地15至65个氨基酸，最优选地30至50个氨基酸。存在有许多可购得的或免费可用的生物信息学程序，其可以被召来用于同源性测定并且持续地得到进一步发展。对此的例子为gcgwisconsinbestfit软件包(devereux等人，1984)、blast(altschul等人，1990)或blast2(tatusova和madden，1999)。由于这些算法的不同的设置可能性，在相同的输入序列的情况下它们得到不同的结果是可能的，因此必须定义搜索算法和与此有关的设置。在本情况下，序列同一性借助于程序ncbiblast(basiclocalalignmentsearchtool)来进行测定，特别地对于多肽，用blastp，和对于多核苷酸，用blastn(在2014年10月20日的版本中)，其提供在“nationalcenterforbiotechnologyinformation”的主页(ncbi；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上以供使用。因此，可能的是，根据altschul等人，1997(nucleicacidsres.，25：3389-3402)的算法，将两个或更多个序列互相进行比较。在此，使用2013年5月15日的那个版本的程序。作为程序设置，考虑基本设置，但是特别地，对于氨基酸序列比较：“最大靶序列(maxtargetsequence)”＝100；“期望阈值(expectedthreshold)”＝10；“字长(wordsize)”＝3；“矩阵(matrix)”＝blosom62；“缺口成本(gapcosts)”＝“存在(existence)：11；延伸(extention)：1”；“计算调整(computationaladjustment)”＝“条件式组成得分矩阵调整(conditionalcompositionalscorematrixadjustment)”；以及对于核苷酸序列比较：字长：11；期望值(expectvalue)：10；缺口成本：存在＝5，延伸＝2；过滤器(filter)＝低复杂度激活的(lowcomplexityactivated)；匹配/错配得分(match/mismatchscores)：2，-3；过滤器字符串(filterstring)：l；m。

术语“功能性多肽变体”或“功能性变体”一方面涉及多肽的“等位基因变体”和多肽的“功能性片段”，另一方面涉及“经修饰的多肽”，其中酶促功能相比于具有seqidno.1的多肽而言基本上未改变。名称“等位基因变体”涉及这样的多肽，所述多肽通过在自然界中随机发生的核苷酸序列突变而产生并且引起氨基酸序列的改变，其中其酶促功能未受影响。术语“功能性片段”涉及多肽的部分或部分序列或者其功能性变体的部分或部分序列，其中酶促功能基本上得到保留。“经修饰的多肽”可以是c-末端或n-末端的融合蛋白或者有针对性地经突变的多肽，其中突变可以通过至少一个氨基酸的置换、插入或缺失来获得，这特别地通过位点特异性诱变或随机诱变、重组和/或任何其他蛋白质工程方法来进行，其中酶促功能基本上得到保留。术语“置换”、“插入”和“缺失”以在基因技术中通常的和专业人员熟悉的含义来进行使用。当酶促反应机制保持不变，即将在真菌毒素zen的位置7处的酮基团转变成相应的酯基团(如在上面提及的反应机制中所显示的)，并且相对于原始多肽而言的比残余活性为至少5％，优选地至少10％，特别地至少50％时，那么基本上保留了酶促功能。

具有有着seqidno.1和3的氨基酸序列的多肽是功能性等位基因变体，其中所述序列各自来源于不同的微生物。这从下列中可清楚地看出来：借助于序列同一性百分比而测量出的接近的相互亲缘关系，以及这样的事实，即所述多肽通过相同的机制作用于zen。具有seqidno.1的多肽被完全包含在具有seqidno.2的序列中，然而具有seqidno.2的多肽具有长了28个氨基酸的n-末端。

术语“解毒”或“使……解毒”是指zen的雌激素活性的降低。在此，雌激素活性的测量优选地按照在实施例中所描述的方法来进行。也可以采用其他方法，其中决定性因素总是为通过其酶促转变成izom来降低zen的雌激素活性。用在实施例中所描述的动情性能测定法，izom具有比zen低大约100倍的雌激素活性。

此外，本发明旨在提供分离的多核苷酸以供使用，用所述多核苷酸可成功实现制备用于使zen快速地且可靠地解毒的多肽。

为了解决该任务，本发明的特征主要在于，所述分离的多核苷酸具有这样的核苷酸序列，该核苷酸序列编码作为将在玉米赤霉烯酮的位置7处的酮基团转变成酯基团的单加氧酶的多肽，和/或与至少一个选自seqidno.4、5和6的核苷酸序列具有至少60％的序列同一性程度。在此，所述核苷酸序列可以在中等严紧条件下与至少一个选自seqidno.4-6的核苷酸序列杂交，和/或与具有至少200个核苷酸，特别地至少100个核苷酸的其部分序列杂交，和/或与上述核苷酸序列或其部分序列的互补链杂交。通过这样的多核苷酸的表达，可以确保所得的多肽将zen转化为izom。

待表达的核苷酸序列，特别是其三联体(密码子)，通常随着宿主细胞而变化，从而密码子偏倚性随着宿主细胞而优化。这导致，具有远低于80％，还有低于70％或低于60％的序列同一性程度的多核苷酸也可以编码同一种多肽。用于确定序列同一性程度的序列比较还必须在序列区段内进行，其中区段是指参考序列的连续序列。对于核苷酸序列，序列区段的长度通常为15至600。

借助于现有的分离的核苷酸序列或序列区段，可成功产生具有通常至少15、30或40个核苷酸的长度的核酸探针。借助于此类称为探针的核苷酸序列(其大多数另外还例如用³h、³²p、³⁵s、生物素或抗生物素蛋白进行标记)，可以通过使用标准方法来鉴定编码具有降解zen的作用的多肽的核苷酸序列。作为用于鉴定此类序列的起始材料，可以考虑例如单个微生物的dna、rna或cdna，基因组dna文库，或者cdna文库。

对于具有至少100个核苷酸的长度的核苷酸序列，中等严紧条件被定义为在42℃下在包含0.3％十二烷基硫酸钠(sds)、200μg/ml经剪切和变性的鲑精dna和35％甲酰胺的配备有5×naci的na-edta缓冲液(sspe，0.9mnaci，60mmnah2po4，6mmedta)中的预杂交和杂交，随后为标准southern印迹条件，其中最后将载体材料用2×的氯化钠-柠檬酸盐缓冲液(ssc，300mmnacl和30mm柠檬酸三钠，0.2％sds)在55℃下洗涤15分钟，进行三次。

对于具有15个核苷酸至100个核苷酸的长度的核苷酸序列，中等严紧条件被定义为在由0.9mnaci、0.09mtris-hclph＝7.6、6mmedta、0.5％np-40、1×denhardt溶液、1mm焦磷酸钠、1mm磷酸二氢钠、0.1mmatp和0.2mg/ml酵母rna组成的缓冲液中的预杂交和杂交，其中在比计算出的解链温度(tm)低5℃至10℃的温度下进行预杂交和杂交，其中tm通过按照bolton和mccarthy(1962，proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa，48：1390)进行的计算来确定。随后，该试验在标准southern印迹条件下继续进行(j.sambrook，e.f.fritsch和t.maniatis，1989，molecularcloning，alaboratorymanual，第二版，coldspringharbor，newyork)。最后，将载体材料用包含0.1％sds的6×scc缓冲液洗涤15分钟，进行一次；和在各自处于比计算出的tm低5℃至10℃的温度下用6×ssc缓冲液洗涤15分钟，进行两次。

本发明的另一个目标是提供用于制备使玉米赤霉烯酮解毒的单加氧酶的转基因宿主细胞以供使用。

为了解决该任务，本发明的特征主要在于，所述宿主细胞表达具有这样的核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码至少一种作为转变在玉米赤霉烯酮的位置7处的酮基团的单加氧酶的多肽，和/或与至少一个选自seqidno.4、5和6的核苷酸序列具有至少60％的序列同一性程度，其中所述多核苷酸整合在染色体中或存在于染色体外并且所述宿主细胞为原核或真核细胞，特别是酵母细胞或植物细胞，并且所述宿主细胞任选地另外还过表达使对于加氧酶来说所需要的辅因子再循环的酶，特别是将nadp⁺或nad⁺转变成nadph或nadh的酶。

将nadp⁺或nad⁺转变成nadph或nadh的酶以及为此所需要的辅因子可以从现有技术中获知，例如在torrespazmino等人，2008(angew.chem.47(12)，2275-8)中获知。优选地，对所述将nadp⁺或nad⁺转变成nadph或nadh的酶进行选择，从而使得其可以在食物和/或饲料工业中无问题地进行使用，特别地其与相应的食物和/或饲料法律的规定相容。例如，作为将nadp⁺转变成nadph的酶，可以使用依赖于nadph的木糖还原酶(特别是来自树干毕赤酵母(pichiastipitis)的)，其使用允许作为饲料添加剂的木糖醇作为底物。作为备选地，还可以使用来自乳杆菌属物种(lactobacillussp.)的转化nad(p)h的甘露醇脱氢酶，其中可以使用允许作为饲料添加剂的甘露醇作为底物。

优选地，可能的是，以融合蛋白形式来制备或表达用于使zen解毒的多肽和能够使辅因子再循环的酶。由此，可以在一个共同过程(特别是生物技术上游和下游过程)中制备这两种酶活性。此外，在使用此类融合蛋白的情况下，确保在这两个氧化步骤之间循环的辅因子保持与用于使zen解毒的多肽在空间上接近。

最后，本发明旨在提供这样的添加剂以供使用，用所述添加剂可成功实现在确定的或复杂的基质中，例如在饲料或食物中，快速地且可靠地使zen解毒，所述解毒被定义为雌激素活性的降低。

为了解决该任务，提供了使玉米赤霉烯酮解毒的添加剂以供使用，其中所述添加剂包含至少一种作为将在玉米赤霉烯酮的位置7处的酮基团转变成酯基团的单加氧酶的多肽，所述单加氧酶优选地包含选自seqidno.1、2和3的氨基酸序列或者其功能性变体，其中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少60％；以及任选地，包含至少一种助剂。用这样的添加剂，可直接地在食物或饲料中成功实现zen向玉米赤霉烯酮衍生物(即izom，其毒性比玉米赤霉烯酮的毒性低大约100倍)的一步的生物化学转变。

根据本发明的一个优选的进一步方案，如此地产生所述添加剂，从而所述至少一种助剂选自惰性载体、维生素、矿物质、酶、其他用于使真菌毒素解毒的组分、和辅因子，特别是nadph和/或nadh。通过使用这样的添加剂，可以确保例如在食物或饲料中所包含的zen的量的大多数部分被安全可靠地氧化为izom，由此保证对于摄入这些饲料或食物的受试者的机体没有有害效应。

在此，除了根据本发明的多肽外，所述添加剂还可以包含例如酶制剂作为助剂，在所述酶制剂中进一步包含至少一种这样的酶，所述酶例如参与蛋白质的降解，例如蛋白酶，或者所述酶参与淀粉或纤维或脂肪或糖原的代谢，例如淀粉酶、纤维素酶或葡聚糖酶，以及例如水解酶、脂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、植酸酶、木聚糖酶和/或其组合。

其他可能的、根据本发明可使用的助剂为这样的酶制剂，其除了包含至少一种根据本发明的多肽外，还包含至少一种用于使与玉米赤霉烯酮不同的真菌毒素解毒的组分，例如使真菌毒素解毒的酶，例如黄曲霉毒素氧化酶、麦角胺水解酶、麦角胺酰胺酶、赭曲毒素酰胺酶、串珠镰孢菌素羧酸酯酶、串珠镰孢菌素氨基转移酶、氨基多元醇氨基氧化酶、脱氧瓜萎镰菌醇环氧化物水解酶；和/或至少一种使真菌毒素解毒的微生物；和/或至少一种结合真菌毒素的组分，例如微生物细胞壁或无机材料例如膨润土。

根据本发明的一个特别优选的进一步方案，所述多肽以这样的浓度包含在所述添加剂中，以该浓度可成功实现将zen快速地和特别地在其由消耗了被污染的饲料或食物的受试者(特别是哺乳动物)的身体吸收之前已经转变成无毒或毒性明显更低的代谢物izom。

在此，所述多肽可以以经包囊或经包衣的形式存在于所述组合物中，其中对于所述包囊或包衣过程，可以考虑标准方法，例如在wo92/12645中所描述的那些。通过所述包囊或包衣过程，可成功实现将所述多肽运输至其使用位点，而没有改变，特别是没有降解或损害，从而在保护壳溶解(例如在动物的消化道中)之后，所述多肽才开始起作用，由此在酸性的、富含蛋白酶的和缺氧的环境中也可以达到zen的更加有针对性的、更快速的和更完全的转化。此外，通过所述包囊或包衣过程，还可成功提高在所述添加剂中所述多肽的温度稳定性。

可以用在饲料工业中常用的助剂将所述经包囊或经包衣的多肽进一步加工为预混合物。

此外，本发明还旨在所述添加剂用于使在饲料(其特别地用于猪、家禽和水产养殖)中、在食物中或在干酒糟中的玉米赤霉烯酮解毒的用途。通过所述添加剂的根据本发明的用途，可成功实现通过将在位置7处的酮基团转变成酯基团而将在食物或饲料中或者在干酒糟中所包含的zen氧化为izom并由此使其解毒，其中在被污染的饲料或食物中低的多肽浓度的情况下已经成功实现这样的解毒。

在此，优选地，在每吨饲料或食物或干酒糟中，所述多肽在大约1g至大约500g的范围内，所述经包囊或经包衣的多肽在大约20g至大约3000g的范围内，所述预混合物在大约200g至大约10kg的范围内，或者所述添加剂在大约5mg至大约10kg的范围内存在。由此使得可能将在饲料或食物中存在的zen(其可以以直至10,000μg/kg的浓度存在于其中)大多数地转变成izom。

如果在淀粉的液化过程中、在糖化过程中、在沼气过程中或在发酵过程中(例如在生物乙醇制备的制浆过程或发酵过程中)使用所述添加剂，那么可以确保将在用于所述过程的或由其产生的产物(例如干酒糟或淀粉)中的zen转变成izom，由此没有有损于健康的量的zen保持完整。

此外，本发明还旨在提供这样的方法以供使用，用所述方法使得可能将zen快速地且可靠地转变成无毒的衍生物即izom。

为了解决该任务，如此地进行所述方法，从而在一步酶促氧化反应中，通过添加多肽，特别是单加氧酶，来将玉米赤霉烯酮转变成izom并由此使其解毒，其中在玉米赤霉烯酮的位置7处的酮基团被转变成酯基团；并且任选地，借助于另一种酶将在该反应中被氧化的辅因子，特别是nadp+或nad+，还原成nadph或nadh。通过该一步酶促反应，不仅保证了快速地掺入氧原子(其与在位置7处的酮基团一起形成酯基团)，而且尤其确保了该反应完全进行并且玉米赤霉烯酮完全转变成毒性低大约100倍的izom。与此同时，nadp⁺或nad⁺可以通过已经描述的酶系统转变或再循环成nadph或nadh。

根据本发明的一个进一步方案，如此地进行所述方法，从而使用具有选自seqidno.1、2和3的氨基酸序列或者其功能性变体的多肽作为用于以酶促方式使玉米赤霉烯酮解毒的多肽，其中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少60％。在使用具有选自seqidno.1、2和3的氨基酸序列的多肽的情况下，观察到玉米赤霉烯酮的特别完全的解毒。

正如这相应于本发明的一个进一步方案一样，根据本发明的方法在此可以不仅在添加剂本身中而且在转基因宿主细胞中、在转基因植物中或在种子中进行使用，并且不依赖于使用位点地导致始终如一地良好的结果和特别是将玉米赤霉烯酮完全转化为izom。

在此，可以如此地进行所述方法，从而将所述多肽或所述添加剂与被玉米赤霉烯酮污染的饲料或食物相混合，使所获得的混合物与湿气相接触，并且所述多肽或所述添加剂使在所述被污染的饲料或食物中所包含的玉米赤霉烯酮解毒。在湿润的饲料或食物例如麦芽浆或糊浆的情况下，玉米赤霉烯酮向izom的转变在经口摄入之前在所述饲料或食物中发生，由此可以确保，最大程度地消除玉米赤霉烯酮对于人和动物的有害效应。在此，湿气是指水或含水液体的存在，其中例如唾液或其他在消化道中存在的液体也属于该范畴。

还可以如此地进行本发明的方法，从而将所述饲料或食物在经口摄入之前进行粒化。

根据本发明的一个进一步方案，如此地进行所述方法，从而在一步反应过程中，所述玉米赤霉烯酮以至少70％，优选地至少80％，特别地至少90％的程度被解毒，如特别地也在实施例3中所显示的那样。由此可以预防在动物或人中的亚急性和/或亚慢性的毒性效应，例如致畸形的、致癌的、动情的和免疫抑制的效应。

下面将依据实施例以及附图更详细地阐明本发明。其中：

图1：通过酿酒酵母(s.cerevisiae)，在阴性对照中zen的部分转变。

图2：通过表达具有seqidno.1的多肽的酿酒酵母，在试验批料中zen的转变。

图3：izom的化学结构。

图4：zen(图4a)以及izom(图4b)的雌激素活性。

如果没有更确切地指明，那么所有分子生物学或微生物学工作都通过使用标准方法来进行(methodsinenzymology，第194卷，第3-933页(1991)；guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology.由christineguthrie，geraldr.fink编辑.isbn：978-0-12-182095-4；j.sambrook等人，2012，molecularcloning，alaboratorymanual，第4版，coldspringharbor)。

实施例1：在一步反应中从zen形成izom

借助于标准方法，用质粒pcs57转化酵母菌株yzga515(酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，其通过使abc转运蛋白基因pdr5失活而进行了修饰(poppenberger等人，2003，j.biol.chem.，278(48)47905-14)，以为了经改善的玉米赤霉烯酮(zen)的摄取)。pcs57是来源于酵母表达质粒padh-fw(mitterbauer等人，2002，appl.environ.microbiol.，68(3)，1336-1346)的质粒，其具有作为选择标记的leu2和adh1启动子。

在试验批料中，用pcs57载体转化酵母菌株yzga515，所述pcs57载体另外还在强组成型adh1启动子(醇脱氢酶1)之后包含作为bamhi-xhoi片段的具有seqidno.4的多核苷酸。由此使得具有seqidno.1的多肽的形成成为可能。

作为阴性对照，用空载体(没有具有seqidno.4的多核苷酸的padh-fw)转化酵母菌株yzga515。

将转基因酵母(试验批料和阴性对照)在sc-leu培养基(sherman1991，methodsenzymol.，194，3-21)中进行培养，离心，并且以2mg/lzen的浓度重悬浮在新鲜的sc-leu培养基中，其中在所述两种情况下都调节od600＝4的细胞密度。在不同的温育时间后，抽取样品，给样品掺入1个体积的甲醇，并由此终止细胞内过程。通过离心使细胞悬浮液澄清，并将所得的上清液用于借助于hplc-ms进行的测量。如先前所描述的，测量起始物质玉米赤霉烯酮(zen)，以及由噬真菌毒素丝孢酵母所形成的转化产物zom-1(vekuri等人，2010，appl.environ.microbiol.76(7)，2353-9)。

在用空载体进行转化的阴性对照中，没有形成zom-1，和特别地没有形成izom。相应的hplc分析数据显示在图1中，其中y-轴指明了纳克/毫升(ng/ml)和x-轴指明了以小时(h)表示的时间。

与此相反，在试验批料中，玉米赤霉烯酮明显更快地被转化，并且鉴定出一种新的代谢物，其具有由vekiru等人(2010)所假定的中间体的预期质量(在下面称为izom)。此外，还可检测到zom-1，这是一个清楚的暗示，即从izom至zom的水解以很小的程度发生。相应的hplc分析数据显示在图2中。相比于阴性对照而言，测量到少得多的量的zen，其中y-轴指明了纳克/毫升(ng/ml)和x-轴指明了以小时(h)表示的时间。

在另一个试验批料中，另外还定量地测量了代谢物izom。在表1中显示了zen的代谢的摩尔平衡表。从中清楚地看出，在6小时后，大部分所使用的玉米赤霉烯酮(zen)已经被转变成izom。在该平衡表中的少量亏空可用其他代谢物的形成以及由方法决定的分析的不精确来解释。这些结果清楚地显示，具有seqidno.1的多肽能够将zen转变成代谢物izom。

表1：在试验批料中zen的代谢的摩尔平衡表

实施例2：izom的化学结构的鉴定

代谢物izom的化学结构(图3)可以借助于经分离和经纯化的代谢物的nmr测量来进行测定。为了nmr谱的测量，从几升的酵母培养物(sc-leu，如在实施例1中所描述的)的培养物过滤物制备足够量的izom。借助于固相萃取和随后的制备型hplc来纯化izom。

借助于经分离的关于izom的参考物质，可以一方面追踪zen向izom的转变(参见实施例1)和另一方面经由nmr来查明化学结构。

采用brukeravancedrx-400ft-nmr波谱仪，在室温(20℃)下在cd3od溶液中用5mm的反向宽频带z-梯度探头来获得用于鉴定izom的nmr谱。化学位移建立在残留溶剂共振(关于¹hnmr，3.31ppm；关于¹³cnmr，49.15ppm)的基础上。所有脉冲程序获自bruker软件库。借助于topspin1.3(brukerbiospingmbh)来评价nmr数据。完整的结构确定和信号分配基于¹h、¹³c-apt、¹h¹h关联波谱学(cosy)，¹h¹³c异核单量子关联波谱(hsqc)，和¹h¹³c异核多频带关联波谱(hmbc)来进行。

与zen相比，izom的nmr波谱学数据显示出两个主要差别。这证实了酮基团被转化为酯基团。所述差别主要是羰基碳原子的从在zen中的212ppm(对于酮来说特征性的)至175ppm(对于羧酸衍生物来说特征性的)的位移，和邻近的ch2基团的从36ppm和2.90/2.30ppm(在zen中的位置8)至65ppm和4.20/4.05(在izom中的位置9)的位移(分别关于¹³c和¹h)，其由邻接的氧原子引起。与zom1的开环相反，在izom中大环仍然是完整的，如通过在c7和h9之间的远程关联可明显看出的。nmr数据在表2中给出。izom的化学结构显示在图3中。

表2：用于鉴定izom的¹h和¹³cnmr数据

实施例3：相比于zen而言izom的大大降低的雌激素活性

为此，使用经纯化的代谢物izom(如在实施例2中所描述的)来测定以雌激素活性表示的其毒性并与玉米赤霉烯酮的毒性进行比较。

为了测量雌激素活性，使用特别为此制备的报道酵母菌株，yzhb817(bachmann，h.：phenotypicdetectionofzearalenoneinsaccharomycescerevisiae.masterthesisbokuvienna，2003)。该菌株来源于酵母双杂交菌株pj69-4a(matatrp1-901leu2-3，112ura3-52his3-200gal4-(缺失的)gal80(缺失的)lys2：：gal1-his3gal2-ade2met2：：gal7-lacz)(james等人，1996，genetics，144(4)，1425-1436)。通过破坏abc转运蛋白pdr5和snq2来对pj69-4a进行进一步开发。具有该双突变pdr5和snq2的菌株显示出特别高的zen-摄取(mitterbauer等人，2003，appl.environ.microbiol.，69(2)，805-811)。随后，用表达载体(ptk103)转化该菌株从而获得菌株yzhb817，所述表达载体触发包含人雌激素受体α的激素依赖性激活结构域和酵母gal4蛋白的dna结合结构域的融合蛋白的产生。

在雌激素类物质存在下，酵母菌株yzhb817诱导gal7lacz报道基因的表达，所述报道基因的产物，β-半乳糖苷酶，可以容易地通过生色底物onpg(邻硝基苯基-β-半乳糖苷)的水解在420nm处来测量(currentprotocolsinmolecularbiology，第13章，yeast(编辑lundbladv，struhl，k.))。

将100μl的雌激素测试溶液(zen或izom)溶解在50％乙醇中，与1.9ml的细胞密度为od600＝0.1的在sc-trp培养基中的菌株yzga817的酵母培养物相混合，并且在30℃和180rpm下温育18小时。此后，测定培养物的od600，并且将1ml的细胞粒状沉淀(10分钟，13krpm)重悬浮在500mlz-缓冲液中并用25μl氯仿进行渗透化。通过添加100μlonpg溶液(4mg/ml)来启动酶反应，并在通过添加250μl的1mna2co3溶液而出现黄色着色后终止酶反应。在420nm处对上清液进行测量，并如下来计算“相对单位”(相关于所使用的细胞量而言)：

ru＝(od420×1000)/(od600×以分钟表示的温育时间)。

如在图4中所显示的，zen在低的ppb范围内诱导gal7-lacz报道基因的表达，因此为了表达7.5个相对单位的β-半乳糖苷酶，需要大约45ppbzen(图4a)。与此相反，izom显示出低得多的动情性能。相比较而言，为了达到大致相同的效应，需要大约500ppb(图4b)。由此得出，izom相比于zen而言以几乎低100倍的程度发挥雌激素作用。

实施例4：序列同一性的测定

具有有着seqidno.1、2和3的氨基酸序列的多肽相互之间的序列同一性百分比的测定通过借助于程序blast(basiclocalalignmentsearchtool)，特别地用blastp(其可以在“nationalcenterforbiotechnologyinformation”的主页(ncbi；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行利用)的两个序列的相互匹配来进行。因此，可能的是，根据altschul等人，1997(nucleicacidsres.(1997)25：3389-3402)的算法，将两个或更多个序列互相进行比较。作为程序设置，考虑基本设置，但是特别地：“最大靶序列”＝100；“期望阈值”＝10；“字长”＝3；“矩阵”＝blosom62；“缺口成本”＝“存在：11；延伸：1”；“计算调整”＝“条件式组成得分矩阵调整”。在具有seqidno.1的序列和具有seqidno.3的序列之间的序列同一性为73％。