用于富集具有外源性免疫受体的工程化T细胞的抗体的用途和用于清除工程化T细胞的抗体的制作方法

本发明属于医学领域。尤其，本发明属于基因治疗的领域。本发明涉及免疫学和治疗癌症的细胞疗法。本发明进一步涉及富集工程化t细胞的方法，以及工程化t细胞在医学治疗中的用途。

背景技术：

正在开发具有工程化抗肿瘤特异性或抗病原体特异性的t细胞的过继转移。在这样的策略中，具有特定的抗肿瘤特异性，或特定的抗病原体特异性的外源性免疫受体，比如αβt细胞受体，或γδt细胞受体或嵌合抗原受体被从患者转移到自体t细胞，或，例如在异源的干细胞移植进入患者的情况下，进入响应的异源t细胞中。例如，正在经历血液干细胞移植的白血病患者在治疗期间也将清除淋巴细胞。因此，这种患者也可将从例如注入已经被工程化而表达特定抗白血病t细胞受体的供体t细胞获益。

尽管临床试验已经证实了过继转移tcr工程化细胞在癌症患者中的价值，但是这种策略的临床益处通常仅仅能在部分患者中观察到。对于观察到的tcr工程化t细胞有限效力的一种解释是新引入的tcr和内源性tcr之间竞争cd3组分造成的治疗性tcr的次优表面表达(provasi等natmed.2012年5月；18(5):807-15)。而且，这种策略在异源环境，例如异源的干细胞移植中的应用受到严重的安全性考虑的阻碍，因为表达内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞可在异源干细胞移植环境中诱导有害的副作用，比如例如移植物抗宿主疾病。因此，已经开发了选择工程化t细胞的策略，其关注工程化t细胞的阳性选择。迄今存在的策略的目的是包括替代基因标记，比如例如新霉素基因，或例如荧光蛋白质或允许阳性选择转导的或转染的细胞的一些其他的另外基因。但是，这种策略具有另外的安全性考虑，因为除了过继转移具有期望的特异性的外源性免疫受体，它们需要包括通常较大的可能是免疫原性的外源性基因。

另外，本领域也已经认识到，因为基因工程化细胞被注入患者的实际情况，万一发生副作用的情况下，从患者选择性清除这些细胞可能是有益的。因此，工程化t细胞通常除了外源性免疫受体，也包括其他基因使得选择性清除工程化t细胞。这种基因包括例如自杀基因，使得当施用试剂至患者时，选择性杀死具有自杀基因的细胞，比如hsv-tk(见，bondanza等，blood107，1828-1836(2006))。

因此，在本领域，工程化t细胞和用于受试者，比如用于治疗人的策略已经聚焦于在工程化t细胞中包括另外基因，使得选择用于受试者的工程化细胞和/或使得清除用所述工程化t细胞治疗的受试者的工程化t细胞。

技术实现要素：

本发明现提供了进一步方法，其使得富集工程化t细胞而不需要添加任何另外的基因。而且，该方法使得选择工程化t细胞，而没有工程化t细胞的任何干扰。工程化t细胞可保持不受影响。

本发明人认识到通过使用阳性选择方法，例如使用选择标记选择工程化t细胞，可仍存在工程化t细胞的亚群，使得除了表达期望的特异性的外源性免疫受体和分开的选择标记之外，还表达功能水平的内源性αβt细胞受体。将在任何阳性选择策略中选择这种亚群并且可限制工程化细胞产物的治疗性效力和安全性。现有技术还没有提供允许清除这种亚群的方法。

此外，使用例如结合外源性免疫受体的抗体的选择工程化t细胞的阳性选择方法可诱导大量的转导细胞的细胞凋亡。另外，包括选择标记的阳性选择方法需要添加可诱导有害的免疫应答的基因，如此选择标记通常是非宿主的(例如非人的)并且所以可被识别为是外源的而使得宿主清除转导的细胞。

因此，本发明人开始开发新的策略，其除了选择工程化t细胞之外，也可清除如上述有害的亚群，除了外源性免疫受体，不需要工程化t细胞包括任何另外基因，并且使得工程化t细胞不受影响。

本发明的富集工程化t细胞方法与涉及使用阴性选择步骤的任何现有技术方法相反。从包括具有外源性免疫受体的工程化t细胞和具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞的t细胞混合物，可从混合物分离非工程化的αβt细胞。这种方法也包括分离下述任何工程化t细胞，所述工程化t细胞包括在具有次优表达外源性免疫受体并且可仍具有大量表达的内源性αβt细胞受体的t细胞的混合物中。这种方法也使得包括在t细胞的混合物中的工程化t细胞不受影响，避免例如非期望的诱导可能在使用结合工程化t细胞的抗体的阳性选择方法中出现的细胞凋亡。

所述方法包括使用特异性结合内源性αβt细胞受体的选择性抗体。因此，它们的细胞表面上包括内源性αβt细胞受体的t细胞的混合物中的任何t细胞将从混合物分开，从而获得具有外源性免疫受体的工程化t细胞的富集制品。这种选择性抗体使用内源性αβt细胞受体和外源性免疫受体的序列差异。即使相同来源的工程化的t细胞的αβt细胞受体也可用作外源性免疫受体。所需要的是修饰对应内源性αt细胞受体的抗体的结合位点的外源性αβt细胞受体的氨基酸序列，使得抗体不再与其结合。可包括进一步修饰，例如维持或优化t细胞受体功能、维持特异性和/或引入优选的两条链的配对。

选择性抗体可用在分离技术，比如macs、facs和免疫亲和性色谱中。如本发明获得的富集工程化t细胞的制品尤其用于医学治疗。这种医学治疗可以是癌症的治疗。例如，在白血病的治疗中，进行异源干细胞移植的患者也可从注入富集工程化t细胞，即同种异体工程化t细胞的制品获益，所述工程化t细胞可通过本发明的任何方法获得，并且其是提供例如对于患者的白血病细胞具有特异性的外源性免疫受体的工程化t细胞。如此，可进一步促进治疗时白血病的清除，同时可基本上降低或甚至完全避免了由于存在表达内源性αβt细胞受体的t细胞而诱导有害的副作用的风险。

类似地，在本发明的不同方面中，工程化淋巴细胞，即工程化t细胞或工程化nk细胞也可提供外源性免疫受体，例如car或工程化αβt细胞受体或(工程化)γδt细胞受体，使得外源性免疫受体与响应的内源性αβt细胞受体，或内源性γδt细胞受体不同，使得特异性针对外源性免疫受体的抗体将特异性清除工程化t细胞。本发明的这些方面描绘在富集方法的图1和清除方法的图2中。因此，与任何现有技术方法相反，不需要工程化t细胞中包括编码外源性免疫受体的基因之外的任何另外的基因，而使得清除工程化t细胞。

因此，与在现有技术中使用的利用例如选择标记的任何选择方法，或现有技术中使用的利用例如自杀基因的任何选择性杀死方法相反，本发明现提供了外源性免疫受体，其不需要任何另外的选择标记基因和/或任何另外的自杀基因。本发明现使得产生可以以不受影响的方式富集工程化t细胞，即工程化t细胞不需要任何结合任何外部试剂比如例如抗体或与任何外部试剂比如例如抗体相互作用。另外，用选择性抗体经特异性靶向外源性免疫受体，可清除，即消除具有可与内源性t细胞受体区分开的外源性免疫受体的工程化t细胞。富集过程中使用的相同修饰可用清除过程。在富集方法中，第一抗体选择性结合内源性αβt细胞受体，而不结合工程化αβt细胞受体的修饰序列。相反地，第二抗体现结合工程化αβt细胞受体的所述修饰序列，但是不结合内源性αβt细胞受体。如此，最低限度修饰的αβt细胞受体可提供为外源性免疫受体，其允许结合两种不同的选择性抗体而被富集和体内清除。所需要的是外源性免疫受体和特异性针对内源性αβt细胞受体的选择性抗体，和/或特异性针对外源性免疫受体的抗体。

因此，本发明现提供了结合选择性抗体的外源性免疫受体，不需要任何另外的外源性基因用于富集和/或清除工程化t细胞。

附图说明

图1.示意性显示了富集工程化t细胞的基本原理。a)提供了结合内源性αβt细胞受体的抗体(由箭头指示)。在该方案中，抗体结合恒定区。b)、c)、e)和f)提供了不结合提供的抗体的外源性免疫受体(由带交叉线的箭头指示)。b)显示了其中可变区(v)是内源性来源的而恒定区是另一物种的。恒定区的序列不同，使得抗体不与其结合。c)显示了其中部分恒定β链被另一物种的相应部分替换的内源性来源的αβt细胞受体。e)显示了γδt细胞受体和f)显示了嵌合抗原受体。d)显示了不适合作为外源性免疫受体的内源性来源的工程化αβ链，因为提供的抗体可与其结合。

图2.示意性显示了(体内)清除工程化t细胞的基本原理。提供了选择性结合(由箭头指示)b)中显示的外源性αβt细胞受体并且不结合(由带交叉线的箭头指示)如a)中所描绘的内源性αβt细胞受体的抗体。这种抗体可也结合如c)中显示的外源性αβt细胞受体，其基本上对应其中抗体的结合位点已经通过替换仅仅较少区域的β链而被引入β链的内源性αβt细胞受体。外源性αβt细胞受体的修饰，比如d)中描绘的不允许结合抗体的修饰，不适于用在清除策略中。类似地，提供的抗体选择性结合f)中显示的外源性γδt细胞受体而不结合如e)中所描绘内源性αβt细胞受体。抗体选择性靶向具有外源性免疫受体的工程化t细胞，而不靶向具有如a)和f)中所描绘的内源性t细胞受体的内源性t细胞。

图3.示意性显示了如在实施例部分所使用的外源性免疫受体和t细胞受体组分。a)提供了内源性来源的外源性αβt细胞受体。随后通过用来自另一物种的区段交换其区段来修饰该外源性αβt细胞受体。全部恒定区被替换，如b)中所显示。或β链的部分恒定区被替换，如c)中所显示。使用替换策略，以替换每条链的恒定区的不同的部分、不同的结构域(d1、d2、d3、d4)，用于鉴定与靶向内源性αβt细胞受体的抗体结合的序列。每条修饰的链与比如c)中所描绘的未修饰的链配对。在另一策略中，使用的外源性免疫受体是选择的γδt细胞受体。

图4.富集具有外源性γδt细胞受体的工程化t细胞制品的改善的抗肿瘤功能。通过从t细胞的混合物gmp级清除αβtcr阳性t细胞，富集γδtcr工程化t细胞。a)pmp71:γ-t2a-δ转导的αβt细胞在γδtcrt细胞分离(αβtcr清除)之前和就在其之后的流式细胞术表示。跟踪富集t细胞在t细胞扩增期间的γδtcr表达。t细胞用pan-γδtcr和pan-αβtcr抗体染色并且指出了每个象限中细胞的百分数。b)γδtcr转导的t细胞(总体，9％γδtcr+)和清除了αβtcr(41％γδtcr+)的t细胞与负载⁵¹cr的daudi细胞以指示的e:t比例温育4-5小时。pb:αmdm2/βp53转导的细胞用作对照t细胞。特异性裂解的百分数显示为三个+/-sd的平均值。通过双因素anova计算统计学显著性；**p<0.01；***p<0.001。c)γδtcr转导的总体(6％γδtcr+)和αβtcr消除的(51％γδtcr+)t细胞与所指示的不同肿瘤靶细胞温育并且通过ifnγelispot测量ifnγ分泌。pmp71:δngfr转导的t细胞用作对照t细胞。每15000个t细胞的ifnγ斑点显示为三个+sd的平均值。仅仅t细胞不产生任何显著水平的ifnγ。通过双因素anova计算统计学显著性；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图5.富集具有外源性γδt细胞受体的工程化t细胞制品消除的同种异体反应性和保留的抗肿瘤反应性。用pmp71:δngfr或pmp71:γ-t2a-δ逆转录病毒转导健康供体衍生的pbmc，富集γδtcr转导的t细胞(αβtcr消除和65％γδtcr+)或不富集(总体和9％γδtcr+)并且如所描述扩增。超过20天不刺激t细胞并且最后6天中断il-2并且视为是静息t细胞。a)静息t细胞与opm2肿瘤细胞和一组错配的ebv-lcl共培养24小时。通过ifnγelispot测量抗肿瘤活性和同种异体反应性。每15.000个t细胞的ifnγ斑点显示为三个+sd的平均值。

图6.消除αβtcr-mabbw242抗体与αβtcr恒定结构域中鼠氨基酸序列的结合。a)在使用pan-αβtcrmabbw242的macs阴性选择之后，有效富集用全鼠无义(αmdm2/βp53)αβtcr(αmu/βmu)转导的pbmc。左图表示包括转导的细胞和未转导的细胞的t细胞的混合物，如通过存在αβtcr⁺t细胞所阐释。右图表示富集对于小鼠αβtcr表达是阳性的细胞群体。群体中消除了表达内源性αβtcr的未转导的细胞。

b)用全鼠无义(αmdm2/βp53)αβtcr(αmu/βmu)、全人ny-eso-1αβtcr(αhu/βhu)或包括鼠恒定结构域的ny-eso-1嵌合αβtcr(αhumu/βhumu)转导jurma细胞。vβ4-染色和β小鼠-染色表示表达水平并且通过百分数指示。用αβtcr-pe染色表示临床级pan-αβtcr-mabbw242的结合并且由平均荧光强度(mfi)指示。对于所有的facs图：数据是7个单独实验的代表。

图7.人和小鼠α和β链的比对和结构域交换。

a)人和小鼠tcrα和tcrβ恒定区中氨基酸序列的比对。方框表示覆盖人和小鼠之间所有氨基酸差异的结构域；tcrcα具有三个不同的结构域，而tcrcβ具有四个结构域。星号表示人和鼠序列中相同的氨基酸。b)克隆至pmp71-载体的三个不同tcrα和四个不同tcrβ基因的示意性概述，深灰色方框表示人氨基酸序列侧翼的鼠源化结构域，如通过浅灰色方框所阐释。tcrcβ开始于edlkn，氨基酸编号1-5，直至kdsrg，氨基酸编号176-180。比对的小鼠tcrcβ的结构域3对应于具有突变q88h、y101h、n106e、e108k、t110p、q111e、d112g、r113s、a114p、i120n、v121i的人结构域3。也见，seqidnos.5和6的氨基酸217-250。v：可变区和c：恒定结构域。v：可变区和c：恒定结构域。图a和b改编自sommermeyer&uckert，2010，journalofimmunology。

图8.人tcrβ链中的结构域3是αβtcr-mabbw242结合抗原决定部位的一部分。分别用全人ny-eso-1αβtcr(αhu/βhu)、嵌合ny-eso-1αβtcr(αhumu/βhumu)或部分鼠源化tcrβ-链与相应的人tcrα-链的不同组合，或部分鼠源化tcrα-链与人tcrβ-链的组合转导jurma细胞。通过vβ4-染色测量tcr的表达并且测试所有的tcr-组合它们被αβtcr-mabbw242的识别，如通过流式细胞术所确定。数值表示vβ4阳性细胞部分的百分数和总体细胞群体的平均荧光强度(mfi)。

图9.有效的富集用部分鼠源化人αβtcr转导的工程化t细胞。

测试表达人αβtcr(αhu/βhu)、嵌合αβtcr(αhumu/βhumu)、β-链中具有鼠源化结构域3的αβtcr(αhu/βm3)或具有组合的鼠源化αm2和βm3-结构域的αβtcr(αm2/βm3)的jurma细胞通过macs阴性选择使用αβtcr-包被磁珠的富集(右图)。因为所有的tcr-链突变体是ny-eso-1/hla-a2特异性的，在分选之前，将它们与表达全人wt1特异性αβtcr的jurma细胞以1:1的比例混合，模拟细胞的异种群体(左图和中间图)。在清除之后，收集阴性细胞部分并且通过流式细胞术测量。vβ4-阳性部分表示ny-eso-1特异性tcr，和vβ21-部分表示wt1特异性tcr。数值表示对vβ4染色或vβ21染色是阳性的细胞的百分数。

图10.来自人trc-domain和小鼠tra、trb、trg和trdc-domain的c-domain序列的例子的比对。序列和相应的seqidno列在表1中。

定义

在下述说明书和实施例中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书，包括这些术语给定范围的清晰和一致的理解，提供了下述定义。除非本文另外定义，否则使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的普通技术人员通常理解的相同含义。所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的公开以它们的整体通过引用并入本文。

进行本发明方法中使用的常规技术的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组dna、生物信息学、基因组学，测序和相关领域的常规的技术是本领域技术人员所熟知的并且在例如下述参考文献中进行了讨论：sambrook等，molecuarcloning.alaboratorymanual，第二版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1989；ausubel等，currentprotocolosinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987和定期更新；以及enzymology，academicpress，sandiego中的系列方法。

在该文档和其权利要求书中，动词“包括”和其词形变化以其非限制性含义使用，意思是包括词后面的项目，但是不排除未具体提到的项目。其包括动词“基本上由……组成”以及“由……组成”。

如本文所使用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数提及物，除非上下文清楚地另外指出。例如，如上所使用，用于分离“一个”dna分子的方法，包括分离多个分子(例如10个、100个、1000个、1万个、10万个、100万个或更多个分子)。

比对(alignin)和比对(alignment)：术语“比对(aligning)”和“比对(alignment)”意思是基于存在相同或类似核苷的较短或较长的片段，比较两条或更多条核苷酸序列。用于比对核苷酸序列的数个方法是本领域已知的，如下面将进一步阐释。术语“比对(alignin)”和“比对(alignment)”也意味着基于存在相同或类似氨基酸的较短或较长的片段，比较两条或更多条氨基酸序列。用于比对氨基酸序列的数个方法是本领域已知的，如下面进一步阐释。

“基因的表达”指其中可操作地与适当的调节区域，尤其启动子连接的dna区域转录成rna的过程，所述rna是有生物活性的，即其能够翻译成有生物活性的蛋白质或肽(或活性肽片段)或其本身是有活性的(例如在转录后基因沉默或rnai中)。活性蛋白质在某些实施方式中指有组成型活性的蛋白质。编码序列优选地为有义定向并且编码期望的生物活性蛋白质或肽或活性肽片段。

如本文所使用，术语“可操作地连接”指多核苷酸元件以功能关系连接。当核酸与另一核酸序列以功能关系放置时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果启动子或转录调节序列影响编码序列的转录，则启动子或转录调节序列被可操作地连接至编码序列。可操作地连接意思是被连接的dna序列通常是连续的，并且其中必要地连接连续的和阅读框中的两个或更多个蛋白质编码区域。

术语“基因构建体”意思是包括可操作地与适当的调节区域(例如启动子)连接、在细胞中转录成rna分子(例如mrna)的区域(转录区域)的dna序列。基因构建体可因此包括数个可操作地连接的序列，比如启动子、5’前导序列包括例如参与翻译启动的序列、(蛋白质)编码区域、剪接供体和受体位点、内含子和外显子序列，和包括例如转录终止序列位点的3’非翻译的序列(也称为3’非翻译序列或3’utr)。

“同一性”是核苷酸序列或氨基酸序列的一致性的度量。一般而言，比对序列从而获得最高级别的匹配。“同一性”本身具有本领域认可的含义并且可使用公开的技术计算。见，例如：(computationalmolecularbiology，lesk，a.m.，ed.，oxforduniversitypress，newyork，1988；biocomputing：informaticsandgenomeprojects，smith，d.w.，ed.，academicpress，newyork，1993；computeranalysisofsequencedata，parti，griffin，a.m.和griffin，h.g.，eds.，humanapress，newjersey，1994；sequenceanalysisinmolecularbiology，vonheinje，g.，academicpress，1987；和sequenceanalysisprimer；gribskov，m.和devereux，j.，eds.，mstocktonpress，newyork，1991)。尽管存在许多方法测量两条多核苷酸或多肽序列之间的同一性，但是术语“同一性”是技术人员熟知的(carillo，h.和lipton，d.，siamj.appliedmath(1988)48:1073)。通常用于确定两条序列之间同一性或相似性的方法包括但不限于下面公开的那些：guidetohugecomputers，martinj.bishop，ed.，academicpress，sandiego，1994和carillo，h.和lipton，d.，siamj.appliedmath(1988)48:1073。确定同一性和相似性的方法编写在计算机程序中。确定两条序列之间同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于gcs程序包(devereux，j.等，nucleicacidsresearch(1984)12(1):387)，blastp，blastn，fasta(atschul，s.f.等，j.molec.biol.(1990)215:403)。

如本文所使用，术语“启动子”指核酸序列，其用于控制一个或多个基因的转录、位于基因的转录起始位点的转录方向的上游，并且结构上通过存在用于dna依赖性rna聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他dna序列，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏和激活蛋白质结合位点，和本领域技术人员已知的核苷的直接或间接用于调节从启动子转录量的任何其他序列来鉴定。任选地，术语“启动子”在本文也包括5’utr区域(5’非翻译区)(例如本文启动子可包括基因的翻译启动密码子上游(5’)的一个或多个部分，因为该区域可用于调节转录和/或翻译)。

术语“氨基酸序列”或“蛋白质”或“肽”指由氨基酸链组成的分子，而不指特定的作用模式、尺寸、3维结构或来源。其“片段”或“部分”可因此仍称为“氨基酸序列”或“蛋白质”或“肽”。

“工程化细胞”，在本文指已经通过例如引入外源性核酸序列或特定改变内源性基因序列而被工程化的细胞。引入的外源性核酸序列可包括可被修饰的任何物种的野生型序列。工程化细胞可包括遗传修饰，比如内源性基因的一个或多个突变、插入和/或缺失和/或基因组中外源性核酸(例如基因构建体)的插入。工程化细胞可指分离的或培养的细胞。工程化细胞可以是“转导细胞”，其中细胞已经被例如工程化病毒感染。例如，可使用逆转录病毒载体，比如实施例中所描述，但是也可考虑其他适当的病毒载体，比如慢病毒。也可使用非病毒方法，比如dna载体的转染或电穿孔。可使用的dna载体是转座子载体。因此，工程化细胞可也以是“稳定转染的细胞”或“瞬时转染的细胞”。转染指非病毒方法，将dna(或rna)转移至细胞使得基因表达。转染方法是本领域广泛已知的，比如核酸的磷酸钙转染、peg转染，和脂质体或脂质体复合物转染。这种转染可以是瞬时的，但是也可以是稳定转染，其中细胞可被选择，因为其具有整合在它们基因组中的基因构建体。

术语“选择标记”是本领域普通技术人员熟悉的术语并且本文用于描述当表达时可用于选择包含选择标记的细胞的任何基因实体。选择标记基因产物赋予例如抗生素抗性，或另一可选择的特性或营养要求。选择标记，比如本领域熟知的包括绿色荧光蛋白(gfp)、egfp、荧光素酶、gus等。

“αβt细胞”或“alphabetat细胞”可从功能角度定义，因为表达αβtcr的t淋巴细胞，其识别与在各种细胞的表面上表达的mhc分子(主要组织相容性复合物)结合的肽。mhc呈递源自细胞的蛋白质的肽。当，例如细胞被病毒感染时，mhc将呈递病毒肽，并且αβtcr和mhc-复合物之间的相互作用激活特定类型的t-细胞，其启动并且免疫应答，以清除感染的细胞。因此，αβt细胞可在功能上定义为能够识别与mhc分子结合的肽的细胞。可使用对于αβt细胞受体特异性的抗体，比如下面描述的(例如对于人αβtcr特异性的bw242抗体)来鉴定αβt细胞。αβt细胞可选自外周血液，例如经cd3抗原，因为大部分t细胞具有αβtcr。这种选择也将包括γδt-细胞。从这些选择的细胞，可确定对应αt细胞受体链和βt细胞受体链的核酸(或氨基酸)序列。因此，αβt细胞也可定义为包括对应αt细胞受体链和/或βt细胞受体链的核酸(或氨基酸)序列的细胞。

“γδt细胞”或“gammadeltat细胞”表示触发它们激活的抗原分子还是大部分未知的t细胞的少数子集。γδt细胞可视为是获得性免疫性的组分，因为它们使tcr基因重排，以生产连接多样性并且将发展记忆表型。但是，各种子集也可视为是先天性免疫性的一部分，其中受限的tcr用作模式识别受体。例如，vγ9/vδ2t细胞被一组共同称为磷酸化抗原的非肽类磷酸化的类异戊二烯前体特异性和快速激活。可使用特异性针对γδt细胞受体的抗体来鉴定γδt细胞。适于facs的抗体是广泛可用的。选择条件，比如抗体制造商提供的，使得选择阴性和/或阳性细胞。可能适当的抗体可获得自bdpharmingen(bd，1bectondrive，franklinlakes，njusa)，γδtcr-apc(克隆b1，#555718)或可获得自beckmancoulter，pan-γδtcr-pe(克隆immu510，#im1418u)。而且，从这些选择的细胞，可确定对应γt细胞受体链和/或δt细胞受体链的核酸(或氨基酸序列)序列。因此，γδt细胞也可定义为包括对应γt细胞受体链和/或δ2t细胞受体链的核酸(或氨基酸)序列的细胞。

t细胞或t淋巴细胞，属于称为淋巴细胞的白细胞家族，其在细胞介导的免疫性中发挥作用。t细胞源自于骨髓中的造血干细胞，在胸腺(t发源的地方)中成熟，并且在外周淋巴组织中获得它们全部的功能。在t细胞发育期间，由于初始β或δtcr基因重排，cd4^-cd8^-t-细胞(cd4和cd8共受体都是阴性)发展为αβ(αβ)或γδ(γδ)。经历早期β链重排的细胞在细胞表面上表达由全部的β链组成的前tcr结构和前tcrα链。这种细胞转变至cd4⁺cd8⁺状态，使tcrα链基因座重排，并且在表面上表达αβtcr。成功完成γ基因重排的cd4^-cd8^-t细胞在β基因重排之前表达γδtcr并且仍是cd4^-cd8^-。(claudiotripodo等gammdeltatcelllymphomasnaturereviewsclinicaloncology6，707-717(2009年12月)。t细胞受体与cd3蛋白关联，以形成t细胞受体复合物。t细胞，即表达αβtcr或γδtcr，在细胞表面上表达t细胞受体复合物。γδt细胞占t细胞总群体的约1-5％。t细胞受体链的细胞外区域包括可变区。t细胞受体链的可变区具有三个互补决定区(cdr1、cdr2、cdr3)。这些区域一般而言是非常易变的并且有助于tcr之间的多样性。在t细胞的发育期间组成cdr区，其中所谓的可变-(v)基因区段、多样-(d)基因区段，和连接-(j)基因区段被随机组合而产生多种多样的tcr。t细胞受体链的恒定区，即作为α、β、γ或δ链基本上不变。类似地，t细胞受体链的框架区，即作为α、β、γ或δ链也基本上不变。

天然杀伤细胞(nk细胞)定义为大颗粒淋巴细胞(lgl)并且组成由常见的产生b和t淋巴细胞的淋巴祖先分化的第三类细胞。已知nk细胞在骨髓、淋巴结、脾、扁桃体和胸腺中分化和成熟，其中它们进入循环。nk细胞不表达t细胞抗原受体(tcr)或pant标记cd3或表面免疫球蛋白(ig)b细胞受体，但是它们通常在人中表达表面标记cd16(fcγriii)和cd56，在c57bl/6小鼠中表达nk1.1或nk1.2。高达80％的人nk细胞也表达cd8。

如本文使用的和本领域已知的，术语“抗体”指包括具有互补决定区(cdr)的抗原结合位点的任何多肽。术语包括但不限于抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体、单链抗体、仅仅重链的抗体、llama抗体、单结构域抗体和纳米抗体(例如vhh)。术语“抗体”也可包括免疫球蛋白片段，比如fab、f(ab’)2、fv、scfv、fd、dab，和其他抗体片段或保留抗原结合功能的包括cdr的其他构造。典型地，这种片段包括抗原结合结构域。抗体或其片段可包括任何已知的抗体同种型和它们的构象，例如，iga，比如iga1或iga2、igd、ige、igg，比如igg1、igg2a、igg2b、igg3、igg4或igm类别。

发明详述

工程化t细胞的富集

在第一方面中，本发明涉及从t细胞混合物富集具有外源性免疫受体的工程化t细胞的方法，所述t细胞混合物包括具有外源性免疫受体的工程化t细胞和具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞，所述方法包括下述步骤：

a)提供t细胞混合物，所述t细胞混合物包括具有外源性免疫受体的工程化t细胞和具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞；

b)使t细胞混合物接触特异性结合内源性αβt细胞受体的抗体，以使得形成抗体-非工程化t细胞复合物；

c)从t细胞混合物分离抗体-非工程化t细胞复合物，从而获得富集工程化t细胞的制品。

根据本发明的具有外源性免疫受体的工程化t细胞是已经被工程化使得它们表达外源性免疫受体的t细胞。就抗原识别和t细胞作用而言，外源性免疫受体与内源性t细胞受体具有相同的功能。非工程化t细胞是表达内源性t细胞受体的细胞。内源性t细胞受体是γδt细胞受体类型或αβt细胞受体类型。

根据本发明的外源性免疫受体定义为不是内源性t细胞受体。例如，外源性免疫受体可以是特定选择的γδt细胞受体，其用于癌症的治疗。所述序列可与内源性γδt细胞受体类似。差异在于外源性免疫受体已经被有意地为特定的靶标所选择。外源性免疫受体由例如转基因构建体表达并且不被内源性基因座表达。与被工程化，以提供具有外源性免疫受体的工程化t细胞的t细胞的来源相比，根据本发明的外源性免疫受体可以是不同来源的，即来自另一物种。与被工程化，以提供具有外源性免疫受体的工程化t细胞的t细胞的来源相比，外源性免疫受体可以是相同来源的，即来自相同的物种。外源性免疫受体也可以是工程化γδt细胞受体或工程化αβt细胞受体。

工程化t细胞受体是这样的t细胞受体，其氨基酸序列已经被修饰使得其与内源性t细胞受体的相应氨基酸序列相比，具有不同的氨基酸序列，即至少不考虑其cdr。因此，如在工程化t细胞受体中呈现的修饰不应干扰初始的抗原特异性。在实施例部分，这通过负载对于初始t细胞受体特异性的肽抗原的荧光标记的mhc-多聚体，由工程化的和非工程化t细胞受体之间相当的染色水平所表明。这种工程化涉及修饰例如一条或两条t细胞受体链的恒定区的氨基酸序列。

外源性免疫受体也可以是嵌合抗原受体(car)。嵌合抗原受体(car)是重组受体，其结合了抗原特异性抗体的特异性与t细胞的激活功能(如最近综述shi等，molcancer.2014sep21；13:219)。car可以是抗体和允许在免疫细胞的细胞表面上表达抗体以及信号转导至细胞跨膜结构域之间的融合分子。

在本发明的一个方面中，外源性免疫受体选自工程化γδt细胞受体、工程化αβt细胞受体、γδt细胞受体或嵌合抗原受体(car)。在本发明的一个方面中，外源性免疫受体选自工程化γδt细胞受体、工程化αβt细胞受体或γδt细胞受体。在另一方面中，外源性免疫受体选自工程化αβ或γδt细胞受体。

在方法的第一步骤中，提供t细胞混合物，其包括具有外源性免疫受体的工程化t细胞和表达内源性αβt细胞受体的t细胞。可如下面进一步描述来制备这种t细胞混合物。该t细胞混合物接触特异性结合内源性αβt细胞受体的抗体，以使得形成抗体-非工程化t细胞复合物。特异性结合内源性αβt细胞受体的所述抗体不特异性结合外源性免疫受体。因此，所述抗体对于内源性αβt细胞受体是选择性的。

特异性结合αβt细胞受体的抗体结合例如t细胞受体的α链、t细胞受体的β链，或t细胞受体的α和β链。人来源的α和β链的细胞外结构域的例子分别列举在seqidno.1-2中。如所描述的，αβt细胞受体具有可变区，最可变的区域由α和β链的cdr组成。因为非工程化t细胞的所述内源性αβt细胞受体就特异性而言是异种的，所以特异性结合内源性αβt细胞受体的抗体结合异种群体的αβt细胞受体。因此，抗体特异性结合在异种群体的αβt细胞受体中出现的αβt细胞受体的区域。优选地，抗体特异性结合αβt细胞受体的恒定区。优选地，抗体特异性结合人α链的恒定区，和/或人β链的恒定区。优选地，抗体优选地结合人α链的恒定区，如seqidno.1所列举和如图7a中所描绘，和/或结合人β链的恒定区，如seqidno.2所列举和如图7a中所描绘。

特异性结合αβt细胞受体的抗体的结合可通过例如facs分析来检测。例如，非工程化t细胞接触对照抗体或特异性结合αβt细胞受体的抗体。根据本发明，特异性结合αβt细胞受体的抗体可定义为导致相对于对照抗体平均荧光强度(mfi)增加的抗体，如果流式细胞术所测定。mfi是选择的荧光通道中荧光强度的平均值(fitc、pe、percp等)。作为阴性对照抗体，可使用不结合免疫球蛋白(或非常不同免疫球蛋白)的抗体。因此，本领域技术人员非常能够选择适当的条件，以确定抗体与αβt细胞受体的特异性结合。抗体结合可由特异性和亲和性来表示。特异性决定了抗体结合哪种抗原或其抗原决定部位。亲和性是抗体和抗原之间结合强度的度量(ka)。

因此，本领域技术人员非常熟练选择特异性结合内源性αβt细胞受体的抗体。例如，特异性结合人内源性αβt细胞受体的抗体可商业上获得自miltenyi(miltenyibiotecgmbh，friedrich-ebert-straβe68，51429bergischgladbach，德国)。该抗体来自细胞克隆bw242/412，其是小鼠同种型igg2b。fitc标记的bw242/412抗体可获得自miltenyi，货号130-098-688。bw242/412细胞克隆和bw242/412表达的抗体详细描述在例如ep0403156b1中，其通过引用并入本文。尤其，这种抗体是由bma031重链和轻链序列，如ep0403156b1中为克隆bma031列举重链和轻链序列编码的抗体。其他适当的抗体例如抗αβtcr抗体可获得自beckmancoulter，marseillecedex，法国，例如pan-αβtcr-pe(#a39499)或pan-αβtcr-pc5(#a39500)。进一步适于小鼠αβ链的可以是鼠tcrβ-pe(克隆h57-597)，可获得自bdpharmingen(bd，1bectondrive，franklinlakes，njusa)。

在形成抗体-非工程化t细胞复合物之后，接下来将抗体-非工程化t细胞复合物从t细胞混合物分离，从而获得富集工程化t细胞的制品。如此，从t细胞混合物中去除了具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞。使用特异性抗体的适当的分离步骤是本领域熟知的。例如，磁激活细胞分选(macs)、荧光激活细胞分选(facs)或免疫亲和性色谱是可以使用的方法。特异性结合αβt细胞受体的抗体可连接用于macs的磁珠，或为facs荧光标记，或连接适当的色谱树脂。利用macs或免疫亲和性色谱，获得了不结合树脂的细胞，从而获得了富集工程化t细胞的制品。在facs中，获得了未标记的细胞，从而获得富集工程化t细胞的制品。作为仅仅使用特异性结合αβt细胞受体的抗体的可选方案，可使用对于所述抗体特异性的第二抗体。例如，当所述抗体是小鼠抗体时，可使用与树脂或磁珠连接的山羊-抗小鼠抗体。抗体-非工程化t细胞复合物将经山羊-抗小鼠抗体结合树脂或磁珠。或者，特异性结合αβt细胞受体的抗体可携带生物素标签，比如在实施例中描述的标签，和可使用与树脂或磁珠连接的抗生物素抗体。因此，许多分离方法是本领域技术人员可用的和熟知的，可适于从t细胞混合物分离抗体-非工程化t细胞复合物，从而获得富集工程化t细胞的制品。

如所述的，t细胞混合物也可包括具有次优表达外源性免疫受体并且可仍具有表达的大量内源性αβt细胞受体的工程化t细胞。因此，提供的t细胞混合物可包括具有外源性免疫受体的工程化t细胞、具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞，以及具有外源性免疫受体和内源性αβt细胞受体的工程化t细胞。因此，在分离步骤中，具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞，和具有外源性免疫受体和内源性αβt细胞受体的工程化t细胞也可被从混合物分离。因此，分离步骤不限于仅仅从混合物分离内源性αβt细胞。因此，当在方法的步骤a)中，提供t细胞混合物时，该混合物也可包括具有外源性免疫受体和内源性αβt细胞受体的这种工程化t细胞。在步骤b)中，可接着经内源性αβt细胞受体形成抗体-工程化t细胞复合物，以使得在步骤c)中分离这些细胞，以及非工程化t细胞细胞。例如，如图4a左图所显示，t细胞混合物包括具有外源性免疫受体的工程化t细胞(γδtcr，右下象限)、具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞(αβtcr，左上象限)，和具有外源性免疫受体和内源性αβt细胞受体的工程化t细胞(γδtcr和αβtcr二者，右上象限)。当清除时，去除了αβtcr阳性细胞，包括为γδtcr和αβtcr标记的大部分细胞。这种细胞通常在目前可用的任何标准阳性选择方法中也将被保留。

如所述的，在本发明的方法中，提供的t细胞混合物包括具有外源性免疫受体的工程化t细胞和具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞。在本发明的一个实施方式中，提供所述混合物包括下述步骤：

i.提供t细胞；

ii.提供编码外源性免疫受体的核酸；

iii.将核酸引入t细胞，从而提供t细胞混合物，所述t细胞混合物包括具有外源性免疫受体的工程化t细胞和具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞。

提供t细胞的步骤可包括提供αβt细胞，例如经使用macs选择来选择细胞，使用例如αβt细胞受体抗体，比如bw242。提供t细胞的步骤也可包括提供包括t细胞的pbmc，所述t细胞包括γ和δt细胞和αβt细胞。提供t细胞的步骤也可包括经用cd3抗体的macs选择，提供细胞混合物，所述细胞包括αβt细胞和γδt细胞，例如t淋巴细胞。t-细胞可以是原代细胞，例如来自受试者，比如人受试者。只要细胞群体，或其大部分包括表达αβt-细胞受体的细胞，即在例如facs分选中对于αβt-细胞受体是阳性的，任何细胞类型，原代细胞或任何其他细胞系都将是合适的。

外源性免疫受体可以是例如γδt细胞受体，其包括第一条链，γ链和第二条链，δ链。这些可提供在单个核酸或两个分开的核酸上。第一核酸编码第一条链，和第二核酸编码第二条链，或单个核酸编码第一条链和第二条链二者。所述核酸可以是dna或rna。只要当其引入细胞和表达使得外源性免疫受体的氨基酸序列，其编码在细胞的表面上表达。

优选地，在一种实施方式中，编码外源性免疫受体的核酸编码外源性免疫受体，比如实施例部分中所描述的，其中不同的链，即α和β链或γ和δ链，作为单个翻译蛋白质产物表达，其在两条链的编码序列之间包括f2a或t2a肽接头序列，比如实施例中所描述，使得翻译的蛋白质自切割而形成分开的链。

编码外源性免疫受体的核酸可以是mrna，当例如经转染引入至t细胞的细胞质时，其可直接在外源性免疫受体中翻译。优选地，编码例如t-细胞受体链的核酸包括在基因构建体中。基因构建体使得编码外源性免疫受体的mrna表达，使得其在工程化t细胞的表面上表达。基因构建体可包括在dna载体或病毒载体中。核酸的引入可经转染或转导方法，这取决于使用哪种类型的核酸。应理解，取决于使用的基因构建体的类型，基因构建体可由dna或rna组成。例如，当基因构建体并入逆转录病毒或慢病毒载体基因时，构建体包括在rna载体基因组(即编码基因构建体的序列)中。逆转录病毒和慢病毒载体是本领域熟知的，其具有rna基因组，当进入细胞时，逆转录成dna，随后整合进入宿主基因组。因此，逆转录使得遗传信息，即基因构建体从rna转移至双链dna，从而允许从其表达。整合是有利的，因为其使得转导细胞增殖，同时保留了包括基因构建体的病毒载体基因组。基因构建体也可包括在dna载体，例如质粒dna中。适当的dna载体可以是转座子。适当的转座子系统(例如基于i类或ii类)是本领域熟知的。如所述的，当外源性免疫受体包括两个链，例如γ和δt细胞受体链时，可提供两个分开的基因构建体，例如在单个或两个分开的逆转录病毒或dna载体上。可选地，单个基因构建体也可表达编码两条链的单个mrna，比如实施例部分中描述。这种mrna可分别编码两条链，例如经ires，或经使用如本文所描述的自我可切割的肽序列。

使用的核酸提供了编码的外源性免疫受体的表达。这例如经通过使用例如强启动子的高水平表达外源性免疫受体而实现。使用高表达水平使得抑制内源性t细胞受体表达，如在实施例部分所例证。内源性t细胞表达也可经可选的和另外方法比如例如经shrna表达的rnai、锌指、crispr或talens所抑制。

无论如何，将核酸引入t细胞可能是有效的，但是可提供t细胞混合物，所述t细胞混合物包括具有外源性免疫受体的工程化t细胞和具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞。具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞表示其中没有引入核酸的t细胞。而且，因为所述工程化t细胞也可包括也存在于t细胞混合物中的工程化t细胞的亚群，其中引入不导致(足够)抑制内源性αβt细胞受体。没有(足够)抑制内源性αβt细胞受体的t细胞这种亚群也可从t细胞混合物中有效去除，因为抗αβt细胞受体抗体可与其结合。工程化t细胞的这种群体在例如facs分析中对于外源性免疫受体和内源性αβt细胞受体可被阳性染色。

包括外源性免疫受体的工程化t细胞也可包括选择标记。除了外源性免疫受体，选择标记可定义为允许选择和其一起提供的细胞的任何核酸序列和/或氨基酸序列。例如，选择标记可以是新霉素或嘌呤霉素抗性基因。可通过在存在新霉素或嘌呤霉素的情况下温育，进行选择已经转移基因构建体和/或载体的细胞。其他选择标记可以是例如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的任何一种。可然后通过使用例如facs进行选择。如上所述，导致不充分抑制内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞可包括基因构建体并且因此也包括选择标记。这种细胞是非期望的并且去除这些也将导致工程化t细胞的富集。因此，该富集方法也受益于现有技术的工程化t细胞，其已经用阳性选择方法选择，例如通过包括另外的选择标记和/或通过用针对外源性免疫受体的抗体选择细胞。

但是，具有选择标记不是必须的，因为本发明的方法使得去除非工程化细胞，而不用使用任何选择标记。应理解，根据本发明，选择标记不是外源性免疫受体。因此，在本发明的一个方面中，工程化t细胞不分别表达选择标记。因此，根据本发明的所述核酸除了编码外源性免疫受体，不必编码分别表达的选择标记。因此，在一种实施方式中，编码外源性免疫受体的所述核酸或dna载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、转座子等不包括选择标记。应理解，选择标记在工程化t细胞中是有功能的。

在本发明的另一方面中，包括非工程化t细胞和工程化t细胞的t细胞混合物是人细胞。因此，这意味着编码外源性免疫受体的核酸被引入人t细胞，以提供这种t细胞混合物。这意味着在该方法中使用的抗体特异性结合人αβt细胞受体。在本发明的进一步方面中，特异性结合人αβt细胞受体的抗体是bw242/412抗体。如所述的，所述抗体商业上可获得自miltenyi(miltenyibiotecgmbh,friedrich-ebert-straβe68,51429bergischgladbach，德国)并且详细描述在，例如ep0403156b1中，其通过引用并入本文。

如上所述，特异性结合内源性αβt细胞受体的抗体不特异性结合外源性免疫受体。因此，这些选择标准适用于可由该方法选择的任何抗体。所以，虽然作为转基因提供，但是外源性免疫受体可能不对应对于使用的t细胞是内源性的αβt细胞受体。这是因为，在本发明的步骤b)和c)中，不仅仅去除了非工程化t细胞而且也去除了工程化t细胞。假如期望使用αβt细胞受体作为外源性免疫受体，因此需要修饰序列，使得抗体不再特异性结合外源性免疫受体。因此，在本发明的一个方面中，外源性免疫受体是工程化αβt细胞受体。

在本发明的一个方面中，外源性免疫受体是γδt细胞受体或工程化γδt细胞受体或工程化αβt细胞受体。在本发明的一个方面中，外源性免疫受体是γδt细胞受体或工程化γδt细胞受体或工程化αβt细胞受体，其中外源性免疫受体是具有相同来源的t细胞混合物。在另一方面中，外源性免疫受体是人γδt细胞受体或人工程化γδt细胞受体或人工程化αβt细胞受体。与αβt细胞受体相对照，γδt细胞受体的序列不同于αβt细胞受体。因此，特异性结合内源性αβt细胞受体的抗体通常不特异性结合任何内源性γδt细胞受体。因此，不需要修饰用作外源性免疫受体的γδt细胞受体。然而，出于其他原因，也可能考虑修饰γδt细胞受体，例如当工程化t细胞在体内使用并且与内源性γδt细胞区分时，如下面进一步阐释。

在一种实施方式中，外源性免疫受体是γδt细胞受体，其包括如seqidno.3和seqidno.4中列举的γ和δ链序列。这些序列对应g115和δ5。具有该外源性免疫受体的工程化t细胞可通过使用例如bw242抗体来富集。

在本发明的另一方面中，工程化αβt细胞受体或工程化γδt细胞受体包括修饰恒定区。修饰恒定区可能是有利的，因为可避免影响可变区和因此影响抗原特异性和/或亲和性的任何风险。

在一种实施方式中，在根据本发明的方法中，特异性结合人αβt细胞受体的抗体是bw242/412抗体和外源性免疫受体是工程化人αβt细胞受体。优选地，工程化包括修饰人αβt细胞受体的恒定区。更优选地，修饰恒定区包括修饰t细胞受体β链的结构域3，其中优选地修饰包括结构域3的鼠源化。如在实施例部分例证的，bw242/412抗体的结合位点定位在t细胞受体β链的结构域3。因此，仅仅修饰该区域将使得bw242/412抗体对于人内源性αβt细胞受体是选择性的，而基本上结合外源性免疫受体，即所述修饰的人αβt细胞受体链。优选地，αβt细胞受体链包括鼠结构域3相应的鼠氨基酸序列，代替人βt细胞受体的人结构域3结构域3，如图7a中所描绘(见人序列的氨基酸88-121，如与相应的小鼠序列对比)。

因此，如在对于bw242抗体(或bma031抗体)的实施例部分所显示，结合通过定位结合内源性αβt细胞受体的抗体的结合位点对相应的人αβt细胞受体的特定修饰，可使相应的人αβt细胞受体的修饰最小化。例如，bw242/412抗体的结合位点现被定位于结构域3，进一步选择性修饰结构域3的氨基酸将鉴定与bw242/412抗体相互作用的结构域3的氨基酸。如此，可提供最小化修饰的工程化人αβt细胞受体，差别仅仅几个氨基酸。同样地，当在内源性αβt细胞受体和相应的工程化αβt细胞受体之间选择bw242之外的抗体时可使用相同的方法。

富集工程化t细胞和它们的用途

在另一实施方式中，根据本发明如上述的方法提供了可通过任何一种所述的方法获得的富集工程化t细胞的制品。与没有经历这种方法的制品相比，这种制品将包括较高百分数的工程化t细胞。可通过任何所述方法获得的这种富集工程化t细胞的制品也可定义为已经使用特异性结合内源性αβt细胞受体的抗体从中分离了非工程t细胞和具有内源性αβt细胞受体的差的工程化t细胞的富集工程化t细胞的制品。这种制品也可定义为其中富集工程化t细胞基本上不包括内源性αβt细胞受体的富集工程化t细胞的制品。这种制品也可定义为其中富集工程化t细胞基本上不包括内源性αβt细胞受体并且也不包括选择标记的富集工程化t细胞的制品。这种制品也可定义为其中富集工程化t细胞基本上不包括内源性αβt细胞受体并且也不包括选择标记以及还未用结合外源性免疫受体的抗体选择的富集工程化t细胞的制品。

当与使用阳性选择方法富集的现有技术的制品比较时，所述富集工程化t细胞的制品显示出增强的癌症细胞杀伤，如在实施例中所显示。也如在实施例部分中所显示，当为t细胞提供对于特定的癌症具有特异性的外源性免疫受体时，当为受试者提供富集所述工程化t细胞的所述制品时，这种细胞将被选择性杀死。因此，根据本发明的富集工程化t细胞的这种制品尤其用于医学治疗。可考虑的医学治疗是例如治疗癌症。因为工程化t细胞不再需要表达选择标记，可避免与表达选择标记相关的任何副作用。此外，富集工程化t细胞已经去除了几乎所有表达内源性αβt细胞受体的t细胞并且所以可避免造成有害靶向的内源性αβt细胞受体的任何风险。富集工程化t细胞也将不会遭受与比如在现有技术选择和富集方法中使用的，也可能降低施用的富集工程化t细胞产物质量的抗体结合外源性免疫受体相关的任何细胞死亡。

体内(富集)工程化t细胞的清除

在另一实施方式中，提供如上定义的特异性结合外源性免疫受体的抗体用于治疗当用可通过上述任何一种方法获得的富集具有所述外源性免疫受体的工程化t细胞的制品治疗时遭受副作用的受试者。如上所阐释，可通过本发明的任何一种方法获得的富集工程化t细胞用于医学治疗。但是，由于施用的富集工程化t细胞，这种治疗在一些情况下可导致不利的副作用。副作用可能是不受控的增殖或激活，或针对健康的细胞例如受试者的细胞上不可预知的抗原的激活。因此，在这种情形下，期望选择性清除(消除)施用至受试者的工程化t细胞。这可通过施用特异性靶向工程化t细胞，即包括外源性免疫受体的t细胞的抗体来实现。所述抗体不靶向内源性t细胞，比如内源性αβt细胞或内源性γδt细胞。如此，除了外源性免疫受体，工程化t细胞不再需要包括编码例如使得选择性杀伤工程化t细胞的自杀基因或其他基因的进一步基因构建体。

因为所述抗体不靶向内源性t细胞，如果使用具有对应内源性t细胞受体来源的工程化αβt细胞受体或工程化γδt细胞受体，则所述外源性免疫受体必须被修饰，即工程化，使得抗体仅仅靶向外源性免疫受体。例如，当使用小鼠结构域3区域替换人结构域3区域的外源性免疫受体时，所述抗体例如源自h57-597源自hb-218(atcc)靶向小鼠结构域3区域。如此，在人受试者中，抗体将选择性靶向工程化外源性免疫受体并且不靶向内源性t细胞受体。因此，定位例如结合小鼠αβt细胞受体或小鼠γδt细胞受体抗体的结合位点是有用的，因为其将提供可被转移至相应的人t细胞受体的各自t细胞受体的特定区域(或甚至特异性抗体)。优选地，如用提到的抗体bw242/412(用于富集)和h57-597(用于清除)例证的，用于富集的修饰区域的序列与用于清除比如源自小鼠结构域3区域的区域的序列相同。由于其在t细胞受体中突出的位置以及免疫原性的可能性，该区域可能尤其令人感兴趣。同样地，当使用可由可能与宿主蛋白(例如源自宿主抗体和/或源自宿主cd3)相同的组分构建的嵌合抗原受体时，选择不靶向相应的宿主蛋白而是仅仅靶向嵌合抗原受体的抗体。在与为αβtcr描述的相同的方法中，这种宿主序列也可被修饰，即工程化，施用的使得抗体不靶向所述宿主蛋白。因此，在使用嵌合抗原受体的情况下，在部分宿主序列可被修饰使得使用的抗体可区分工程化car和相应的宿主蛋白序列的角度，其可以是工程化的嵌合抗原受体。因此，通过比对例如小鼠序列和人序列，以及通过比较小鼠免疫受体和人免疫受体对于抗体的结合，比如实施例中所描述，人免疫受体可以是鼠源化的，即部分人免疫受体可被替换为鼠受体的相应部分。可通过比对人序列和小鼠序列，比如例如图10中所显示，容易获得相应部分。因此，鼠源化可涉及用鼠源的相应部分替换免疫受体的部分序列，这种部分可以是例如10-50个氨基酸长度，但是该部分也可包括是对应两条序列并且在两条序列之间不同的部分区域的一个或多个氨基酸。

优选地，治疗受试者涉及治疗人，其中优选地抗体是人抗体或例如源自非人抗体比如h57-597抗体的可变区经人源化而被工程化为人抗体骨架。优选地，使用人抗体，因为非人序列可引发有害的应答，例如在小鼠抗体的情况下，可激发人-抗小鼠应答，这不是所期望的。应理解，术语人抗体也包括人源化抗体。

如所述的，施用靶向外源性免疫受体和因此靶向工程化t细胞的抗体可诱导选择性杀伤工程化t细胞。这种选择性杀伤可在抗体结合外源性免疫受体之后诱导死亡。这种选择性杀伤可被直接或间接诱导。抗体骨架的人衍生序列优选治疗人，因为选择性杀伤可包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)或直接细胞凋亡。这种选择性杀伤的例子描述在实施例部分中。

就如上述医学用途而言，对于靶向工程化t细胞的抗体的用途，这种医学用途不限于如可通过本发明如上述的方法获得的富集工程化t细胞的制品。这种医学用途也可适用于任何工程化t细胞，前提是所述抗体特异性用于结合外源性免疫受体而不结合宿主的免疫受体或car中包括的宿主蛋白序列。这种工程化t细胞也可通过使用例如使用选择标记的现有技术方法来富集。此外，因为选择修饰t细胞的方法不是必需的，所述用途也适用于具有外源性免疫受体的工程化nk细胞。

因此，在另一实施方式中，提供特异性结合外源性免疫受体的抗体，用于治疗当用具有外源性免疫受体的工程化淋巴细胞治疗时遭受副作用的受试者。优选地，所述外源性免疫受体是工程化免疫受体。

优选地，所述受试者是人。优选地，所述工程化淋巴细胞是人工程化淋巴细胞。优选地，所述工程化淋巴细胞是工程化nk细胞或工程化t细胞。所述抗体最优选地是人抗体或人源化抗体，其如上所述优选地诱导具有外源性免疫受体的工程化淋巴细胞的细胞死亡。

实施方式

1.用于从t细胞混合物富集具有外源性免疫受体的工程化t细胞的方法，所述t细胞混合物包括具有外源性免疫受体的工程化t细胞和具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞，所述方法包括下述步骤：

a)提供t细胞混合物，所述t细胞混合物包括具有外源性免疫受体的工程化t细胞和具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞；

b)使t细胞混合物接触特异性结合内源性αβt细胞受体的抗体，以使得形成抗体-非工程化t细胞复合物；

c)从t细胞混合物分离抗体-非工程化t细胞复合物，从而获得富集工程化t细胞的制品。

2.根据实施方式1的方法，其中步骤a)包括下述步骤：

i.提供t细胞；

ii.提供编码外源性免疫受体的一种或多种核酸；

iii.将所述一种或多种核酸引入t细胞，从而提供t细胞混合物，所述t细胞混合物包括具有外源性免疫受体的工程化t细胞和具有内源性αβt细胞受体的非工程化t细胞。

3.根据实施方式2的方法，其中所述一种或多种核酸除了编码外源性免疫受体之外不编码分开表达的选择标记。

4.根据实施方式1-3任一项的方法，其中所述非工程化的和工程化t细胞是人。

5.根据实施方式4的方法，其中所述抗体是bw242/412。

6.根据实施方式1-5任一项的方法，其中所述外源性免疫受体是工程化αβt细胞受体，工程化γδt细胞受体。

7.根据实施方式6的方法，其中所述工程化αβt细胞受体或所述工程化γδt细胞受体是人工程化αβt细胞受体或人工程化γδt细胞受体。

8.根据实施方式6或实施方式7的方法，其中所述工程化αβt细胞受体或所述工程化γδt细胞受体包括修饰恒定区。

9.根据实施方式5的方法，其中所述外源性免疫受体是工程化人αβt细胞受体，其中所述工程化包括t细胞受体β链的结构域3的修饰，其中优选地所述修饰包括结构域3的鼠源化。

10.根据实施方式1-5任一项的方法，其中所述外源性免疫受体是γδt细胞受体，优选地是人γδt细胞受体。

11.通过实施方式1-9任一项的方法获得的富集工程化t细胞的制品。

12.根据实施方式11的富集工程化t细胞的制品在医学治疗中的用途。

13.根据实施方式12的富集工程化t细胞的制品在治疗癌症中的用途。

14.如实施方式1-9任一项定义的特异性结合外源性免疫受体的抗体在治疗受试者中的用途，所述受试者当用通过实施方式1-9任一项的方法获得的富集具有所述外源性免疫受体的工程化t细胞的制品治疗时遭受副作用。

15.根据实施方式14的抗体，其中所述受试者是人。

16.根据实施方式15的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。

17.根据实施方式14-16任一项的抗体，其中所述抗体诱导工程化t细胞的细胞死亡。

18.特异性结合外源性免疫受体的抗体在治疗受试者中的用途，所述受试者当用具有外源性免疫受体的工程化淋巴细胞治疗时遭受副作用。

19.根据实施方式18的抗体，其中所述受试者是人。

20.根据实施方式18或实施方式19的抗体，其中所述工程化淋巴细胞是人工程化淋巴细胞。

21.根据实施方式18-20任一项的抗体，其中所述工程化淋巴细胞是工程化nk细胞或工程化t细胞。

22.根据实施方式18-21任一项的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。

23.根据实施方式18-22任一项的抗体，其中所述抗体诱导具有外源性免疫受体的工程化淋巴细胞的细胞死亡。

实施例

实施例1

富集具有外源性免疫受体，即aγδt细胞受体的工程化人t细胞

细胞和细胞系

daudi、k562、mda-mb231、bv173、opm2和phoenix-ampho细胞获得自美国菌种保藏中心。opm2-荧光素酶(opm2-luc)和rpmi8226/s-luc(rpmi-luc)由antonmartens，scc9通过nielsbovenschen(bothuniversitymedicalcenterutrecht，荷兰)友情提供并且daudi-荧光素酶(daudi-luc)由genmab(utrecht，荷兰)友情提供。ebv-转化的类淋巴母细胞细胞系(ebv-lcl)(warren等，tissueantigens59,293-303(2002)由tunamutis(universitymedicalcenter，荷兰)友情提供。pbmc分离自可获得自sanquin血库(荷兰阿姆斯特丹)或德国法兰克福输血医学和免疫血液学协会的血沉棕黄层。来自aml患者的pbmc样品由matthiastheobald(德国美因茨)和universitymedicalcenterutrechtbiobank提供并且根据gcp和赫尔辛基条约收集。

γ9δ2tcr逆转录病毒载体设计

经密码子优化的组合tcr链交换获得高肿瘤活性γ9δ2tcr链基因，γ克隆g115和δ克隆5(geneartlifetechnologies，regensburg，德国)并且作为包含γ-链-ires-新霉素或δ-链-ires-嘌呤霉素的单个tcr链载体克隆至逆转录病毒载体pbullet。g115和δ克隆5包括seqidno.3和4中列举的序列。另外，通过交换两个不同的2a肽接头序列f2a和t2a，和tcr链的顺序设计包含两个tcr链的四个不同的转基因盒(γ9-f2a-δ2；δ2-f2a-γ9；γ9-t2a-δ2；γ9-t2a-δ2)(图1a)(szymczak等，naturebiotechnology22,589-594(2004)。这些tcr盒被克隆至优化的逆转录病毒载体pmp71(engels等humgenether14,1155-1168(2003)，以同时表达两条tcr链。由源自mdm2/hla-a2tcr的α链(stanislawski等，natimmunol2，962-970(2001)和源自p53/hla-a2tcr的β链(kuball等，immunity22，117-129(2005)组成的无义的鼠tcr在pbullet和pmp71逆转录病毒载体系统中都用作对照tcr。而且，pmp71中截短的神经生长因子受体在逆转录病毒转导实验中用作对照(pmp71:dngfr)。逆转录病毒载体使用标准方法经转导引入供体t细胞。发现使用标准试验，f2a和t2a导致外源性γ9δ2t细胞受体的表达并且能够诱导特异性裂解，以及在例如daudi或opm2癌症细胞系中诱导ifn-γ生产。发现，肽接头t2a产生较高的表达水平，如通过在转导供体t细胞的facs分析中测量γ9δ2tcr的平均荧光强度所测定的。此外，γ9-t2a-δ2产生ifn-γ生产的最高诱导。γ9-t2a-δ2载体用在进一步的实验中。

富集工程化t细胞

用pmp71:γ-t2a-δ转导αβt-细胞并且用生物素标记的抗αβtcr抗体(克隆bw242/412，miltenyibiotec，德国)温育随后用与磁珠连接的抗生物素抗体(anti-biotinmicrobeads，miltenyibiotec)温育。接下来，将细胞悬液施加在ld柱上并且根据制造商的方案(miltenyibiotec)通过macs细胞分离消除αβtcr阳性t细胞。

消除具有外源性γ9δ2tcr的富集工程化t细胞的同种异体反应性并且保留抗肿瘤活性

富集之后，利用先前描述的t-细胞扩增方案扩增γδtcrt细胞(riddell和greenberg，journalofimmunologicalmethods128,189-201(1990))。该方法使得几乎完全消除单αβtcr阳性t细胞(从51％至0.4％)并且显著增加γδtcr单阳性t细胞(从20％至77％)(图4a)。重要地，保留的αβtcr/γδtcr双阳性t细胞的特征在于内源性αβtcr的相对低的表面表达。该表型是稳定的，直到刺激之后的第5天，此时t-细胞是高度激活的和增生性的。但是，表型在第9天变为主要αβtcr/γδtcr双阳性t-细胞群体(68％)和降低的γδtcr单阳性细胞百分数(25％)，此时t细胞保持在更静息期(图4a)。

选择和扩增10天之后测试富集工程化t细胞的功能并且与没有清除了αβtcr的工程化细胞和对照比较。响应三种不同的肿瘤细胞系，αβtcrt细胞清除明显增加了daudi细胞的特异性裂解(p<0.01)(图4b)以及ifn-γ生产(p<0.001)(图4c)。在第10天也针对来自急性髓系白血病(aml)患者的一组原代白血病细胞测试工程化t细胞。用氨羟二磷酸二钠阻断异戊烯基焦磷酸下游的甲羟戊酸途径治疗白血病细胞，使得响应16个aml样品中的9个t细胞分泌ifnγ。在8个测试样品中的5个，与分离自健康供体的非工程化的多克隆g9d2t细胞相比，富集γδtcr工程化t细胞产生显著增强水平的ifnγ。

为了在体内用基本上再现表达内源性αβtcr链转移之后刺激静息t细胞，使用超过20天缺少刺激并且6天缺少il-2的工程化t细胞。针对一组13个错配的ebv-lcl细胞系或健康的供体衍生pbmc在ifnγelispot试验中测试mock(dngfr转导)、γδtcr工程化和γδtcr工程化αβtcr消除t细胞。响应13个ebv-lcl细胞系中的9个，mockt细胞产生ifnγ。γδtcr工程化总体t细胞的同种异体反应性显著降低(对于9个ebv-lcl细胞系中的8个)并且更重要地在γδtcr工程化的αβtcr消除t细胞群体中甚至完全消除(图5a)。当针对一组20种不同的健康供体衍生的pbmc测试不同的t细胞群体时，γδtcr工程化t细胞降低的同种异体反应性更加明显。在γδtcr转导的t细胞群体中没有检测到同种异体反应性，但是响应10个pbmc供体组合中的9个，mockt细胞产生ifnγ。

通过优化的工程化t细胞产物改善体内肿瘤控制

评估富集γδtcr工程化t细胞产物的临床效力并且与用pbullet逆转录病毒转导方法和抗生素选择系统产生的称为pb:γδtcrt细胞的γδtcr工程化t细胞相比较(voss等，methodsinmolecularmedicine109，229-256(2005)。在转导外周血液αβt细胞、用抗生素(pbullet)选择或用αβtcr磁珠(pmp71)富集并且随后t细胞扩增，接着评估两种制品。γδtcr阳性t细胞的百分数高于富集γδtcrt细胞产物，而且如通过mfi测量，每个细胞的γδtcr复合物与pb:γδtcrt细胞相比，增加大于2倍。另外，与pb:γδtcrt细胞相比，用pmp71:γ-t2a-δ载体盒转导的富集γδtcr工程化t细胞制品增强了三种测试的肿瘤细胞系的裂解。为了测试，在过继转移γδtcr工程化t细胞的人源化小鼠肿瘤模型中体内测试这些制品的抗肿瘤活性。

照射的rag2^-/-γc^-/-双敲除小鼠被注入荧光素酶-阳性daudi肿瘤细胞以及γδtcr或mocktcr工程化t细胞并且通过生物发光成像评估肿瘤生长。与mocktcrt细胞相比，两种γδtcr工程化t细胞产物都显著抑制肿瘤生长，但是与pb:γδtcrt细胞相比，富集γδtcrt细胞进一步延迟肿瘤生长并且显著延长了生存。在注入照射的rag2^-/-γc^-/-双敲除小鼠中，使用荧光素酶opm2细胞，在第二肿瘤模型中获得了类似的结果。使用富集γδtcr工程化t细胞制品，在7只小鼠中的4只，完全抑制了肿瘤生长。在第一次肿瘤和t细胞注射之后120天，用第二次注射肿瘤细胞重新挑战无肿瘤小鼠，而不用之前的照射并且非照射的幼稚小鼠用作肿瘤生长的对照。重新挑战的小鼠仍无肿瘤而在幼稚小鼠中肿瘤生长，指示γδtcrt细胞治疗在体内提供了长期的肿瘤抑制。

结论

结果显示富集工程化t细胞，即使用结合αβt细胞受体的抗体(bw242)提供γδt细胞受体的t细胞(γ克隆g115和δ克隆5)使得去除了未转导的细胞。此外，表达的外源性免疫受体使得内源性αβt细胞受体下调。这种富集工程化t细胞的制品提供了改善的抗肿瘤效力并且减少或消除了同种异体反应性。此外，这种富集工程化t细胞制品提供了体内高度改善的肿瘤控制。

实施例2

富集具有外源性免疫受体，即工程化αβt细胞受体的工程化人t细胞

富集具有外源性免疫受体，即小鼠αβt细胞受体的工程化的人t细胞

已经显示引入肿瘤特异性γδtcr使工程化t细胞中内源性αβtcr的表达下调(见上面实施例1)。从而，当与非工程化αβt-细胞相比时，工程化t细胞显示它们表面上相当更低的内源性αβtcr密度。这是与使用的外源性免疫受体类型无关的效果。小鼠αβt细胞受体用作工程化人t细胞的外源性免疫受体。用macs使用单克隆抗体αβtcr-mab克隆bw242去除人αβt细胞。因此，在通过macs分离之后，重定向至表达鼠αβtcr的人αβt-细胞在它们表面上显示降低水平的内源性αβtcr(图6a，比较macs之前和macs之后)。因此，通过使用对于人αβt细胞受体特异性的抗体，可富集具有小鼠αβt细胞受体的工程化t细胞。

bw242抗体不结合工程化人αβt细胞受体

因此，bw242抗体在鼠αβt细胞受体和人αβt细胞受体之间是选择性的。所以，分析人αβtcr恒定结构域的鼠源化对于αβtcr单克隆抗体的结合。鼠源化的最小化允许富集具有工程化抗原特异性的‘不受影响’的t细胞。当鼠源化被最小化时，外源性αβt细胞受体基本上与内源性t细胞受体相同，同时允许选择性去除表达大量αβt细胞受体的t细胞。

通过流式细胞术比较临床级αβtcr单克隆抗体bw242(也称为mabbw242或bw242)与全人αβtcr的结合以及与鼠源化突变体的结合。用包含工程化鼠无义αβtcr(α-链，获得自mdm2特异性tcr(stanislawski等，natimmunol,2001.2(10):962-70页)和β-链，获得自p53特异性tcr(kuball等，immunity,2005.22(1):117-29页)的临床上批准的逆转录病毒载体pmp71逆转录病毒转导tcrβ^-/^-jurma细胞，或用ny-eso-1/hla-a2特异性全人αβtcr，或由人可变区和鼠恒定结构域组成的ny-eso-1/hla-a2特异性嵌合αβtcr(也分别称为αmu/βmu，αhu/βhu，和αhumu/βhumu)转导tcrβ^-/^-jurma细胞。通过用针对ny-eso-1tcrβ-链的可变区的抗vβ4，或针对mdm2/p53鼠tcr的tcrβ-链的抗β小鼠染色，确认转基因tcr表达。通过鼠等同物替换人tcrα和β恒定结构域使mabbw242的下降至与结合全鼠tcr类似的水平(图6b下图，比较图6和8)。这些数据指示人αβtcr的恒定区的鼠源化足够消除mabbw242的结合。

具有覆盖人和小鼠αβtcr的恒定区之间所有氨基酸差异的突变片段的混合tcrα和β-链是可获得的(见图7a和b)(sommermeyer等，jimmunol,2010.184(11):6223-31页)。我们获得了四个ny-eso-1tcrβ-链和三个ny-eso-1tcrα-链构建体，每个构建体包含在完全人氨基酸序列侧翼的一个非同源的鼠结构域。这些也示意性描绘在图3中。将7个不同的tcr构建体与其他全人tcr-链一起引入jurma细胞并且表达和测试被mabbw242的识别(图8)。通过抗vβ4测量构建体的转导效率并且平行进行转导。如对于抗αβtcr克隆bw242的识别，仅仅表达包括两条链的全部鼠恒定结构域的αβtcr的细胞(图αhumu/βhumu)和表达αhumu/βm3的细胞显示结合mabbw242的下降。这意味着表达包括鼠结构域3的构建体的细胞中mabbw242的抗体(βm3)的结合被显著损害。因此，具有β链结构域3修饰，比如通过用小鼠β链的β链结构域3替换它或通过替换两条α和β链的全部恒定区的工程化人αβt细胞受体在例如使用bw242的macs分离方法中不被选择。

工程化αβt细胞受体保持特异性

表达人ny-eso-1αβtcr、嵌合ny-eso-1αβtcr或具有人tcrα-链的鼠源化βm3的jurma细胞用ny-eso-1特异性五聚体染色，并且通过流式细胞术测量对于五聚体结合阳性的细胞分数的平均荧光强度(mfi)。显示ny-eso-1全人αβtcr、具有全小鼠恒定区的嵌合ny-eso-1αβtcr和具有人tcrα-链的鼠源化βm3都结合ny-eso-1特异性五聚体

bw242抗体允许富集具有工程化人αβt细胞受体的工程化t细胞

确定bw242macs分离技术是否可用于富集具有工程化人αβt细胞受体的工程化tcr细胞。使用混合细胞群体。t细胞群体包括不表达任何αβt细胞受体的t细胞、表达野生型αβt细胞受体的t细胞，和表达具有期望的特异性的αβt细胞受体的细胞，其中该受体任选地被修饰以消除与bw242的结合。所以，表达转基因tcr、ny-eso-1/hla-a2特异性αβtcr的t细胞以1:1的比例与wt1特异性人αβtcr-转基因细胞混合。随后，通过使用αβtcrmab-涂布免疫磁珠评估这些细胞混合物的纯化并且通过流式细胞术分析未结合的细胞分数(图9)。从混合群体有效富集用人-小鼠嵌合αβtcr的细胞修饰，即αhumu/βhumu-tcr、αhu/βm3-tcr或αm2/βm3-tcr(见用vβ4染色的图，百分数从13％增加至42％)，而在流过部分未检测到表达全人ny-eso-1或wt1特异性αβtcr的细胞(见用vβ21染色的图，百分数从45％下降至1％)。注意，所得群体中保留的未转导的细胞，作为tcr-阴性细胞也不受mabbw242的影响。这显示tcrβ中至少结构域3的鼠源化足够富集肿瘤-反应性的αβtcr。

选择性裂解具有鼠源化人αβtcr的工程化t细胞

提供表达人αβtcr和鼠源化人嵌合αβtcr的jurma细胞(αhu/βm3)。提供特异性靶向tcrβ链的抗体，h57-597(购买自biolegendinc.,sandiegeo,ca92121例如货号是109201。h57-597是armenianhamserigg1同种型。使用标准铬释放试验评估裂解的百分数。具有鼠源化人αβtcr的jurma细胞显示裂解增加四倍。这指示h57-597选择性杀死携带鼠源化人αβtcr而不是全人αβtcr的jurma细胞。

序列表

seqidno.1-4列举了tcr的氨基酸序列。可变区没有加下划线。可变区中的斜体序列对应cdr3区域。链的恒定区加下划线显示。

seqidno.1：人tcrα链(克隆ra14)：

seqidno。2:人tcrβ链(克隆ra14)：

seqidno.3人tcrγ链(克隆g115)：

seqidno.4人tcrδ链(克隆g115)：

下面列举了可获得自ncbi的genbank数据库的(部分)序列，编号为aat27465、aak49780、aat27464、x02883、m64239、m12887、m12888、x02384(ah002088)、m26057、m22148、m23381、m14996、m15002、m17323、m13340、m12834、m12837、af021335，其通过引用并入本文。

表1.人或小鼠来源的(部分)t细胞受体的氨基酸序列。

序列表

<110>umcutrechtholdingb.v.

<120>选择修饰的工程化t细胞和清除工程化淋巴细胞

<130>p32146ep00

<160>23

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>272

<212>prt

<213>智人

<400>1

metglulysasnproleualaalaproleuleuileleutrpthrhis

151015

leuaspcysvalserileleuasnvalgluglnserproglnserleu

202530

hisvalglngluglyaspserthrasnphethrcysserpheproser

354045

serasnphetyralaleuhistrptyrargtrpgluthralalysser

505560

proglualaleuphevalmetthrleuasnglyaspglulyslyslys

65707580

glyargileseralathrleuasnthrlysgluglytyrsertyrleu

859095

tyrilelysglyserglnprogluaspseralathrtyrleucysala

100105110

argasnthrglyasnglnphetyrpheglythrglythrserleuthr

115120125

valileproasnileglnasnproaspproalavaltyrglnleuarg

130135140

aspserlysserserasplysservalcysleuphethrasppheasp

145150155160

serglnthrasnvalserglnserlysaspseraspvaltyrilethr

165170175

asplyscysvalleuaspmetargsermetaspphelysserasnser

180185190

alavalalatrpserasnlysseraspphealacysalaasnalaphe

195200205

asnasnserileileprogluaspthrphepheproserprogluser

210215220

sercysaspvallysleuvalglulysserphegluthraspthrasn

225230235240

leuasnpheglnasnleuservalileglypheargileleuleuleu

245250255

lysvalalaglypheasnleuleumetthrleuargleutrpserser

260265270

<210>2

<211>312

<212>prt

<213>智人

<400>2

metglyileglyleuleucyscysalaalaleuserleuleutrpala

151015

glyprovalasnalaglyvalthrglnthrprolyspheglnvalleu

202530

lysthrglyglnsermetthrleuglncysalaglnaspmetasnhis

354045

glutyrmetsertrptyrargglnaspproglymetglyleuargleu

505560

ilehistyrservalglyalaglyilethraspglnglygluvalpro

65707580

asnglytyrasnvalserargserthrthrgluasppheproleuarg

859095

leuleuseralaalaproserglnthrservaltyrphecysalaser

100105110

serprovalthrglyglyiletyrglytyrthrpheglyserglythr

115120125

argleuthrvalvalgluaspleulysasnvalpheproprogluval

130135140

alavalphegluproserglualagluileserhisthrglnlysala

145150155160

thrleuvalcysleualathrglyphetyrproasphisvalgluleu

165170175

sertrptrpvalasnglylysgluvalhisserglyvalcysthrasp

180185190

proglnproleulysgluglnproalaleuasnaspserargtyrcys

195200205

leuserserargleuargvalseralathrphetrpglnasnproarg

210215220

asnhispheargcysglnvalglnphetyrglyleusergluasnasp

225230235240

glutrpthrglnaspargalalysprovalthrglnilevalserala

245250255

glualatrpglyargalaaspcysglyphethrserglusertyrgln

260265270

glnglyvalleuseralathrileleutyrgluileleuleuglylys

275280285

alathrleutyralavalleuvalseralaleuvalleumetalamet

290295300

vallysarglysaspserarggly

305310

<210>3

<211>315

<212>prt

<213>智人

<400>3

metvalserleuleuhisalaserthrleualavalleuglyalaleu

151015

cysvaltyrglyalaglyhisleugluglnproglnileserserthr

202530

lysthrleuserlysthralaargleuglucysvalvalserglyile

354045

thrileseralathrservaltyrtrptyrarggluargproglyglu

505560

valileglnpheleuvalserilesertyraspglythrvalarglys

65707580

gluserglyileproserglylysphegluvalaspargileproglu

859095

thrserthrserthrleuthrilehisasnvalglulysglnaspile

100105110

alathrtyrtyrcysalaleutrpglualaglnglngluleuglylys

115120125

lysilelysvalpheglyproglythrlysleuileilethrasplys

130135140

glnleuaspalaaspvalserprolysprothrilepheleuproser

145150155160

ilealagluthrlysleuglnlysalaglythrtyrleucysleuleu

165170175

glulysphepheproaspvalilelysilehistrpgluglulyslys

180185190

serasnthrileleuglyserglngluglyasnthrmetlysthrasn

195200205

aspthrtyrmetlysphesertrpleuthrvalproglulysserleu

210215220

asplysgluhisargcysilevalarghisgluasnasnlysasngly

225230235240

valaspglngluileilepheproproilelysthraspvalilethr

245250255

metaspprolysaspasncysserlysaspalaasnaspthrleuleu

260265270

leuglnleuthrasnthrseralatyrtyrmettyrleuleuleuleu

275280285

leulysservalvaltyrphealaileilethrcyscysleuleuarg

290295300

argthralaphecyscysasnglyglulysser

305310315

<210>4

<211>292

<212>prt

<213>智人

<400>4

metgluargileserserleuilehisleuserleuphetrpalagly

151015

valmetseralailegluleuvalprogluhisglnthrvalproval

202530

serileglyvalproalathrleuargcyssermetlysglygluala

354045

ileglyasntyrtyrileasntrptyrarglysthrglnglyasnthr

505560

metthrpheiletyrargglulysaspiletyrglyproglyphelys

65707580

aspasnpheglnglyaspileaspilealalysasnleualavalleu

859095

lysileleualaprosergluargaspgluglysertyrtyrcysala

100105110

cysaspthrleuglymetglyglyglutyrthrasplysleuilephe

115120125

glylysglythrargvalthrvalgluproargserglnprohisthr

130135140

lysproservalphevalmetlysasnglythrasnvalalacysleu

145150155160

vallysgluphetyrprolysaspileargileasnleuvalserser

165170175

lyslysilethrglupheaspproalailevalileserprosergly

180185190

lystyrasnalavallysleuglylystyrgluaspserasnserval

195200205

thrcysservalglnhisaspasnlysthrvalhisserthraspphe

210215220

gluvallysthraspserthrasphisvallysprolysgluthrglu

225230235240

asnthrlysglnproserlyssercyshislysprolysalaileval

245250255

histhrglulysvalasnmetmetserleuthrvalleuglyleuarg

260265270

metleuphealalysthrvalalavalasnpheleuleuthralalys

275280285

leuphepheleu

290

<210>5

<211>306

<212>prt

<213>小家鼠

<400>5

metalathrargleuleucystyrthrvalleucysleuleuglyala

151015

argileleuasnserlysvalileglnthrproargtyrleuvallys

202530

glyglnglyglnlysalalysmetargcysileproglulysglyhis

354045

provalvalphetrptyrglnglnasnlysasnasngluphelysphe

505560

leuileasnpheglnasnglngluvalleuglnglnileaspmetthr

65707580

glulysargpheseralaglucysproserasnserprocysserleu

859095

gluileglnserserglualaglyaspseralaleutyrleucysala

100105110

serserleuserglyglyglythrgluvalphepheglylysglythr

115120125

argleuthrvalvalgluaspleuargasnvalthrproprolysval

130135140

serleuphegluproserlysalagluilealaasnlysglnlysala

145150155160

thrleuvalcysleualaargglyphepheproasphisvalgluleu

165170175

sertrptrpvalasnglylysgluvalhisserglyvalserthrasp

180185190

proglnalatyrlysgluserasntyrsertyrcysleuserserarg

195200205

leuargvalseralathrphetrphisasnproargasnhisphearg

210215220

cysglnvalglnphehisglyleuserglugluasplystrpproglu

225230235240

glyserprolysprovalthrglnasnileseralaglualatrpgly

245250255

argalaaspcysglyilethrseralasertyrhisglnglyvalleu

260265270

seralathrileleutyrgluileleuleuglylysalathrleutyr

275280285

alavalleuvalserglyleuvalleumetalametvallyslyslys

290295300

asnser

305

<210>6

<211>306

<212>prt

<213>小家鼠

<400>6

metasnlystrpvalphecystrpvalthrleucysleuleuthrval

151015

gluthrthrhisglyaspglyglyileilethrglnthrprolysphe

202530

leuileglyglngluglyglnlysleuthrleulyscysglnglnasn

354045

pheasnhisaspthrmettyrtrptyrargglnaspserglylysgly

505560

leuargleuiletyrtyrserilethrgluasnaspleuglnlysgly

65707580

aspleusergluglytyraspalaserargglulyslysserserphe

859095

serleuthrvalthrseralaglnlysasnglumetalavalpheleu

100105110

cysalaserglyasptrpglytyrgluglntyrpheglyproglythr

115120125

argleuthrvalleugluaspleuargasnvalthrproprolysval

130135140

serleuphegluproserlysalagluilealaasnlysglnlysala

145150155160

thrleuvalcysleualaargglyphepheproasphisvalgluleu

165170175

sertrptrpvalasnglylysgluvalhisserglyvalserthrasp

180185190

proglnalatyrlysgluserasntyrsertyrcysleuserserarg

195200205

leuargvalseralathrphetrphisasnproargasnhisphearg

210215220

cysglnvalglnphehisglyleuserglugluasplystrpproglu

225230235240

glyserprolysprovalthrglnasnileseralaglualatrpgly

245250255

argalaaspcysglyilethrseralasertyrhisglnglyvalleu

260265270

seralathrileleutyrgluileleuleuglylysalathrleutyr

275280285

alavalleuvalserglyleuvalleumetalametvallyslyslys

290295300

asnser

305

<210>7

<211>269

<212>prt

<213>小家鼠

<400>7

metvalleualaleuleuprovalleuglyilehisphevalleuarg

151015

aspalaglnalaglnservalthrglnproaspalaargvalthrval

202530

sergluglyalaserleuglnleuargcyslystyrsertyrsergly

354045

thrprotyrleuphetrptyrvalglntyrproargglnglyleugln

505560

leuleuleulystyrtyrserglyaspprovalvalglnglyvalasn

65707580

glypheglualaglupheserlysserasnserserphehisleuarg

859095

lysalaservalhistrpseraspseralavaltyrphecysvalleu

100105110

sergluaspserasntyrglnleuiletrpglyserglythrlysleu

115120125

ileilelysproaspileglnasnprogluproalavaltyrglnleu

130135140

lysaspproargserglnaspserthrleucysleuphethraspphe

145150155160

aspserglnileasnvalprolysthrmetgluserglythrpheile

165170175

thrasplysthrvalleuaspmetlysalametaspserlysserasn

180185190

glyalailealatrpserasnglnthrserphethrcysglnaspile

195200205

phelysgluthrasnalathrtyrproserseraspvalprocysasp

210215220

alathrleuthrglulysserphegluthraspmetasnleuasnphe

225230235240

glnasnleuservalmetglyleuargileleuleuleulysvalala

245250255

glypheasnleuleumetthrleuargleutrpserser

260265

<210>8

<211>268

<212>prt

<213>小家鼠

<400>8

metlysargleuleucysserleuleuglyleuleucysthrglnval

151015

cystrpvallysglyglnglnvalglnglnserproalaserleuval

202530

leuglngluglygluasnalagluleuglncysasnpheserserthr

354045

alathrargleuglntrpphetyrglnargproglyglyserleuval

505560

serleuleutyrasnproserglythrlyshisthrglyargleuthr

65707580

serthrthrvalthrlysgluargargserserleuhisileserser

859095

serglnthrthraspserglythrtyrphecysalathrserserval

100105110

asnthrglyasntyrlystyrvalpheglyalaglythrargleulys

115120125

valilealahisileglnasnprogluproalavaltyrglnleulys

130135140

aspproargserglnaspserthrleucysleuphethrasppheasp

145150155160

serglnileasnvalprolysthrmetgluserglythrpheilethr

165170175

asplysthrvalleuaspmetlysalametaspserlysserasngly

180185190

alailealatrpserasnglnthrserphethrcysglnaspilephe

195200205

lysgluthrasnalathrtyrproserseraspvalprocysaspala

210215220

thrleuthrglulysserphegluthraspmetasnleuasnphegln

225230235240

asnleuservalmetglyleuargileleuleuleulysvalalagly

245250255

pheasnleuleumetthrleuargleutrpserser

260265

<210>9

<211>141

<212>prt

<213>智人

<400>9

aspileglnasnproaspproalavaltyrglnleuargaspserlys

151015

serserasplysservalcysleuphethrasppheaspserglnthr

202530

asnvalserglnserlysaspseraspvaltyrilethrasplysthr

354045

valleuaspmetargsermetaspphelysserasnseralavalala

505560

trpserasnlysseraspphealacysalaasnalapheasnasnser

65707580

ileileprogluaspthrphepheproserproglusersercysasp

859095

vallysleuvalglulysserphegluthraspthrasnleuasnphe

100105110

glnasnleuservalileglypheargileleuleuleulysvalala

115120125

glypheasnleuleumetthrleuargleutrpserser

130135140

<210>10

<211>72

<212>prt

<213>小家鼠

<400>10

ileglnasnprogluproalavaltyrglnleulysaspproargser

151015

glnaspserthrleucysleuphethrasppheaspserglnileasn

202530

valprolysthrmetgluserglythrpheilethrasplysthrval

354045

leuaspmetlysalametaspserlysserasnglyalailealatrp

505560

serasnglnthrserphethrcys

6570

<210>11

<211>176

<212>prt

<213>智人

<400>11

aspleuasnlysvalpheproprogluvalalavalphegluproser

151015

glualagluileserhisthrglnlysalathrleuvalcysleuala

202530

thrglyphepheproasphisvalgluleusertrptrpvalasngly

354045

lysgluvalhisserglyvalserthraspproglnproleulysglu

505560

glnproalaleuasnaspserargtyrcysleuserserargleuarg

65707580

valseralathrphetrpglnasnproargasnhispheargcysgln

859095

valglnphetyrglyleusergluasnaspglutrpthrglnasparg

100105110

alalysprovalthrglnilevalseralaglualatrpglyargala

115120125

aspcysglyphethrservalsertyrglnglnglyvalleuserala

130135140

thrileleutyrgluileleuleuglylysalathrleutyralaval

145150155160

leuvalseralaleuvalleumetalametvallysarglysaspphe

165170175

<210>12

<211>178

<212>prt

<213>智人

<400>12

aspleulysasnvalpheproprogluvalalavalphegluproser

151015

glualagluileserhisthrglnlysalathrleuvalcysleuala

202530

thrglyphetyrproasphisvalgluleusertrptrpvalasngly

354045

lysgluvalhisserglyvalserthraspproglnproleulysglu

505560

glnproalaleuasnaspserargtyrcysleuserserargleuarg

65707580

valseralathrphetrpglnasnproargasnhispheargcysgln

859095

valglnphetyrglyleusergluasnaspglutrpthrglnasparg

100105110

alalysprovalthrglnilevalseralaglualatrpglyargala

115120125

aspcysglyphethrserglusertyrglnglnglyvalleuserala

130135140

thrileleutyrgluileleuleuglylysalathrleutyralaval

145150155160

leuvalseralaleuvalleumetalametvallysarglysaspser

165170175

arggly

<210>13

<211>172

<212>prt

<213>小家鼠

<400>13

aspleuargasnvalthrproprolysvalserleuphegluproser

151015

lysalagluilealaasnlysglnlysalathrleuvalcysleuala

202530

argglyphepheproasphisvalgluleusertrptrpvalasngly

354045

lysgluvalhisserglyvalserthraspproglnalatyrlysglu

505560

serasntyrsertyrcysleuserserargleuargvalseralathr

65707580

phetrphisasnproargasnhispheargcysglnvalglnphehis

859095

glyleuserglugluasplystrpprogluglyserprolysproval

100105110

thrglnasnileseralaglualatrpglyargalaaspcysglyile

115120125

thrseralasertyrglnglnglyvalleuseralathrileleutyr

130135140

gluileleuleuglylysalathrleutyralavalleuvalserthr

145150155160

leuvalvalmetalametvallysarglysasnser

165170

<210>14

<211>172

<212>prt

<213>小家鼠

<400>14

aspleuargasnvalthrproprolysvalserleuphegluproser

151015

lysalagluilealaasnlysglnlysalathrleuvalcysleuala

202530

argglyphepheproasphisvalgluleusertrptrpvalasngly

354045

lysgluvalhisserglyvalserthraspproglnalatyrlysglu

505560

serasntyrsertyrcysleuserserargleuargvalseralathr

65707580

phetrphisasnproargasnhispheargcysglnvalglnphehis

859095

glyleuserglugluasplystrpprogluglyserprolysproval

100105110

thrglnasnileseralaglualatrpglyargalaaspcysglyile

115120125

thrseralasertyrhisglnglyvalleuseralathrileleutyr

130135140

gluileleuleuglylysalathrleutyralavalleuvalsergly

145150155160

leuvalleumetalametvallyslyslysasnser

165170

<210>15

<211>177

<212>prt

<213>智人

<400>15

prosertyrthrglyglytyralaasplysleuilepheglylysgly

151015

thrargvalthrvalgluproargserglnprohisthrlysproser

202530

valphevalmetlysasnglythrasnvalalacysleuvallysglu

354045

phetyrprolysaspileargileasnleuvalserserlyslysile

505560

thrglupheaspproalailevalileserproserglylystyrasn

65707580

alavallysleuglylystyrgluaspserasnservalthrcysser

859095

valglnhisaspasnlysthrvalhisserthraspphegluvallys

100105110

thraspserthrasphisvallysprolysgluthrgluasnthrlys

115120125

glnproserlyssercyshislysprolysalailevalhisthrglu

130135140

lysvalasnmetmetserleuthrvalleuglyleuargmetleuphe

145150155160

alalysthrvalalavalasnpheleuleuthralalysleuphephe

165170175

leu

<210>16

<211>152

<212>prt

<213>小家鼠

<400>16

serglnproproalalysproservalpheilemetlysasnglythr

151015

asnvalalacysleuvallysaspphetyrprolysgluvalthrile

202530

serleuargserserlyslysilevalglupheaspproalaileval

354045

ileserproserglylystyrseralavallysleuglyglntyrgly

505560

aspserasnservalthrcysservalglnhisasnsergluthrval

65707580

hisserthraspphegluprotyralaasnserpheasnasnglulys

859095

leuprogluprogluasnaspthrglnilesergluprocystyrgly

100105110

proargvalthrvalhisthrglulysvalasnmetmetserleuthr

115120125

valleuglyleuargleuleuphealalysthrilealaileasnphe

130135140

leuleuthrvallysleuphephe

145150

<210>17

<211>172

<212>prt

<213>智人

<400>17

lysglnleuaspalaaspvalserprolysprothrilepheleupro

151015

serilealagluthrlysleuglnlysalaglythrtyrleucysleu

202530

leuglulysphepheproaspvalilelysilehistrpglnglulys

354045

lysserasnthrileleuglyserglngluglyasnthrmetlysthr

505560

asnaspthrtyrmetlysphesertrpleuthrvalproglulysser

65707580

leuasplysgluhisargcysilevalarghisgluasnasnlysasn

859095

glyvalaspglngluileilepheproproilelysthraspvalile

100105110

thrmetaspprolysaspasncysserlysaspalaasnaspthrleu

115120125

leuleuglnleuthrasnthrseralatyrtyrmettyrleuleuleu

130135140

leuleulysservalvaltyrphealaileilethrcyscysleuleu

145150155160

argargthralaphecyscysasnglyglulysser

165170

<210>18

<211>109

<212>prt

<213>智人

<400>18

lysglnleuaspalaaspvalserprolysprothrilepheleupro

151015

serilealagluthrlysleuglnlysalaglythrtyrleucysleu

202530

leuglulysphepheproaspileilelysilehistrpglnglulys

354045

lysserasnthrileleuglyserglngluglyasnthrmetlysthr

505560

asnaspthrtyrmetlysphesertrpleuthrvalproglugluser

65707580

leuasplysgluhisargcysilevalarghisgluasnasnlysasn

859095

glyileaspglngluileilepheproproilelysthr

100105

<210>19

<211>204

<212>prt

<213>智人

<400>19

lysglnleuaspalaaspvalserprolysprothrilepheleupro

151015

serilealagluthrlysleuglnlysalaglythrtyrleucysleu

202530

leuglulysphepheproaspileilelysilehistrpglnglulys

354045

lysserasnthrileleuglyserglngluglyasnthrmetlysthr

505560

asnaspthrtyrmetlysphesertrpleuthrvalproglugluser

65707580

leuasplysgluhisargcysilevalarghisgluasnasnlysasn

859095

glyileaspglngluileilepheproproilelysthraspvalthr

100105110

thrvalaspprolysaspsertyrserlysaspalaasnaspvalthr

115120125

thrvalaspprolystyrasntyrserlysaspalaasnaspvalile

130135140

thrmetaspprolysaspasntrpserlysaspalaasnaspthrleu

145150155160

leuleuglnleuthrasnthrseralatyrtyrmettyrleuleuleu

165170175

leuleulysservalvaltyrphealaileilethrcyscysleuleu

180185190

glyargthralaphecyscysasnglyglulysser

195200

<210>20

<211>171

<212>prt

<213>小家鼠

<400>20

lysargleuaspalaaspileserprolysprothrilepheleupro

151015

servalalagluthrasnleuhislysthrglythrtyrleucysleu

202530

leuglulysphepheproaspvalileargvaltyrtrplysglulys

354045

aspglyasnthrileleuaspserglngluglyaspthrleulysthr

505560

asnaspthrtyrmetlysphesertrpleuthrvalprogluargala

65707580

metglylysgluhisargcysilevallyshisgluasnasnlysgly

859095

glyalaaspglngluilephepheproserilelyslysvalalaval

100105110

serthrlysprothrthrcystrpglnasplysasnaspvalleugln

115120125

leuglnphethrilethrseralatyrtyrthrtyrleuleuleuleu

130135140

leulysservaliletyrleualaileileserpheserleuleuarg

145150155160

argthrservalcysglyasnglulyslysser

165170

<210>21

<211>166

<212>prt

<213>小家鼠

<400>21

lysargleuaspalaaspileserprolysprothrilepheleupro

151015

servalalagluthrasnleuhislysthrglythrtyrleucysleu

202530

leuglulysphepheproaspvalileargvaltyrtrplysglulys

354045

asnglyasnthrileleuaspserglngluglyaspthrleulysthr

505560

lysglythrtyrmetlysphesertrpleuthrvalprogluargala

65707580

metglylysgluhissercysilevallyshisgluasnasnlysgly

859095

glyalaaspglngluilephepheproserilelyslysvalalathr

100105110

thrcystrpglnasplysasnaspvalleuglnpheglnphethrser

115120125

thrseralatyrtyrthrtyrleuleuleuleuleulysservalile

130135140

tyrleualaileileserpheserleuleuargargthrservalcys

145150155160

glyasnglulyslysser

165

<210>22

<211>171

<212>prt

<213>小家鼠

<400>22

lyslysleuaspalaaspileserprolysprothrilepheleupro

151015

servalalagluthrasnleuhislysthrglythrtyrleucysval

202530

leuglulysphepheproaspvalileargvaltyrtrplysglulys

354045

lysglyasnthrileleuaspserglngluglyaspmetleulysthr

505560

asnaspthrtyrmetlysphesertrpleuthrvalprogluargser

65707580

metglylysgluhisargcysilevallyshisgluasnasnlysgly

859095

glyalaaspglngluilephepheprothrilelyslysvalalaval

100105110

serthrlysprothrthrcystrpglnasplysasnaspvalleugln

115120125

leuglnphethrilethrseralatyrtyrthrtyrleuleuleuleu

130135140

leulysservaliletyrleualaileileserpheserleuleuarg

145150155160

argthrservalcyscysasnglulyslysser

165170

<210>23

<211>166

<212>prt

<213>小家鼠

<400>23

lysargleuaspalaaspileserprolysprothrilepheleupro

151015

servalalagluthrasnleuhislysthrglythrtyrleucysleu

202530

leuglulysphepheproaspvalileargvaltyrtrplysglulys

354045

asnglyasnthrileleuaspserglngluglyaspthrleulysthr

505560

lysglythrtyrmetlysphesertrpleuthrvalprogluargala

65707580

metglylysgluhissercysilevallyshisgluasnasnlysgly

859095

glyalaaspglngluilephepheproserilelyslysvalalathr

100105110

thrcystrpglnasplysasnaspvalleuglnpheglnphethrser

115120125

thrseralatyrtyrthrtyrleuleuleuleuleulysservalile

130135140

tyrleualaileileserpheserleuleuargargthrservalcys

145150155160

glyasnglulyslysser

165