用于调节CAR诱导的免疫细胞活性的方法与流程

本发明涉及调节car(嵌合抗原受体)的转导信号的方法，该转导信号的水平决定工程化免疫细胞(如，免疫治疗中使用的嵌合抗原受体t细胞)的活化水平。特别地，发明人已经开发了一种分子开关系统和新的car结构体，使得在给予可溶性化合物(其诱导抑制性结构域和激活信号结构域的共定位)时，对所述细胞进行可调节的激活，尤其是通过化学诱导的二聚化(cid)。因此，由嵌合抗原受体(car)触发的工程化免疫细胞的活化可以随时通过抑制性信号结构域进行监测或分流。本发明为可调节的和更安全的过继性免疫治疗的前景开辟了道路。

背景技术：

涉及体外产生的自体抗原特异性t细胞的转移的过继性免疫治疗是一种有前景的治疗癌症的策略。可以通过扩增抗原特异性t细胞或通过基因工程化t细胞的重定向来产生用于过继性免疫治疗的t细胞(park，rosenbergetal.2011)。病毒抗原特异性t细胞的转移是用于治疗移植相关性病毒感染和罕见病毒相关性恶性肿瘤的成熟的方法。类似地，已经显示，肿瘤特异性t细胞的分离和转移在治疗黑素瘤方面是成功的。通过转基因t细胞受体或嵌合抗原受体(car)的遗传转移，已经成功产生了t细胞的新特异性。car是合成受体，由单个融合分子中与一个或多个信号结构域相关联的靶向部分组成。car已经成功地使得t细胞针对来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面上表达的抗原(jena，dottietal.2010)进行重定向。

第一代car修饰的t细胞在临床前试验中取得了成功，并进入了i期临床试验。对卵巢癌、神经母细胞瘤和各种类型的白血病和淋巴瘤的临床试验已经开始(https：//clinicaltrials.gov/)。临床试验显示，几乎没有抗肿瘤活性的证据，其中活化、持续性和归巢回癌组织均不足。不同研究已报道，部分第一代car在没有共刺激作用的情况下导致无反应性和体内扩增失败。

为了克服这些局限性，设计了第二代和第三代car修饰的t细胞，以增强临床前试验中car修饰的t细胞的激活信号、增殖、细胞因子的产生和效应子功能(effectorfunction)。开发了第二代car，以在胞内域(endodomain)结合一种或多种共刺激分子(如，cd28、ox40和4-1bb)的胞内结构域，并且这些改善了抗原特异性t细胞的激活和扩增。第三代car包括共刺激胞内域的组合。现在，第二代和第三代car修饰的t细胞都已进入临床试验。第一临床试验涉及表达car的t细胞，其将抗cd19结合结构域与4-1bb共刺激结构域和cd3zeta组合作为激活信号结构域，导致了一些患者症状完全缓解，这种缓解一直持续到治疗后的10个月。发现car修饰的t细胞在这些患者中扩增了3倍数(3log)，渗入并溶解癌组织。有趣的是，这些细胞的一部分显示出用于预防性肿瘤复发的t细胞记忆表型。虽然这些car修饰的t细胞产生了显著的治疗效果，但是在第一次输注car-修饰的t细胞后3周，它们的活性引起了危及生命的肿瘤溶解。

最近报道的不良事件强调，在使用第二代和第三代car修饰的t细胞时，需要特殊的预防措施。一名患者在环磷酰胺化疗并随后输注识别抗原erbb2(her-2/neu)的car-修饰的t细胞5天后死亡(morganetal.2010)。毒性导致了促炎细胞因子的在临床上的显著释放、肺部毒性、多器官衰竭和患者的最终死亡。这种和其他不良事件强调使用car-修饰的t细胞时谨慎的必要性，因为与针对肿瘤相关性抗原的抗体不同，这些细胞在短时间内不会从体内清除。

存在多项正在进行的研究，以开发更安全的基于car的免疫治疗。多项研究报告了旨在提高t免疫治疗的功效和安全性的多种系统。在健康人中的t细胞介导的免疫力包括由共刺激信号和抑制性信号之间的平衡调节的多个顺序步骤，这两种信号微调免疫反应。称为免疫检查点的抑制性信号(如，ctla-4-或pd-1)对于维持自身耐受性至关重要，并且还限制免疫介导的侧支组织损伤(dolanetal，2014)。

最近，设计了抑制性嵌合抗原受体(icar)，其具有的目标是在遇到脱靶细胞时将抑制t细胞功能上。icar由融合至t细胞抑制性信号结构域的抗原特异性单链可变片段(scfv)构成。表达肿瘤相关抗原而不是正常组织抗原的细胞将诱导t细胞活化、细胞毒性和细胞因子信号以杀死在靶细胞(ontargetcell)。在研究中(federovetal.2013)，基于ctla-4-或pd-1-的icar表现出选择性限制通过内源t细胞受体或活化嵌合受体诱导的细胞因子分泌、细胞毒性和增殖。因此，为了发挥功能，icar技术依赖于2种抗原的初步选择：一种肿瘤相关抗原和一种正常组织抗原。此外，pd-1或ctla-4的抑制效果仅在脱靶细胞(off-targetcell)上运行。

在buddeetal.(2013)中描述了另一系统，其中cd20嵌合抗原受体与诱导型胱天蛋白酶9(ic9)自杀开关(suicideswitch)相结合。在申请us2014/0286987中，在前药ap1903(他克莫司)的存在下，通过结合到突变的fk506结合蛋白(fkbp1)使得后一种基因具有功能性。由bellicum公司发起的临床试验正在进行，其中上述半胱天冬酶技术(caspacid^tm)被工程化到第三代cart细胞靶向的gd2中。病毒转导将dna从载体转移至靶细胞中，并且该载体衍生的dna引导表达化学诱导的二聚化(cid)和辅助蛋白。在ap1903药物存在下，将产生cid蛋白的二聚化，从而开启信号级联。在由给予的t细胞引起严重危及生命的毒性的情况下，ap1903将被注入以触发caspacid^tm启动的细胞的快速破坏和消除。一个重要的特征是，该表达限于细胞的细胞质。此外，根据bellicum系统，不存在调节t细胞的活性的可能，因为与药物接触的caspacid^tm的表达导致t细胞死亡。申请wo2014/152177中描述了一种类似的基于多聚化剂的凋亡诱导系统。

需要一种基于car的免疫治疗技术，其通过添加可溶性化合物能够抑制或调节嵌合抗原受体(car)免疫细胞的活性而不会杀死所述细胞；这是灵活的，因为可溶性化合物的作用可以是细胞内或细胞外的，并且与在靶/脱靶细胞选择无关。

本发明在此提供了此类免疫治疗，在细胞毒性的情况下(即需要时)，该免疫治疗通过给予特定的可溶性化合物可以特异性地抑制/调节活化。

技术实现要素：

在一方面，本发明提供了通过给予可溶性化合物以调节嵌合抗原受体-工程化免疫细胞，如car-t细胞的活化水平的方法。

在优选的方面，可溶性化合物可以是小分子(如，雷帕霉素类似物(rapalog))或双特异性抗体，其触发至少一个结合结构域的共定位，并因此通过抑制性信号结构域的作用增强car-工程化免疫细胞的调节。

根据本发明的一个方面，包含结合(或二聚化)结构域的抑制性膜蛋白(imp)与car在免疫细胞中共表达。car和imp，尤其通过包含在car内的第二结合结构域，使得相对于可溶性化合物具有反应性，由此通过imp具有的抑制性信号结构域的二聚化或配体识别，以及car具有的信号转导结构域的二聚化或配体识别而允许共定位，从而具有降低car活化的效果。抑制性信号结构域优选为程序性死亡-1(pd-1)，其减弱t细胞受体(tcr)介导的il-2生产和t细胞增殖的活化。在sheppardetal.(2004)中，证明t细胞功能的pd-1调节涉及通过zap70的tcr介导的磷酸化的抑制以及cd3ζ结合。

本发明提供了落入本发明范围内的多种构象，例如取决于所使用的可溶性化合物的类型，结合(或二聚化)结构域可以是细胞外或细胞内的(图1和图2)。另一方面，免疫细胞中表达的嵌合抗原受体(car)可以是多链car或单链car。本发明还提供了独立于所选择的car结构体的开关系统，其并非一定要求在car中包含第二结合结构域或二聚化结构域。根据该在后的方面，第一和第二结合(或二聚化)结构域是表达在免疫细胞表面上的至少两种异源抑制膜蛋白(imp)的一部分，使得抑制性信号结构域(充当抑制car诱导激活的(间接)分子开关)二聚化并活化。这类开关的实例涉及图3所示的il-10路径。二聚化诱导剂，如雷帕霉素使得两个二聚化结构域的共定位。一旦二聚化，il-10r抑制促炎细胞因子，如ifn-γ、il-2、il-3、tnfα和gm-csf的合成。这种抑制似乎是由涉及多种中间体(如，受体相关的janus激酶1(jak1)和酪氨酸激酶2(tyk2)激酶)的反应级联介导的，导致如finbloometal.(1995)中所述的stat蛋白的酪氨酸磷酸化。

另外，本发明涵盖了可通过本发明的方法获得的分离的细胞或细胞系，更特别地，包括或表达本文所述的任何蛋白质、多肽、等位变体、改变的或缺失的基因或载体的分离的免疫细胞。根据申请人实施的并在wo2013176915中描述的先前的发展，本发明的免疫细胞或细胞系可以被进一步工程化用于患者中的同种植入，例如通过破坏t细胞受体。

从上述方面，本发明的另一方面涉及用于治疗或预防，如癌症等病症的方法，其中car诱导的免疫细胞可用于靶向患者中的病理细胞，并且其中需要使用可溶性化合物以保持免疫细胞增殖可控。

附图说明

附图和表格的简要说明

图1：当抑制性膜蛋白(imp)复合物和多链嵌合抗原受体(car)的结合结构域均定位在细胞外时，使用pd-1作为抑制性信号结构域的基于细胞外化学诱导二聚化(cid)策略的示意图。

该系统由2部分组成：第一部分包含称为抑制性膜蛋白(imp)的多肽并且第二部分对应于嵌合抗原受体(car)。imp是具有细胞外部分和具有细胞内部分的跨膜蛋白，细胞外部分是能够结合至化学诱导二聚化(cid)剂的二聚化结构域，并且细胞内部分含有抑制性信号结构域(此处为pd1)。

图中表示的car是具有3条链(α、β和γ)的多链car(此处为mccar)，(如wo2014039523中所描述的)衍生自fc受体。α链携带识别表面标志物配体的scfv结合结构域，β链携带共刺激结构域(此处为41-bb)以及γ链携带细胞内转导信号结构域(此处为cd3ζ)。图1a显示了在γ链的细胞外部分上具有的二聚化结构域；图1b显示了α链的细胞外部分的二聚化结构域。

当表达imp分子和mccar的免疫细胞不与cid试剂接触时，mccar可以以正常的方式起作用，即最后破坏由scfv特异性部分识别的靶细胞。在mccar的不适当或过度作用的情况下，可以向患者给予cid试剂(此处为雷帕霉素)，以便触发可调节的的抑制开关，如本文后续所阐述的。

在两种配置(图1a和图1b)中，雷帕霉素的存在允许2个二聚化结构域(一个在imp分子上，另一个在mccar的α-或γ-链上)共定位，即这2个二聚化结构域彼此更接近。通过这种作用，抑制性信号结构域pd1与mccar的转导信号结构域cd3ζ共定位。后者的去磷酸化增强了从cd3ζ开始的反应级联，并最终导致对mccar的抑制。

图2：当抑制性膜蛋白(imp)复合物和多链嵌合抗原受体(car)的结合结构域均位于在细胞内时，使用pd-1作为抑制性信号结构域的基于细胞内化学诱导的二聚化(cid)策略的示意图。

该系统由诸如图1所示的2个部分组成，图2a和图2b分别相应于当二聚化结构域分别存在于mccar的α链和γ链上的情形。与图1的不同在于，imp蛋白的二聚化结构域和mccar的二聚化结构域位于细胞内。其作用过程与图1的相同，不同之处在于雷帕霉素需要穿过免疫细胞的膜才能结合到结合结构域。

图3：当抑制性膜蛋白(imp)p复合物的结合结构域位于细胞外时，使用il-10r作为抑制性信号结构域的基于细胞外的化学诱导的二聚化(cid)策略的示意图。在二聚化结构域分别存在于imp复合物而非mccar上的意义上，此处呈现的系统是一种与图1和图2所示的系统不同的系统。该系统基于imp复合物和嵌合抗原受体(此处为mccar)。imp复合物由2个独立的蛋白组成，每个均是跨膜的，在细胞外具有二聚化结构域并且在细胞内具有il-10r抑制性信号结构域(单体il-10rα和单体il-10rβ)的一个单体。mccar与图1和图2所示的相比。

图4：当imp分子和sccar中的结合结构域均位于细胞外时，使用pd-1(作为imp分子中的抑制性信号结构域)和单链car的基于细胞外的化学诱导的二聚化(cid)策略的示意图。在不存在小分子时，sccar在遇到肿瘤细胞表面抗原时可以发挥作用。在小分子的存在下，存在cid结合结构域的二聚化，允许2个多肽链的“共定位”，并因此pd-1可以对sccar发挥其抑制作用。sccar停止发挥作用。

图5：当imp分子和sccar中的结合结构域均位于细胞内时，使用pd-1(作为imp分子中的抑制性信号结构域)和单链car的基于细胞内的化学诱导的二聚化(cid)策略示意图。这与图4中描绘的细胞外的原理相同，不同之处在于小分子必须跨越膜以便能够二聚化2个细胞内cid结合结构域。

当需要时，即在car不适当或过度的作用的情况下，向患者给予雷帕霉素。雷帕霉素使得imp复合物上具有的2个二聚化结构域的二聚化。这增强了il-10r的2种单体的共定位，并因此通过涉及干扰素ifn-γ和jak-stat信号路径的反应级联增强对car的抑制活性。因此，功能性il-10r二聚体可通过嵌合抗原受体(car)间接监测或分流免疫细胞的活化。

下列表格显示了在所述imp复合物及嵌合抗原受体(car)的构建中涵盖的所有组分的序列。

具体实施方式

在过继性t细胞治疗中控制功能性反应的能力是关键的事项。在这样的治疗策略中，通过表达表面暴露的嵌合抗原受体(car)将t细胞工程化，其实现了高的肿瘤特异性靶细胞识别。然而，为了控制和最小化潜在的毒性作用，非常需要可调节的开关系统的设计。

发明人开发了基于嵌合多蛋白复合物的设计来工程化这种免疫细胞的方法，该方法能够通过添加可溶性化合物，如雷帕霉素类似物使嵌合抗原受体(car)失活。

特别地，本发明提供了一种用于调节工程化免疫细胞的活化水平的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使用编码嵌合抗原受体(car)的至少第一多核苷酸转染免疫细胞，该嵌合抗原受体(car)可以通过外部配体在体内和/或体外活化；所述car包含第一结合结构域；和

(b)进一步使用编码工程化抑制性膜蛋白(imp)复合物的至少第二多核苷酸转染所述免疫细胞，所述imp复合物包含至少一个细胞内抑制性信号结构域和一个第二结合结构域，

使得所述免疫细胞共表达所述car和所述抑制性膜蛋白(imp)复合物；以及

(c)使所述工程化的免疫细胞接触所述外部配体，以便由所述car转导信号；然后

(d)通过添加可溶性化合物以降低所述car的所述信号转导水平，所述可溶性化合物结合所述imp的结合结构域和所述car分子的结合结构域以共定位所述imp和所述car，

由此调节工程化免疫细胞的活化水平。

通过“调节”活化水平，旨在通过给予可溶性化合物在car-工程化学免疫细胞上获得抑制反应，并且优选不是与现有技术的其它系统相反的破坏性反应。当患者发生不良事件的严重情况时，这特别有助于将car诱导的活化调整到患者的需求且更严格。

根据优选的实施方式，car转导的所述信号是免疫细胞的激活且免疫细胞被激活。

根据另一优选的实施方式，imp和car分子的共定位具有关闭car信号转导的作用。

本发明系统的一个有趣的特征是其基于蛋白质的共定位(即非共价结合)的灵活性。因此，在停止给予可溶性化合物(例如，雷帕霉素类似物)之后的短时间内，可以预期到可溶性化合物不再与结合结构域结合，“关闭”将不再进行且car工程化的免疫细胞将能够重新得到其潜力。

根据优选的实施方式，第一和第二结合结构域是cid结合结构域。

在本发明中，还可以考虑进行car转导信号“微调”的可能性：取决于给予给患者的car工程化免疫细胞的活性不足/过度后不良事件的严重程度，可以调节整可溶性化合物的剂量。

取决于信号的性质，在工程化免疫细胞中通过car转导的信号可以是对工程化免疫细胞的活化信号或失活信号。这取决于由免疫细胞表达的car中包括的转导信号结构域(活化或抑制性信号结构域)。当免疫细胞表达“正car”时(正car通常包含含有itam组分的活化结构域，具有在识别肿瘤表面特异性抗原时激活细胞(即其免疫功能)的效果)，imp将作用为针对细胞活化的制动器(刹车，brake)并且进一步充当“关闭”系统。相反，在转导信号由包含，例如抑制性信号结构域(如，基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim))的“负car”产生时，这种抑制将部分或全部解除，充当“接通”系统。

抑制性膜蛋白(imp)复合物

根据另一方面，本发明公开了抑制性双重car/imp复合物，其包含至少两种跨膜嵌合多肽：

-第一跨膜嵌合多肽，编码包含一个二聚化结合结构域的嵌合抗原受体；

-第二跨膜嵌合多肽，编码工程化抑制性膜蛋白(imp)复合物，imp复合物包含至少一个细胞内抑制性信号结构域和一个二聚化结合结构域。

根据优选的实施方式，抑制性双重car/imp复合物包含位于细胞外的二聚化结合结构域。

根据实施方式，作为所述抑制性双重car/imp复合物的一部分的car为多链car。

根据实施方式，作为所述抑制性双重car/imp复合物的一部分的car为单链car。

在一种实施方式中，作为工程化的抑制性膜蛋白(imp)复合物的一部分的内抑制性结构域是pd-1蛋白(也称为“程序性细胞死亡蛋白1”或cd279)。

根据优选的实施方式，二聚化结合结构域是fkbp或frb。根据更优选的实施方式，第一和第二结合结构域具有与seqidno14和seqidno15至少80％的同一性。

根据本发明，抑制性膜(imp)复合物对应于至少一种跨膜嵌合蛋白；该跨膜嵌合蛋白含有至少一个胞内抑制性信号结构域和一个结合结构域。

在一种实施方式中，imp复合物包含一种跨膜嵌合蛋白，该跨膜嵌合蛋白包含至少一个抑制性信号结构域和第一结合结构域，该第一结合结构域通过存在的可溶性化合物，能够结合到存在于嵌合抗原受体(car)上的第二结合结构域(图1和图2)。

这些抑制性信号结构域可能属于“免疫检查点”分子，其有效地作用为“制动器”以下调或抑制免疫反应。

在这些抑制性信号结构域中，有些可以是“功能性”抑制剂，因为它们能够通过(可逆的)翻译后修饰(如，通过去磷酸化机制(即对于pd-1))相互作用，有些可以是“结构性”抑制剂，如能够物理阻断蛋白质的抗体(优选人源化体内抗体)。

根据本发明，这些抑制性信号结构域可以来自，但不限于以下各项：程序性死亡1(pd-1，也称为pdcd1或cd279，登录号：nm_005018)、细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4，也称为cd152，genbank登录号af414120.1)、lag3(也称为cd223，登录号：nm_002286.5)、tim3(也称为havcr2，genbank登录号：jx049979.1)、btla(也称为cd272，登录号：nm_181780.3)、by55(也称为cd160，genbank登录号：cr541888.1)、tigit(也称为vstm3，登录号：nm_173799)、lair1(也称为cd305，genbank登录号：cr542051.1，(meyaard，ademaetal.1997))、siglec10(genebank登录号：ay358337.1)、2b4(也称为cd244，登录号：nm_001166664.1)、ppp2ca、ppp2cb、ptpn6、ptpn22、cd96、crtam、siglec7(nicoll，nietal.1999)、siglec9(zhang，nicolletal.2000；ikehara，ikeharaeta1.2004)、tnfrsf10b、tnfrsf10a、casp8、casp10、casp3、casp6、casp7、fadd、fas、tgfbrii、tgfrbri、smad2、smad3、smad4、smad10、ski、skil、tgif1、il10ra、il10rb、hmox2、il6r、il6st、eif2ak4、csk、pag1、sit1、foxp3、prdm1、batf(quigley，pereyraetal.2010)、gucy1a2、gucy1a3、gucy1b2、gucy1b3，这些蛋白已被描述为具有抑制免疫细胞活化的能力。

特别优选的抑制性信号结构域来自pd-1并且优选地包含与seqidno.23具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

除了这些免疫检查点(如pd-1)之外，针对免疫反应的其它抑制剂也包括在本发明内，例如某些细胞因子。

根据可替代的实施方式，本发明的imp复合物包括两种跨膜嵌合蛋白，各自包含可以通过可溶性化合物结合的结合结构域(图3)。

根据优选的实施方式，抑制性信号结构域是白细胞介素il-10rα和il-10rβ单体，并且优选地包含分别与seqidno.59和seqidno.60具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

通常，il-10r由两个待激活的亚基组成：il-10rα(参考uniprot：q13651；参考序列：np_001549)；和il-10rβ(参考uniprot：q08334，参考序列：nm_000628，对于人类物种)。根据satoshietal.(1999)，il-10对免疫细胞(如本发明的car-淋巴细胞t)的抑制作用是通过抑制干扰素α-和干扰素γ-诱导的基因的表达来获得的。

典型地，本发明的il10ra/il10b多肽分别包含分别与seqidno：59和seqidno：60具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在il10ra/il10b多肽的二聚化之后发生il-10r的抑制作用，并且导致涉及jak-stat信号路径的细胞因子，如干扰素ifn-γ、il-2、il-3或tnf-α的抑制(finbloometal.1995)。因此，功能性il-10r二聚体可以通过嵌合抗原受体(car)间接地监测或分流免疫细胞的活化。

除了il-10r白细胞介素之外，可以根据图3中示出的系统使用开关的其它实例，只要它们对于免疫分子是负调节因子并且它们是多聚的。它们之中，人们可以发现tgf-β(转化生长因子β)、vegf(血管内皮生长因子)或凋亡诱导多聚体受体，如tnfr(肿瘤坏死因子受体)或dr3(死亡受体-3)。

鉴于上述情况，包含抑制性信号结构域，如il-10r的根据本发明的imp的特征之一在于，这种抑制性系统不需要来自car的任何组分来启动其作用。因此，该抑制性系统可以与任何car组合，而不用考虑其特异性和架构，从而下调激活的cart细胞，同时充当“通用”开关。随后，本发明考虑了如先前描述的car和分子开关的组合使用，而无论由car靶向的抗原是什么。

imp复合物的跨膜部分不仅选自如在以下部分“嵌合抗原受体”中呈现的用于嵌合抗原受体(car)的那些，而且选自对此种多个部分的多肽的构建领域的技术人员而言看起来适合的多个其它跨膜部分。

根据本发明的imp复合物的结合结构域是能够结合到可溶性化合物的蛋白，可溶性化合物经由信号结构域介导对car活化的调节。优选地，本发明的系统由两个结合结构域组成，该两个结合结构域可以通过可溶性化合物的干涉而共定位或二聚化。

本发明的结合结构域优选为二聚化结构域。

根据一种或其它上述实施方式，这两个结合结构域存在于两个不同的imp上，或者一个结合结构域是一个imp的一部分而另一个存在于car上，这取决于所使用的抑制性信号结构域的类型和作用。

根据优选的实施方式，两个结合结构域与相同的可溶性化合物相互作用。

两个结合结构域的“共定位”或“二聚化”(也称为“化学诱导的二聚化”或cid)是指在某种小分子、酶或其他二聚体的存在下，两种蛋白质靠近在一起制成是一种非共价结合的大分子复合物。在本发明的情况下，这种cid系统使得操纵信号路径。

根据一种实施方式，结合或二聚化结构域是细胞外的。当作为二聚剂的小分子不具有免疫原性和/或不能容易穿过免疫细胞的膜时，该配置是有利的/更有利的。取决于所使用的抑制性信号结构域(例如，il10r与pd-1)，第一和第二结合或二聚化结构域可以分别存在于imp蛋白和car结构上(图1)，或者两者均存在于来自imp复合物的2个独立的多肽上(图3)。在第一种情况下，当一个结合结构域存在于car结构上时，抑制性信号结构域将直接对car起作用，这与第二种情形相反，在第二种情形中，imp复合物对免疫细胞活化具有抑制作用，这被视为独立于car的活化。

根据可替代的实施方式，结合结构域或二聚化结构域是细胞内的。当一个结合结构域或二聚化结构域是一个imp的一部分(具有抑制性信号结构域)以及第二结合结构域或二聚化结构域是car的一部分时，这种构象适用(图2)。例如，当使用潜在的免疫原性小分子时，这种化学诱导二聚化(cid)策略将是优选的。

结合结构域/二聚化结构域在α链上的定位对于结构或构象原因可能是有利的。

仍处于本发明范围内，二聚化结构域是优选的结合结构域，因此当在二聚化剂存在下时，一个结合结构域结合到另一结构域。

在可以预期的结合结构域中，人们可以找到多个配对，如fkbp/fkbp与二聚化剂fk1012(spenceretal，1993)；fkbp/can与二聚化剂fk506(hoetal，1996)；fkbp/cyp-fas与二聚化剂fkcsa(belshawetal，1996)；fkbp/frb与二聚化剂雷帕霉素(riveraetal，1996)；gyrb/gyrb与二聚化剂香豆霉素(farraretal，1996)；gai/gid1与二聚化剂赤霉素(miyamotoetal，2012)。在最后一篇公开出版物中，该系统已被证明不仅在高等植物中起作用而且还在哺乳动物细胞中起作用。

根据优选的实施方式，结合结构域是fkbp/frb，并且二聚化剂是雷帕霉素类似物，并且根据更优选的实施方式，雷帕霉素类似物是雷帕霉素。

根据特定的实施方式，结合结构域fkbp/frb是多肽，该多肽包含与seqidno：14和seqidno：15分别具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

根据一种实施方式，本发明涉及逆转录病毒载体，其包含前述的多核苷酸。

可溶性化合物

“可溶性化合物”是指可溶于患者血清的化合物，使其不会沉淀并作用于患者血液循环中存在的各种工程化免疫细胞。根据本发明的可溶性化合物优选为小分子，但也可以是双特异性抗体。如本文所使用的“小分子”是低分子量(＜2000道尔顿)的有机化合物。可应用于本发明中的小分子的非限制性实例包括大环内酯雷帕霉素及其类似物(也称为“雷帕霉素类似物”)，如ap21967、德福莫林(ap23573)、依维莫司(rad001)和替西罗莫司(cci-779)。可以应用于本发明的小分子的其它非限制性实例包括，他克莫司(fk506)、fk506衍生物，如fk1012、fk506类似物，如ap1903。可以应用于本发明中的小分子的其它非限制性实例，包括香豆霉素、赤霉素、haxs、ap1510、ap20187和ap21967。这些“小分子”可以快速扩散通过细胞膜，使得它们可以到达细胞内的作用位点并结合特定的蛋白质；它们作用为效应物，同时改变蛋白质的功能活性。例如，可以在http：//www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2011/mb_cgi？mode＝&term＝small+molecule+libraries中找到这些化合物的文库。

在优选的小分子中，特别适合于本发明的那些是能够二聚结合结构域的试剂，也称为二聚化剂，如雷帕霉素类似物。

对应于雷帕霉素的类似物的雷帕霉素类似物包括雷帕霉素(西罗莫司)、cci779(替西罗莫司)和rad001(依维莫司)。雷帕霉素是由复活节岛的土壤中发现的细菌吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)产生的大环抗生素。雷帕霉素被发现是一种有效的抗真菌药物，但也显示出最初被认为是不良的免疫抑制作用，这随后导致其发展为临床有用药物。在本发明设想的“可溶性化合物”中，还可以考虑使用抗体，更特别的是双特异性抗体和单克隆抗体。像小分子和二聚化剂一样，双特异性单克隆抗体的设计使得它们的表位可以同时结合imp复合物和/或car结构上存在的结合结构域。它们的结合通常使imp复合物和/或car的抑制性信号结构域共定位，并且因此导致对car的调节作用。

作为少数实施例，优选的双特异性单克隆抗体可以涉及frb蛋白的表位和fkbp蛋白的表位；或涉及fkbp蛋白的两种不同的表位；或涉及kbp蛋白上的表位和can蛋白上的一个表面；或涉及fkbp蛋白上的表位和cyp-fas蛋白上的一个表位；或涉及gyrb蛋白的两个不同表位；或涉及gai上的一个表位和gid1蛋白的一个表位。用于获得双特异性单克隆抗体的方法是本领域公知的(springert.a，1985)。

嵌合抗原受体

本发明旨在生产工程化免疫细胞，其中活化水平可以通过imp/car系统调节。为了进行这种调节，本发明提供了生产嵌合抗原受体(car)的具体设计，其更迅速地与imp复合物直接(图1-2)或间接(图3)地相互作用。

通常，car由融合至t细胞抗原受体复合物ζ链(scfv：ζ)的细胞内信号结构域的细胞外单链抗体(scfv)组成，并且当在t细胞中表达时，能够基于其他地方(wo2010025177a、wo2012079000a、wo2013126712a、ep2126054a)的单克隆抗体特异性，重定向抗原识别。可以在本发明中使用的car的多个实例是针对cd123(来自cellectis的克隆#43和#32716)、cs1和tpbg(5t4)的car，并且可以包含非限制性实施例的氨基酸序列：seqidno：2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5。

aml细胞的免疫表型的最新进展已经揭示出多种aml相关的细胞表面抗原，其可以作为未来疗法靶标。白细胞介素3受体α链(il-3rα；cd123-ncbi参考号：np_001254642)已经鉴定为一种潜在的免疫治疗靶，因为与正常造血干细胞相比，其在aml肿瘤细胞上过度表达。此外，cd123特异性治疗的两个i期试验已经完成，两种药物均表现出良好的安全性(临床试验政府编号id：nct00401739和nct00397579)。

用于包括结肠直肠癌、卵巢癌和胃癌等的实体瘤以及用于，如儿童急性淋巴细胞性白血病(all)等的非实体肿瘤的免疫治疗的一种候选抗原是滋养层糖蛋白，也称为tpbg或5t4(uniprot：q13641)。由于在胎儿滋养层(其中首次发现)或滋养层糖蛋白(tpbg)中的表达，5t4通常被称为癌胚抗原。5t4蛋白是含有七个富含亮氨酸的重复区的n-糖基化跨膜72kda糖蛋白(holeetal，1988)。发现5t4抗原在包括胃癌(starzynskaetal.1995)、卵巢癌和恶性上皮肿瘤(wrigleyetal.1995)在内的多个癌症中表达。另外，在具有高风险复发的儿童早期b型急性淋巴细胞白血病中表达5t4癌胚抗原(castroetal.2012)。其在正常组织中的表达非常有限，但是在恶性肿瘤的整个发展中广泛存在(carsbergetal.1995)。

cs1(gene参考号：cs1unq576/pro1138，uniprot参考号：q9nq25)是属于免疫球蛋白超家族(igsf)的cd2子集的细胞表面糖蛋白，并且被多发性骨髓瘤细胞高度表达，但很少由正常细胞表达(chuetal.2013)。根据本发明的新的嵌合抗原受体结构体包括另外的结合结构域，该结构域不同于针对存在于靶细胞上的组分的抗原识别结构域，并且其会与作用于imp蛋白的相同可溶性组分反应。

根据本发明的单链car基本是常规的单链一代car，其补充地含有针对可溶性分子的结合(或二聚化)结构域。

取决于所使用的cid策略，结合(或二聚化)结构域可以位于细胞外或细胞内。

在本发明的范围内还同时预期了第2代car(未组合共刺激分子)和第3代car(组合共刺激分子)。

在本发明的配置中，其中结合(或二聚化)结构域是细胞外的，根据本发明的car可以含有一种或多种下列组分：

(a)信号序列，以及2个抗原特异性靶向区中的一个(scfv的重链或轻链)；

(b)任选的连接子；

(c)结合(或二聚化)结构域；

(d)剩余的抗原特异性靶向区(scfv的重链或轻链)；

(e)任选的铰链(或间隔区)；

(f)跨膜结构域；

(g)含有至少一种共刺激分子的细胞内结构域。

从上述结构可以看出，相对于其它细胞外组分的位置，结合(或二聚化)结构域的位置可以改变。

本发明还包括如申请人先前在wo2014039523a或pct/ep2014/059662中所描述的多链car。

多链嵌合抗原受体(mccar)和单链嵌合抗原受体(sccar)构象均涵盖在本发明的范围内。根据本发明的多链car结构可以通过引入对可溶性化合物敏感的结合结构域(或二聚化结构域)，由先前的多链car进行调整。

如图1-2所示，取决于所使用的cid策略，结合结构域可以位于细胞外或细胞内。

在其中多链car衍生自，如wo2014039523a中的fc受体的情况下，结合结构域(或二聚化结构域)可以位于α链(fcεrα)、β链fcεrβ)或γ链(fcεrγ)上。

根据特定的实施方式，通过多链基嵌合抗原受体(car)转染工程化免疫细胞，在该多链基嵌合抗原受体(car)中，二聚化结构域中的一个是α链的一部分。

此种mccar可以包含下列组分中的一个或其子集：

-α链(fcεrα)，含有：

(a)信号序列和抗原特异性靶向区；

(b)结合结构域(或二聚化结构域)；

(c)细胞外间隔域(spacerdomain)(铰链)；

(d)跨膜结构域；

-β链(fcεrβ)，其含有：

(a)信号序列；

(b)细胞外间隔域(铰链)；

(c)跨膜结构域；

(d)共刺激配体；

-γ链(fcεεrγ)，其含有：

(a)信号序列；

(b)细胞外间隔域(铰链)；

(c)跨膜结构域；

(d)信号转导结构域。

根据另一特定实施方式，通过多链基嵌合抗原受体(mccar)转染工程化免疫细胞，在该多链基嵌合抗原受体(mccar)中，二聚化结构域中的一个是γ链的一部分；这类mccar可以包含下列组分中的一个或子集：

-α链(fcεrα)，含有：

(a)信号序列和抗原特异性靶向区；

(b)细胞外间隔域(铰链)；

(c)跨膜结构域；

(d)任选的一个或多个细胞内结构域；

-β链(fcεrβ)，其含有：

(a)信号序列；

(b)细胞外间隔域(铰链)；

(c)跨膜结构域；

(d)共刺激配体；

-γ链(fcεrγ)，其至少含有：

(a)信号序列；

(b)结合(或二聚化)结构域；

(c)细胞外间隔域(铰链)；

(d)跨膜结构域；

(e)信号转导结构域。

如本文中使用的“细胞外配体-结合结构域”被定义的寡肽或多肽，其能够结合配体。优选的，结构域将能够与细胞表面分子相互作用。

细胞外配体-结合结构域是单链抗体片段(scfv)，其包含靶抗原特异性单克隆抗体(由柔性连接子连接、对特定靶抗原特异)的轻链(vl)和重链(vh)可变片段。除了scfv之外，特异于特异性抗原的结合结构域也可以用于预定的靶向淋巴细胞，如作为非限制性实例的骆驼或鲨鱼(vnar)单结构域抗体片段或受体配体样血管内皮生长因子多肽、整合素(integrin)结合肽、调蛋白(heregulin)或il-13突变蛋白、抗体结合结构域、抗体高变环或cdr。

所述第一跨膜多肽可以进一步包含细胞外配体-结合结构域和跨膜结构域之间的茎区。在本文中使用的术语“茎区”通常是指任何寡肽或多肽，其作用为将跨膜结构域连接到细胞外配体-结合结构域。特别地，茎区被用来为细胞外配体-结合结构域提供更多的柔性和可达性。茎区可以包含多达300个氨基酸、优选10至100个氨基酸、并且最优选25至50个氨基酸。茎区可以衍生自天然产生的分子的全部或部分，如衍生自cd8、cd4或cd28的细胞外区域的全部或部分，或衍生自抗体恒定区的全部或部分。可替代地，茎区可以是相应于天然产生的茎序列的合成序列，或者可以是完全合成的茎序列。在优选的实施方式中，所述茎区是人类cd8α链(例如，np_001139345.1)的一部分。

因此，多链car在免疫细胞中的表达产生修饰的细胞，该修饰的细胞选择性地消除确定的靶标，包括，但不限于携带相应肿瘤相关性表面抗原的恶性细胞、或携带病毒特异性表面抗原的病毒感染细胞、或携带谱系特异性或组织特异性表面抗原的靶细胞。

根据本发明的多链car可以包含多个细胞外配体-结合结构域，以同时结合靶中不同的元素，由此增强免疫细胞活化和功能。细胞外配体-结合结构域可以串联在相同的跨膜多肽上，并且任选地可以通过连接子分离。在另一实施方式中，不同的细胞外配体-结合结构域可以位于构成多链car的不同跨膜多肽上。本发明可以涉及多链car群体，它们各自包含不同的细胞外配体结合结构域。

另外，本发明可以包括工程化免疫细胞，其在所述细胞表面表达多链car群体，car的每个包含不同的细胞外配体结合结构域。本发明还涉及工程化免疫细胞，其中导入了编码多肽(其组成多链car群体)的多核苷酸，多链car的每一个包含不同的细胞外配体结合结构域。多链car群体是指至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个多链car，它们中的每一个包含不同的细胞外配体结合结构域。根据本发明的不同的细胞外配体结合结构域可以同时结合靶中不同的元素，由此增强免疫细胞活化和功能。

在细胞外配体结合结构域结合到靶上导致免疫细胞的活化和免疫反应后，本发明的多链car的信号转导结构域或细胞内信号结构域负责细胞内信号传导。换言之，信号转导结构域负责激活免疫细胞(其中表达多链car)的至少一种正常效应子功能。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“信号转导结构域”是指转导效应信号功能信号并引导细胞执行专门功能的蛋白质部分。可在多链car中使用的信号转导结构域的实例，可以是fc受体或t细胞受体的细胞质序列，以及协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导的共同受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体，和具有相同功能的能力的任何合成序列。信号转导结构域包含两种不同类型的细胞质信号序列，即启动抗原依赖性初级激活的序列，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的序列。初级细胞质信号序列可以包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序的信号基序(称为itam)。itam是在多种受体的胞质内的尾部中发现的充分限定的信号基序，其作为syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。本发明中使用的itam的实例可以包括衍生自以下各项的作为非限制性实例的那些：tcrζ、fcrγ、fcrβ、fcrε、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。在优选的实施方式中，多链car的信号转导结构域可以包含cd3ζ信号结构域，或fcεriβ或γ链的胞质内结构域。

本发明的多链car的信号转导结构域可以包含共刺激信号分子。共刺激分子是除抗原受体以外的细胞表面分子，或有效免疫反应所需的其配体。

“共刺激配体”是指抗原呈递细胞上的分子，其特异性地结合t细胞上的同源共刺激分子，由此提供这样的信号，该信号(除了，例如由tcr/cd3复合物与mhc分子(加载有肽)的结合所提供的初级信号之外)介导t细胞应答，包括但不限于增殖激活、分化等。共刺激配体可以包括，但不限于cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、诱导型共刺激配体(icos-l)、细胞间粘附分子(icam、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、m1cb、hvem、淋巴毒素β受体、3/tr6、ilt3、ilt4、结合toll配体受体的激动剂或抗体以及与b7-h3特异性结合的配体)。共刺激配体还尤其包括，与存在于t细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，诸如，但不限于cd27、cd28、4-ibb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、ltght、nkg2c、b7-h3、特异性结合cd83的配体。

“共刺激分子”是指t细胞上特异性结合共刺激配体由此介导细胞的共刺激反应(诸如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括，但不限于mhci类分子、btla和toll配体受体。共刺激分子的实例包括cd27、cd28、cd8、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和特异性结合cd83的配体等。

所述信号转导结构域可以是tnfr-相关因子2(traf2)结合基序、共刺激tnfr成员家族的胞质内尾部(intracytoplasmictail)。共刺激tnfr家族成员的胞质内尾部含有由主要的保守基序(p/s/a)x(q/e)e)或次要基序(pxqxxd)组成的traf2结合基序，其中x是氨基酸。响应于受体三聚化，traf蛋白被招募到多个tnfr的细胞质内尾部中。

本发明的多链car的信号转导结构域可以包含共刺激信号分子4-1bb(genbank：aaa53133.)的一部分。

适当的跨膜多肽的区别特征，包括在免疫细胞(特别是淋巴细胞或天然杀伤(nk)细胞)的表面上表达的能力，以及一起相互作用以引导免疫细胞对预定靶细胞的细胞反应的能力。包含细胞外配体-结合结构域和/或信号转导结构域的本发明的多链car的不同的跨膜多肽一起相互作用，以在与靶配体结合后参与信号转导并且诱导免疫反应。跨膜结构域可以衍生自天然或合成的来源。跨膜结构域可以衍生自从任何膜结合或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可以是t细胞受体的亚基(如α、β、γ或ζ)、构成cd3复合物的多肽、il2受体p55(α链)、p75(β链)或γ链、fc受体的亚基(特别是fcγ受体iii的亚基)或cd蛋白。可替代地，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。

多链car可以包含来源于fcεri链的跨膜多肽，如fcεriα链，其中细胞外结构域被细胞外配体-结合结构域替换。

所述多链car可以包含fcεriα链的一部分和fcεriβ链的一部分，或者它们的变体，以便fcεri链自发地二聚化在一起以形成二聚化嵌合抗原受体。多链嵌合抗原可以包含fcεriα链的一部分和fcεriγ链的一部分，或者它们的变体，以便fcεri链自发三聚化在一起以形成三聚化嵌合抗原受体。另一个替代是多链嵌合抗原受体，其可以包含fcεriα链的一部分、fcεriβ链的一部分和fcεriγ链的一部分，或者它们的变体，以便fcεri链自发四聚化在一起以形成四聚化嵌合抗原受体。

多核苷酸，载体：

本发明还涉及编码上述的可调节的/可调的imp复合物和根据本发明的car多肽结构的多核苷酸、载体。本发明提供多核苷酸，包括dna和rna分子，其编码本文公开的跨膜多肽(包括在多链或多链car中)。特别地，本发明涉及这样的多核苷酸，其包含编码组成上述多链/单链car的至少一种跨膜多肽的核酸序列。更特别地，本发明涉及一种多核苷酸，其包含编码组成上述多链/单链car的跨膜多肽的两种或多种核酸序列。

多核苷酸可以可以存在于表达盒或表达载体中(例如，用于引入到细菌宿主细胞中的质粒，或用于转染昆虫宿主细胞的病毒载体，例如杆状病毒载体，或用于转染哺乳动物宿主细胞的质粒或病毒载体，如慢病毒)。

根据一种实施方式，在用于产生工程化免疫细胞的本发明方法期间实现的转染，是使用慢病毒或逆转录病毒载体进行的，以便将car和/或imp稳定整合到免疫细胞基因组中。

根据另一实施方式，通过使用car/imp编码多顺反子mrna进行转染以便于暂时表达。

可以将不同的核酸序列包括在核酸序列(包含编码核糖体跳过序列)(如编码2a肽的序列)的一个多核苷酸或载体中。在小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒群亚型中鉴定出的2a肽，导致核糖体从一个密码子到下一个密码子“跳过”，而不在由密码子编码的两个氨基酸之间形成肽键(参见donnellyetal.，j.ofgeneralvirology82：1013-1025(2001)；donnellyetal.，j.ofgen.virology78：13-21(1997)；doroninaetal.，mol.and.cell.biology28(13)：4227-4239(2008)；atkinsetal.，rna13：803-810(2007))。“密码子”是指由核糖体翻译成一个氨基酸残基的mrna上(或dna分子的有义链上)的三个核苷酸。因此，当多肽被框中的2a寡肽序列分隔开时，可以由mrna内的单个连续的开放阅读框合成两个多肽。这种核糖体跳过机制是本领域公知的，并且已知被多种载体使用以表达由单个信使rna编码的多种蛋白质。

为了将跨膜多肽(如fcεr)引导至宿主细胞的分泌路径中，在多核苷酸序列或载体序列中提供了分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)。分泌信号序列可以是fcεr的分泌信号序列，或者可以来源于另一个分泌的蛋白(例如，t-pa)或者是从头合成的。分泌信号序列可操作地连接至跨膜核酸序列，即两个序列在正确的阅读框架中接合并定位以将新合成的多肽引导到宿主细胞的分泌路径中。分泌信号序列通常定位在编码目标多肽的核酸序列的5’端，但是某些分泌信号序列可以定位在目标核酸序列的其它位置(参见，例如welchetal.，美国专利no.5,037,743；hollandetal.，美国专利no.5,143,830)。在优选的实施方式中，信号肽包含fcεriα链(np_001992.1)的1至25号残基。

本领域技术人员将认识到，鉴于遗传密码的简并性，这些多核苷酸分子之间存在相当大的序列变异是可能的。优选地，本发明的核酸序列被密码子优化以用于在哺乳动物细胞中表达，优选用于在人细胞中表达。密码子优化是指目标序列中，通常在给定物种的高度表达基因中罕见的密码子，与通常在这些物种的高度表达基因中常见的密码子的互换，编码氨基酸的此种密码子作为被互换的密码子。

工程化免疫细胞

本发明还涉及分离的免疫细胞，其是具有至少一种工程化(imp)抑制性膜蛋白的嵌合抗原受体(car)。

欲根据本发明使用的免疫细胞可以是例如t细胞、细胞毒性t细胞、调节性t细胞或nk细胞。

根据特定的实施方式，免疫细胞是t细胞。

在imp复合物转染步骤后，并且在与外部配体温育步骤之前(诸如表面抗原)，工程化免疫细胞可以被输注到患者体内。

根据某些实施方式，本发明提供了一种可调节的/可调的免疫细胞，其也被工程化为同种异体的。这种非自体特征对于开发标准化疗法特别有用，其中同种异体治疗细胞可以预先制造并可用于立即向患者给予。

此种方法包含失活编码t细胞受体(tcr)组分的至少一种基因(特别是tcrα、tcrβ基因)的步骤。

在制备本发明的可调节的/可调的car-工程化免疫细胞期间的任何时间，可以进行，例如tcr组分的失活步骤。然而，优选在转染步骤之前进行，以便不会对细胞的生长/扩增产生过多相互作用。

还涵盖在本发明范围内的是进一步工程化免疫细胞(即t细胞)的可能性，从而使得它们耐化疗药物，如嘌呤核苷酸类似物(氯法拉滨、氟达拉滨...)。

根据本发明，实现这些基因失活的特别合适的方法是使用外切核酸酶如tale核酸酶。这可以，如其他地方的描述来进行(wo2012138927和下一章节“定义”中所引用的现有技术)。

工程化免疫细胞的方法

本发明还涉及用于生产可调节的/可调的car-工程化免疫细胞的方法，其包括两个转染步骤(第一步是编码嵌合抗原受体(car)的至少第一多核苷酸的转染，且第二步是具有抑制性膜蛋白(imp)复合物的第二多核苷酸的转染)以及，最后的选择具有共表达多核苷酸的免疫细胞的步骤。

在另一实施方式中，本发明涉及生产用于免疫治疗的工程化免疫细胞的方法，包括向细胞中导入不同多肽(其组成car/imp)，以及扩增所述细胞。在优选的实施方式中，考虑到在细胞中稳定表达，多核苷酸被包括在慢病毒载体中。这样的慢病毒载体可以包含标记基因(如gfp)和/或萤火虫荧光素酶。

在又一实施方式中，在生产工程化免疫细胞方法中的所述转染步骤a)，通过经由重组方法(优选同源重组)插入car和imp多核苷酸来进行。该实施方法具有更特异的整合和更少的异位插入的优点。在优选的实施方式中，通过表达外源特异性内切核酸酶以及添加编码car/imp肽的至少一种多核苷酸模板来进行这种位点特异性插入。作为实施例，位点特异性插入可以在tcr基因中完成，这使得减少或消除tcr(t细胞受体)功能，具有使免疫细胞(特别是t细胞)具有更少的同种异体反应的效果。在免疫细胞是同种异体的免疫治疗的背景下，该在后的方面特别地寻求降低gvhd的风险。

特异性核酸酶通常在基因组的所需位置产生双链断裂(dsb)，并利用细胞的内源机制通过同源重组(hr)和非同源末端连接(nhej)的自然过程修复所诱导的断裂。工程化的核酸酶，如锌指核酸酶(zfn)、转录激活子样效应子核酸酶(talen)、工程化的归巢内切核酸酶和rna或dna引导的核酸内切酶(如crispr/cas、cpf1或argonaute系统)特别适合于进行本发明的基因插入或失活。

在其它参考文献中，wo2013/176915和wo2014/191128分别描述了talen和cas9。锌指核酸酶(zfn)已初步描述于kim，yg；cha，j.；chandrasegaran，s.(1996).″hybridrestrictionenzymes：zincfingerfusionstofokicleavagedomain″.procnatlacadsciusa93(3)：1156-60中。

递送方法

上述的不同方法涉及在细胞中表达目标蛋白，如imp复合物、嵌合抗原受体(car)。作为将编码多肽的多核苷酸导入到细胞中的结果，可以在细胞中表达多肽。可替代地，可以在细胞外产生多肽，然后将其导入到细胞中。用于将多核苷酸构建体导入到细胞中的方法在本领域中是已知的并且包括作为非限制性实例的稳定转化方法(其中多核苷酸构建体被整合到细胞的基因组中)、瞬时转化方法(其中多核苷酸构建体未整合到细胞的基因组中)和病毒介导的方法。可以通过，例如重组病毒载体(例如，逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等将多核苷酸导入到细胞中。例如，瞬时转化方法包括，例如显微注射、电穿孔或粒子轰击。考虑到在细胞中表达，多核苷酸可以包括在载体中，更特别是质粒或病毒中。质粒载体可以包含选择标记，其提供对接收载体的细胞的鉴定和/或选择。不同的转基因可以被包含在一个载体中。所述载体可以包含编码核糖体跳过序列的核酸序列，例如编码2a肽的序列。在小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒群亚型中鉴定出的2a肽，导致核糖体从一个密码子到下一个密码子的“跳过”，而不在由密码子编码的两个氨基酸之间形成肽键(参见donnellyetal.，j.ofgeneralvirology82：1013-1025(2001)；donnellyetal.，j.ofgen.virology78：13-21(1997)；doroninaetal.，m0l.and.cell.biology28(13)：4227-4239(2008)；atkinsetal.，rna13：803-810(2007))。“密码子”是指由核糖体翻译成一个氨基酸残基的mrna上(或dna分子的有义链上)的三个核苷酸。因此，当多肽被框中的2a寡肽序列分隔开时，可以由mrna内的单个连续的开放阅读框合成两个多肽。这种核糖体跳过机制是本领域公知的，并且已知被多种载体使用以表达由单个信使rna编码的多种蛋白质。

根据本发明的编码多肽的多核苷酸可以是mrna，其例如，通过电穿孔而被直接导入到细胞中。发明人确定了用于在t细胞中的mrna电穿孔的最佳条件。发明人使用细胞波(cytopulse)技术(其使得通过使用脉冲电场)以瞬时透化活细胞，以将材料递送到细胞中。基于使用pulseagile(btxhavardapparatus，84octoberhillroad，holliston，ma01746，usa)电穿孔波形的技术使得能够准确地控制脉冲持续时间、强度以及脉冲之间的间隔(美国专利6,010,613和国际pct申请wo2004083379)。所有这些参数均可以被改变，以便达到获得最高转染效率且最低死亡率的最佳条件。本质上，第一高电场脉冲使得孔形成，而随后的较低电场脉冲使得将多核苷酸移动到细胞中。

t细胞的活化和扩增

无论是在t细胞的基因改造之前或之后，通常均可以使用在以下各项中描述的方法来激活和扩增t细胞，例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041和美国专利申请公开no.20060121005。可以在体外或体内扩增t细胞。通常，通过与试剂的接触来扩增本发明的t细胞，试剂刺激t细胞表面上的cd3tcr复合物和共刺激分子，以便为t细胞制造激活信号。例如，可以使用化学物质，如钙离子载体a23187、佛波醇12-肉豆蔻酰13-乙酸酯(pma)或促有丝分裂凝集素样植物血凝素(pha)来为t细胞创造激活信号。作为非限制性实例，可以在体外刺激t细胞群体，例如通过与抗-cd3抗体或其抗原结合片段或者固定在表面上的抗-cd2抗体接触，或通过与钙离子载体联合的蛋白激酶c激活剂(例如，苔藓抑制素)接触。为了共刺激t细胞表面上的辅助分子，使用了结合辅助分子的配体。例如，可以在适合于刺激t细胞增殖的条件下，使t细胞群与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。为了刺激cd4+t细胞或cd8+t细胞的增殖，可以使用抗cd3抗体和抗cd28抗体。例如，提供各种信号的试剂可以在溶液中或偶合到表面上。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。

适于t细胞培养的条件包括适合的培养基(例如最低必需培养基或rpmi培养基1640或x-vivo5，(lonza))，该培养基可以含有增殖和生存所必需的因子，包括血清(例如胎牛血清或人血清)、白细胞介素-2(il-2)、胰岛素、ifn-g、1l-4、1l-7、gm-csf-10、gm-csf-2、1l-15、tgfp、il-21和tnf-或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括，但不限于表面活性剂、人血浆蛋白液和还原剂，如n-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括rpmi1640、a1m-v、dmem、mem、a-mem、f-12、x-vivo1和x-vivo20、优化剂(optimizer)、添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清，或补充有适量是的血清(或血浆)或定义的激素组、和/或量足以使t细胞生长和扩增的细胞因子。抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅包括在实验培养物中，但不包括在要输注到受试者体内的细胞培养物中。靶细胞被维持在支持生长所需的条件下；例如适合的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％co2)。已经暴露于不同刺激时间下的t细胞可能表现出不同的特征。

治疗性应用

在另一实施方式中，如前所获得的分离的免疫细胞可用于过继性细胞免疫治疗。

根据可替代的实施方式，所述免疫细胞来自患者本身。根据一种实施方式，从供体获得所述免疫细胞。

根据另一实施方式，所述免疫细胞是同种异体的，以便可以制备一批细胞给予一组患者而不仅是供体本身。在经济术语中代表真正优势的这个特征是强制性的，以降低移植排斥的风险。

为实现这个目标，免疫细胞，如t细胞在t细胞受体(tcr)基因中经历敲除(ko)，t细胞受体(tcr)基因负责识别结合到主要组织相容性复合物(mhc)分子的抗原。通过失活tcr基因，后者不能与抗原肽和mhc(肽/mhc)接合，因此不存在t淋巴细胞的活化。

根据一种实施方式，通过敲除(ko)对tcr基因的失活是通过核酸内切酶来实施的，优选通过tale-核酸酶实施。

特别地，根据本发明的所述t细胞可以用来在有需求的患者中治疗癌症、感染或自身免疫疾病。

在另一方面，本发明依赖于治疗有需求的患者的方法，方法包括下列步骤中的至少一个：

(a)提供可通过前述方法的任一种获得的分离的t细胞；

(b)将细胞给予给患者。

本发明的所述t细胞可以经受坚强的体内扩增并且可以持续较长的时间。

所述治疗可以是改善、治愈或预防性的。这可以在标准协议下完成，并根据需要可以重复多次。所得到的经修饰的t细胞可以给予患者或根据其作为“现成”治疗产品的可用性给予一个或多个患者。

可以与所公开的方法一起使用的细胞描述于前面部分中。所述治疗可用于治疗诊断患有癌症、病毒感染和自身免疫疾病的患者。可以治疗的癌症包括没有血管化的或基本尚未血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(例如，血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可以包括实体瘤。将用本发明的耐药的同种异体t细胞治疗的癌症的类型包括，但不限于恶性上皮肿瘤、胚细胞瘤、肉瘤和和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤、恶性上皮瘤和黑素瘤。还包括的是成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。在本发明的实施方式中，通常通过根据本发明的同种异体耐药性t细胞来治疗儿童急性淋巴细胞性白血病(all)和肌萎缩性骨髓瘤白血病(aml)疾病。这可以分别通过使用耐药性kotraccd19⁺cart细胞和耐药性kotraccd123⁺t细胞来实现。“trac”是指“t细胞受体α恒定基因”并且对应于tcrα亚基恒定基因。

这可以是与以下疗法相结合的治疗：从由抗体治疗、化疗、细胞因子治疗、树突细胞治疗、基因治疗、激素治疗、激光治疗和放射治疗组成的组中选择的一种或多种针对癌症的疗法。

所述治疗可以给予进行免疫抑制治疗的患者，例如由于药物抗性基因的表达或药物致敏基因的失活而使得对至少一种药剂具有抗性的细胞或细胞群。在这一方面，药物治疗应有助于根据本发明的t细胞在患者体内的选择和扩增。

根据本发明的细胞或细胞群的给予可以以任何方便的方式进行，包括气雾剂吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本文的组合物可以通过皮下、皮内、肿瘤内、肠内、髓内，肌内，颅内、静脉内或淋巴内射、或腹膜内注射。在一种实施方式中，本发明的细胞组合物优选通过静脉注射来给予。

细胞或细胞群的给予可以由每kg体重给予10³-10¹⁰个细胞组成，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括处于前述范围内的所有整数细胞数。可以以一次或多次剂量来给予细胞或细胞群。在另一实施方式中，所述有效量的细胞以单剂量给予。在另一实施方式中，有效量的细胞在一段时间内以多于一次剂量给予。给予时间处于管理医师的判断范围内，并取决于患者的临床状况。细胞或细胞群可以从任何来源获得，例如血库或供者。虽然个体需要变化，但用于特定疾病或病症的给定细胞类型的有效量的最佳范围的确定，处于本领域技术人员的知识范围内。有效量是指提供治疗或预防益处的量。给予的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重、共同治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和期望效果的性质。

有效量的细胞或药物组合物可以优选肠胃外给予。给予可以是静脉内给予。给予可以通过在肿瘤内注射直接进行。

可以结合(例如，之前、同时或之后)任何数量的相关治疗方式向患者给予细胞，相关治疗方式包括，但不限于使用，如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2等药剂的治疗，用于ms患者的阿糖胞苷(也称为ara-c)或那他珠单抗治疗，或用于牛皮癣患者的依法利珠单抗治疗，或用于pml患者的其它治疗。本发明的t细胞可以与化疗、放疗、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲喋呤、霉酚酸酯和fk506)、抗体、或其他免疫消融剂(如campath、抗-cd3抗体或其它抗体疗法)、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、fk506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228、细胞因子和放射组合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和fk506)或抑制对生长因子诱导的信号重要的p70s6激酶(雷帕霉素)(liuetal.，cell66：807-815，11；hendersonetal.，immun.73：316-321，1991；biereretal.，citrr.opin.mmn.5：763-773，93)。本发明的细胞组合物可以结合以下各项向患者联合给予：(例如，之前、同时或之后的)骨髓移植、使用化疗药剂(如氟达拉滨、外束放射治疗(xrt)、环磷酰胺)或抗体(如okt3或campath)的t细胞消融疗法。可以在b细胞消融疗法(如与cd20反应的药剂，例如rituxan)之后，给予本发明的细胞组合物。例如，受试者可以经历如下标准治疗：用高剂量化疗，然后进行外周血干细胞移植。移植后，受试者可接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。扩增的细胞可以在手术之前或之后给予。

药物组合物

本发明的分离的t细胞可以单独给予，或者作为与稀释剂和/或其他组分组合的药物组合物来给予。简而言之，本发明的组合物可以包含本文描述的t细胞以及一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此种组合物可以包含缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制为用于静脉给予。本发明的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式给予。尽管可以通过临床试验来确定适当剂量，但给予的数量和频率将由患者的状况以及患者疾病的类型和严重性等因素确定。

试剂盒和载体

本发明包括用于具有可调节的活化水平的工程化免疫细胞的试剂盒或载体，其包含：

-编码嵌合抗原受体(car)的第一多核苷酸；和

-编码如上描述的“抑制性膜复合物”段落中所描述的工程化抑制性膜蛋白(imp)复合物的第二多核苷酸。

定义

在上述描述中，广泛地使用了多个术语。提供以下定义以便于理解本发明的实施方式。

-多肽序列中的氨基酸残基在本文中根据单字母代码来指定，其中例如q表示gln或谷氨酰胺残基，r表示arg或精氨酸残基，d表示asp或天冬氨酸残基。

-核苷酸指定如下：使用单字母代码指定核苷的碱基：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，g是鸟嘌呤。对于简并核苷酸，r表示g或a(嘌呤核苷酸)，k表示g或t，s表示g或c，w表示a或t，m表示a或c，y表示t或c(嘧啶核苷酸)，d表示g、a或t，v表示g、a或c，b表示g、t或c，h表示a、t或c，n表示g、a、t或c。

-如本文所使用的，“核酸”或“核酸分子”是指核苷酸和/或多核苷酸，如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，寡核苷酸，由聚合酶链反应(pcr)生成的片段，和通过连接、断裂、内切核酸酶作用和外切核酸酶作用产生的片段。核酸分子可以由如下单体组成：天然存在的核苷酸(如dna和rna)、或天然存在核苷酸的类似物(例如天然核苷酸的对映体形式)或两者的组合。核酸可以是单链或双链的。

-“基因”是指遗传的基本单位，由沿着染色体线性排列的dna片段组成，其编码特定蛋白质或蛋白质的片段、小rna等。基因通常包括启动子、5′非翻译区、一个或多个编码序列(外显子)、任选的内含子、3′非翻译区。基因还可以包含终止子、增强子和/或沉默子。

-“基因组”是指细胞中包含的全部遗传物质，如核基因组、叶绿体基因组、线粒体基因组。

-“突变”是指多核苷酸(cdna、基因)或多肽序列中的一个或多个核苷酸/氨基酸的替换、缺失、插入。突变可影响基因或其调节序列的编码序列。其也可能影响基因组序列的结构或编码的mrna的结构/稳定性。

-“tale-核酸酶”是指由典型地来源于转录活化子样效应子蛋白(tale)的dna结合结构域与内切核酸酶催化结构域的融合产生的工程化蛋白。此种催化结构域优选为核酸酶结构域且更优选为具有核酸内切酶活性的结构域，例如i-tevi、cole7、nuca和fok-i。在特定的实施方式中，所述核酸酶是单体tale-核酸酶。单体核酸酶是不需要为特异性识别和切割而二聚化的核酸酶，如wo2012138927中描述的工程化dna结合结构域与i-tevi的催化结构域的融合。在另一特定的实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶是二聚化tale核酸酶，优选包含融合到foki的dna结合结构域。tale-核酸酶已经被描述和用于刺激基因靶向和基因修饰(boch，scholzeetal.2009；moscouandbogdanove2009；christian，cermaketal.2010)。可以商品名talen^tm(cellectis，8ruedelacroixjarry，75013paris，france)商购这种工程化的tale-核酸酶。

-术语“切割”是指多核苷酸的共价主链的断裂。切割可以通过多种方法引发，包括，但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和双链切割都是可能的，并且两个不同的单链切割事件可导致发生双链切割。双链dna、rna或dna/rna杂交切割可导致产生钝端或交错末端。

-“嵌合抗原受体(car)”是指包含细胞外配体-结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域的嵌合受体。

-如本文使用的术语“细胞外配体-结合结构域”定义为寡肽或多肽，其能够结合配体。优选地，结构域能够与细胞表面分子相互作用。例如，细胞外配体-结合结构域可以经选择以识别在靶细胞(与特定疾病状态相关)表面上充当细胞表面标记物的配体。

在优选的实施方式中，细胞外配体-结合结构域包含单链抗体片段(scfv)，其包含由柔性连接子接合的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链(vl)和重链(vh)可变片段。在优选的实施方式中，scfv来源于cd123、5t4或cs1抗体。

根据本发明的car的信号转导结构域或细胞内信号结构域，在细胞外配体结合结构域与靶结合后，负责细胞内信号，导致免疫细胞的活化和免疫反应。在car中使用的信号转导结构域的优选的实例可以是t细胞受体的细胞质序列以及共同受体的细胞质序列，该共同受体协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导。信号转导结构域包含两个不同类的细胞质信号序列，即启动抗原依赖性初级激活的序列，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的序列。初级细胞质信号序列可以包含被称为itam的基于免疫受体酪氨酸的激活基序的信号基序。在特定的实施方式中，本发明的car的信号转导结构域包含共刺激信号分子。共刺激分子是一种除了抗原受体之外的细胞表面分子或有效免疫反应所需的它们的配体。共刺激分子包括，但不限于mhci类分子、btla和toll配体受体。共刺激分子的实例包括cd27、cd28、cd8、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和特异性结合cd83的配体等。

根据本发明的car表达在细胞的表面膜上。因此，car可以包含跨膜结构域。适当的跨膜结构域的区别特征包括在细胞(在本发明中优选免疫细胞，特别是淋巴细胞或天然杀伤(nk)细胞)的表面上表达的能力，以及一起相互作用以引导免疫细胞对预定靶细胞的细胞反应的能力。跨膜结构域可以进一步包含在细胞外配体-结合结构域与跨膜结构域之间的茎区。在本文中使用的术语“茎区”通常是指发挥将跨膜结构域连接到细胞外配体-结合结构域作用的寡肽或多肽。特别地，茎区被用来为细胞外配体-结合结构域提供更多的柔性和可达性。茎区可以包含多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。茎区可以衍生白天然存在的分子的全部或部分，如衍生自cd8、cd4或cd28的细胞外区域的全部或部分，或衍生自抗体恒定区的全部或部分。可替代地，茎区可以是相应于天然存在的茎序列的合成序列，或可以是完全合成的茎序列。

通常在癌细胞中观察到靶抗原的下调或突变，从而产生抗原缺失逃逸变体。因此，为了抵消肿瘤的逃逸并使免疫细胞对靶更具特异性，cd19特异性car可以包含另一细胞外配体-结合结构域，以同时结合靶中的不同元素，从而增强免疫细胞的活化和功能。cd19特异性car的实例是scfvfmc63(kochenderferjn，wilsonwh，janikje，etal.eradicationofb-lineagecellsandregressionoflymphomainapatienttreatedwithautologoustcellsgeneticallyengineeredtorecognizecd19.blood2010；116(20)：4099-410)或scfv4g7car(描述于以申请号pct/ep2014/059662提交的申请)。在一种实施方式中，细胞外配体-结合结构域可以串联放置在相同的跨膜多肽上，并且任选地可以通过连接子分隔开。在另一种实施方式中，不同的细胞外配体-结合结构域可以被放置在组成car的不同的跨膜多肽上。在另一实施方式中，本发明涉及car群体，car各自包含不同的细胞外配体结合结构域。在特定的实施方式中，本发明涉及一种工程化免疫细胞的方法，其包含提供免疫细胞并且在细胞的表面上表达car群体，car群体中的每一个包含不同的细胞外配体结合结构域。在另一特定的实施方式中，本发明涉及一种工程化免疫细胞的方法，包含提供免疫细胞并且向细胞中导入编码构成car群体的多肽的多核苷酸，car群体中的每一个包含不同的细胞外配体结合结构域。“car群体”是指至少两、三、四、五、六或更多个car，它们的每一个包含不同的细胞外配体结合结构域。根据本发明的不同的细胞外配体结合结构域优选地可以同时结合靶中的不同元素，由此增强免疫细胞活化和功能。本发明还涉及一种分离的免疫细胞，其包含car群体，该car群体中的每一个包含不同的细胞外配体结合结构域。

-术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。本发明的“载体”包括，但不限于病毒载体、质粒、rna载体或可由染色体、非染色体、半合成的或合成的核酸组成的线性或环状dna或rna分子。优选的载体是能够自主复制(附加型载体)和/或表达其连接的核酸(表达载体)的那些。大量合适的载体是本领域技术人员已知的并且可商购。

-“递送载体”是指任何递送载体，其可以用于本发明中以将本发明中需要的试剂/化学物质和分子(蛋白质或核酸)与细胞接触(即“接触”)或递送到细胞或亚细胞室内(即“导入”)。它包括，但不限于脂质体递送载体、病毒递送载体、药物递送载体、化学载体、聚合物载体、脂溶复合物、复合物、树枝状大分子、微泡(超声造影剂)、纳米颗粒、乳剂或其它合适的转移载体。

-病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒)、冠状病毒、诸如原粘液病毒(例如流感病毒)等负链rna病毒、弹状病毒(例如，狂犬病和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如，麻疹和仙台)、正链rna病毒诸如小rna病毒和甲病毒、和双链dna病毒包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒)、和痘病毒(例如牛痘、禽痘和金丝雀痘)。其它病毒包括，例如诺瓦克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠弧病毒、乳突病毒、嗜肝dna病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病肉瘤，哺乳动物c型病毒、b型病毒、d型病毒、htlv-blv组、慢病毒、泡沫病毒(coffin，j.m.，retroviridae：thevirusesandtheirreplication，infundamentalvirology，thirdedition，b.n.fields，etal.，eds.，lippincott-ravenpublishers，philadelphia，1996)。

-“慢病毒载体”是指基于hiv的慢病毒载体，由于其相对于较大的包装能力、降低的免疫原性和高效率稳定地转导大范围的不同细胞类型的能力而对基因递送非常有前景。通常在将三种(包装、包膜和转移)或更多的质粒瞬时转染入生产细胞后产生慢病毒载体。像hiv一样，慢病毒载体通过细胞表面上的病毒表面糖蛋白与受体的相互作用进入靶细胞。进入时，病毒rna经历逆转录，其是由病毒逆转录酶复合物介导的。逆转录产物是双链线性病毒dna，其是用于将病毒整合至感染细胞dna中的底物。“整合性慢病毒载体(或lv)”是指作为非限制性实例，能够整合靶细胞的基因组的载体。相反，“非整合性慢病毒载体(或nilv)”是指不通过病毒整合酶作用整合靶细胞的基因组的有效的基因递送载体。

-一个或多个细胞(cellorcells)是指任何真核生物细胞、原代细胞和来自这些生物体的用于体外培养的细胞系。

-“一个或多个原代细胞(primaryorprimarycells)”是指直接从活组织(即活组织检查材料)取出并建立用于在体外生长的细胞，与连续致瘤或人工永生细胞系相比，其经历了很少的群体倍增并因此更能代表其来源的组织的主要功能组分和特征。作为非限制性的实例，细胞系可以选自由以下组成的组：cho-k1细胞、hek293细胞、caco2细胞、u2-os细胞、nih3t3细胞、nso细胞、sp2细胞、cho-s细胞、dg44细胞、k-562细胞、u-937细胞、mrc5细胞、imr90细胞、jurkat细胞、hepg2细胞、hela细胞、ht-1080细胞、hct-116细胞、hu-h7细胞、huvec细胞、molt4细胞。

-因为衍生这些多肽的基因组数据可能产生一些变异性，并且还考虑到替换这些多肽中存在的某些氨基酸而不会显著损失活性(功能性变体)的可能性，因此本发明包括上述多肽的与本专利申请提供的序列共有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且甚至更优选至少95％同一性的多肽变体。

因此，本发明涉及多肽，其包含的多肽序列与选自由seqidno：1至seqidno：60组成的组中的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％或99％的序列同一性。

-“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。同一性可以通过比较用于对比目的而比对的每个序列中的位置来确定。当比较序列中的位置被相同的碱基占据时，则分子在该位置处是同一的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性程度是由核酸序列在位置上共有同一或匹配的核苷酸数量的函数。可以使用各种比对算法和/或程序来计算两个序列之间的同一性，包括作为gcg序列分析套装(universityofwisconsin，madison，wis.)的一部分而获得的fasta或blast，并且可以缺省设置使用。例如，预期了与本文描述的具体多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且优选表现出基本上相同功能的多肽，以及编码此种多肽的多核苷酸。

除了用于工程化对嘌呤核苷酸类似物(pna)药物(特别是氯法拉滨和氟达拉滨)具有抗性的t细胞的一般方法之外，还可以通过内切核酸酶失活dck基因。

一般方法

原代细胞

通过密度梯度离心从健康志愿者供体(etablissementdusang)的血沉棕黄层(白膜层，buffycoat)分离外周血单核细胞。然后，使用easysep人t细胞富集试剂盒(stemcelltechnologies)纯化t淋巴细胞，并且在补充有20ng/mlil-2(miltenyi)和5％人类ab血清(seralab)的x-vivo15培养基(lonza)中，使用dynabeads人类t-激活剂cd3/cd28(lifetechnologies)进行活化。

细胞系

从美国模式培养物保藏所获得cd123-阳性细胞系，如kg1a或molm13和cd123-阴性细胞系，如rpmi-8226以用于多发性骨髓瘤(mm)。典型地，将细胞培养于补充有10-20％热灭活的fcs、2mmol/ll-谷氨酰胺和100单位/毫升青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi1640中。

编码imp/car的mrna的合成

在mrna合成之前，通过pcr引入t7启动子和终止密码子序列，以扩增car结构的所有个体链。在体外从pcr产物转录编码目的蛋白的mrna并且使用mmessagemmachinet7ultra试剂盒(lifetechnologies)按照制造商的说明进行聚腺苷酸化。使用rneasy柱(qiagen)在cytoporation培养基t中洗脱以纯化rna，并且通过使用nanodropnd-1000分光光度计在260nm下测量吸光度进行定量。在变性甲醛/mops琼脂糖凝胶上验证rna的质量。

t细胞中的瞬时表达

在多顺反子mrna的电穿孔后，在人类t细胞中表达由car和编码工程化抑制性膜蛋白(imp)复合物的第二多核苷酸构成的本发明的开关系统。使用以mmessagemmachine试剂盒生产的封端且多腺苷酸化的多顺反子mrna和作为模板的线性化质粒对t细胞进行电穿孔。用作模板的质粒含有t7rna聚合酶启动子，随后是编码不同car/imp变体的多顺反子dna序列。

使用cytolvt-s设备(cellectis)，根据以下协议进行多顺反子mrna进入人类t细胞的电穿孔：将使用抗cd3/cd28涂珠和il2预活化数天(3-5)的5×10⁶t细胞再悬浮于cytoporation缓冲剂t中，并且使用45μgmrna进行电穿孔。电穿孔二十四小时后，用可固定活力染料efluor-780和特异性pe-共轭的山羊抗鼠iggf(ab’)2片段标记人类t细胞，该人类t细胞是经使用编码多链car的多顺反子mrna工程化的，并且通过流式细胞术进行分析。

使用多顺反子mrna工程化的活t细胞在它们的表面上表达多链car。

t细胞中的慢病毒表达

car特异性imp/car的体外筛选

如先前报道的，使用慢病毒载体将编码car的多顺反子基因和编码工程化抑制性膜蛋白(imp)复合物的第二多核苷酸装载进入人类t细胞中。首先，评估2个上述多核苷酸编码的肽在转导的t细胞中随时间推移的细胞表面表达谱。为此目的，可以使用抗-cd123scfv/fc融合蛋白。典型地，观察到两种肽在转导后的3天在细胞表面上高度表达，并且在2周期间保持了相对高的表达。然后，评估了两种肽以介导抗原依赖性t细胞活化的能力。为了解决这个问题，使用cd123-阳性细胞系(如kg1或molm13)和cd123-阴性细胞系(rpmi-8226)进行活性测定。如脱颗粒测定、细胞毒性测定和ifnγ分泌测定的结果所示，广泛观察到的是，两种肽在cd123-阳性细胞系的存在下能够激活t细胞，而在cd123-阴性细胞系的存在下不能激活t细胞。

实施例

实施例1.imp(关闭受体)和工程化多链car(mccar)的组装

根据公布的协议[如englerc，kandziar，marillonnets；(2008)″aonepot，onestep，precisioncloningmethodwithhighthroughputcapability″，plosone.3(11)]，使用金门组装策略(goldengateassemblystrategies)进行构建体的组装。因此，关闭开关受体(switch-offreceptor)和工程化的car被克隆在分离的穿梭克隆质粒中。下表5给出了组装的构建体的非穷举性实例；此处呈现的所有系统都被“关闭”。

用于组装imp(关闭开关受体)的模块序列获自seqidno.61-64(细胞外cid结合结构域)或83-98(细胞内cid结合结构域)以及获自具有seqidno.65-76(细胞外cid结合结构域)或99-106(细胞内cid结合结构域)的工程化mccar。图2a和图2b示出了它们的构象。

关闭开关受体和工程化的car(包括mccar的另外的适当链(β和γ或α)被进一步亚克隆在慢病毒生产质粒中，可能在2a顺式作用水解酶元件(gsg-p2a和gsg-t2a核糖体跳过肽)的上游，随后是报道子标记物(例如，荧光蛋白)或膜蛋白(如，rqr8)，它们被2a顺式作用水解酶元件独立地隔开或分隔在一起。应用标准分子生物学技术，如pcr、酶限制消化和连接来创建所有构建。

实施例2.关闭开关受体和工程化mccar在原代t细胞中的慢病毒递送

根据标准方案或由外部承包商生产病毒载体。使用关闭开关受体(switch-offreceptor)和工程化的mccar慢病毒颗粒同时或顺序地转导原代t细胞。使用大量facs分选或磁性分离，纯化出工程化mccar和关闭开关受体的表达呈阳性的转导的t细胞。在不存在小分子(雷帕霉素、雷帕霉素类似物或合成雷帕霉素类似物)的条件下，使用表达工程化car靶抗原的模型细胞系，评价全部批的工程化的mccar/关闭开关受体阳性群体的工程化mccar驱动激活(脱颗粒/细胞毒性)、增殖和细胞因子释放。然后，在存在小分子的条件下再现相同的实验，以评价该系统的抑制性能。

实施例3.关闭开关受体和工程化的sccar(单链car)的组装

用于组装imp(关闭开关受体)的模块序列获自seqidno.61-64(细胞外cid结合结构域)或83-98(细胞内cid结合结构域)和获得自如上表5中所描述的具有seqidno.77-82(细胞外cid结合结构域)或107-112(细胞内cid结合结构域)的工程化sccar。它们的构象示于图4(细胞外cid结合结构域)和图5(细胞内cid结合结构域)。

根据公布的协议，使用金门组装策略(goldenassemblystrategy)进行构建体的组装。因此，关闭开关受体和工程化的car被克隆在分离的穿梭克隆质粒中。关闭开关受体和工程化的sccar进一步被亚克隆在慢病毒生产质粒中，可能在2a顺式作用水解酶元件的上游，随后是报道子标记物(例如荧光蛋白)，它们被2a顺式作用水解酶元件独立地隔开或分隔在一起。应用标准分子生物学技术，如pcr、酶限制消化和连接来创建所有构建。

实施例4.关闭开关受体和工程化的sccars在原代t细胞中的慢病毒递送

根据标准协议生产或由外部承包商生产病毒载体。使用关闭开关受体和工程化的sccar慢病毒颗粒同时或顺次转导原代t细胞。使用大量facs分选或磁性分离，纯化出工程化sccar和关闭开关受体的表达呈阳性的转导的t细胞。在不存在小分子(雷帕霉素、雷帕霉素类似物或合成雷帕霉素类似物)的条件下，使用表达工程化car靶抗原的模型细胞系，评价整体批量工程化的sccar/关闭开关受体阳性群体的工程化sccar驱动激活(脱颗粒/细胞毒性)、增殖和细胞因子释放。然后，在存在小分子的条件下重复相同的实验，以评价该系统的抑制性能。

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<110>塞勒克提斯公司

<120>用于调节car诱导的免疫细胞活性的方法

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leuglyseralavalserleuthrilecysglyalaglyglugluleu

195200205

lysglyasnlysvalproglulysargglyarglyslysleuleutyr

210215220

ilephelysglnprophemetargprovalglnthrthrglngluglu

225230235240

aspglycyssercysargpheproglugluglugluglyglycysglu

245250255

leu

<210>13

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>序列信号γ

<400>13

metalaileproalavalvalleuleuleuleuleuleuvalglugln

151015

alaalaalagly

20

<210>14

<211>114

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>fkbp

<400>14

serglyglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthr

151015

pheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleu

202530

gluaspglylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophe

354045

lysphemetleuglylysglngluvalileargglytrpgluglugly

505560

valalaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileserpro

65707580

asptyralatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohis

859095

alathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglysergly

100105110

alapro

<210>15

<211>102

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>frb

<400>15

serglyglyargvalalaileleutrphisglumettrphisglugly

151015

leugluglualaserargleutyrpheglygluargasnvallysgly

202530

metphegluvalleugluproleuhisalametmetgluargglypro

354045

glnthrleulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleu

505560

metglualaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnval

65707580

lysaspleuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargarg

859095

ileglyserglyalapro

100

<210>16

<211>156

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>γ-ti-a

<400>16

ileglygluproglnleucystyrileleuaspalaileleupheleu

151015

tyrglyilevalleuthrleuleutyrcysargleulysileglnval

202530

arglysalaalailethrsertyrglulysserargvallyspheser

354045

argseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyr

505560

asngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplys

65707580

argargglyargaspproglumetglyglylysproargarglysasn

859095

proglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmetalaglu

100105110

alatyrsergluileglymetlysglygluargargargglylysgly

115120125

hisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyr

130135140

aspalaleuhismetglnalaleuproproargglu

145150155

<210>17

<211>156

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>γ-ti-b

<400>17

leuglygluproglnleucystyrileleuaspalaileleupheleu

151015

tyrglyilevalleuthrleuleutyrcysargleulysileglnval

202530

arglysalaalailethrsertyrglulysserargvallyspheser

354045

argseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyr

505560

asngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplys

65707580

argargglyargaspproglumetglyglylysproargarglysasn

859095

proglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmetalaglu

100105110

alatyrsergluileglymetlysglygluargargargglylysgly

115120125

hisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyr

130135140

aspalaleuhismetglnalaleuproproargglu

145150155

<210>18

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>vh-4g7-ss

<400>18

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargprogly

20

<210>19

<211>25

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd8atm

<400>19

iletyriletrpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleu

151015

serleuvalilethrleutyrcysarg

2025

<210>20

<211>31

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>4-1bbtm

<400>20

ileileserphepheleualaleuthrserthralaleuleupheleu

151015

leuphepheleuthrleuargpheservalvallysargglyarg

202530

<210>21

<211>27

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>dap10tm

<400>21

ileleuleualaglyleuvalalaalaaspalavalalaserleuleu

151015

ilevalglyalavalpheleucysalaargarg

2025

<210>22

<211>33

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd28tm

<400>22

ilephetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrser

151015

leuleuvalthrvalalapheileilephetrpvalargserlysarg

202530

arg

<210>23

<211>97

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>pd1抑制性信号结构域

<400>23

serargalaalaargglythrileglyalaargargthrglyglnpro

151015

leulysgluaspproseralavalprovalpheservalasptyrgly

202530

gluleuasppheglntrpargglulysthrprogluproprovalpro

354045

cysvalprogluglnthrglutyralathrilevalpheprosergly

505560

metglythrserserproalaargargglyseralaaspglyproarg

65707580

seralaglnproleuargprogluaspglyhiscyssertrpproleu

859095

glu

<210>24

<211>110

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>fkbp_pos3_imp

<400>24

serglyglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthr

151015

pheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleu

202530

gluaspglylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophe

354045

lysphemetleuglylysglngluvalileargglytrpgluglugly

505560

valalaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileserpro

65707580

asptyralatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohis

859095

alathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglu

100105110

<210>25

<211>98

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>frb_pos3_imp

<400>25

serglyglyargvalalaileleutrphisglumettrphisglugly

151015

leugluglualaserargleutyrpheglygluargasnvallysgly

202530

metphegluvalleugluproleuhisalametmetgluargglypro

354045

glnthrleulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleu

505560

metglualaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnval

65707580

lysaspleuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargarg

859095

ileglu

<210>26

<211>45

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd28连接子

<400>26

serargleuleuhisserasptyrmetasnmetthrproargargpro

151015

glyprothrarglyshistyrglnprotyralaproproargaspphe

202530

alaalatyrargserglyserglyserglyserglyser

354045

<210>27

<211>48

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>4-1bb连接子

<400>27

glyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemetargpro

151015

valglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargpheproglu

202530

gluglugluglyglycysgluleuglyserglyserglyserglyser

354045

<210>28

<211>50

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>ox40连接子

<400>28

alaleutyrleuleuargargaspglnargleuproproaspalahis

151015

lysproproglyglyglyserpheargthrproileglngluglugln

202530

alaaspalahisserthrleualalysileglyserglyserglyser

354045

glyser

50

<210>29

<211>28

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>dap10连接子

<400>29

proargargserproalaglngluaspglylysvaltyrileasnmet

151015

proglyargglyglyserglyserglyserglyser

2025

<210>30

<211>54

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd18连接子

<400>30

lysalaleuilehisleuseraspleuargglutyrargargpheglu

151015

lysglulysleulysserglntrpasnasnaspasnproleuphelys

202530

seralathrthrthrvalmetasnprolysphealagluserglyser

354045

glyserglyserglyser

50

<210>31

<211>49

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd28连接子

<400>31

argserlysargserargleuleuhisserasptyrmetasnmetthr

151015

proargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyralapro

202530

proargaspphealaalatyrargserglyserglyserglysergly

354045

ser

<210>32

<211>33

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd275连接子

<400>32

argaspargcysleuglnhissertyralaglyalatrpalavalser

151015

progluthrgluleuthrglyhisvalglyserglyserglysergly

202530

ser

<210>33

<211>68

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>hvem连接子

<400>33

cysvallysargarglysproargglyaspvalvallysvalileval

151015

servalglnarglysargglnglualagluglyglualathrvalile

202530

glualaleuglnalaproproaspvalthrthrvalalavalgluglu

354045

thrileproserphethrglyargserproasnhisglyserglyser

505560

glyserglyser

65

<210>34

<211>45

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>light连接子

<400>34

metglugluservalvalargproservalphevalvalaspglygln

151015

thraspileprophethrargleuglyargserhisargargglnser

202530

cysservalalaargglyserglyserglyserglyser

354045

<210>35

<211>30

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd40l连接子

<400>35

metilegluthrtyrasnglnthrserproargseralaalathrgly

151015

leuproilesermetlysglyserglyserglyserglyser

202530

<210>36

<211>66

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>gitr连接子

<400>36

glnleuglyleuhisiletrpglnleuargserglncysmettrppro

151015

arggluthrglnleuleuleugluvalproproserthrgluaspala

202530

argsercysglnpheprogluglugluargglygluargseralaglu

354045

glulysglyargleuglyaspleutrpvalglyserglyserglyser

505560

glyser

65

<210>37

<211>56

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>tim1连接子

<400>37

lyslystyrphephelyslysgluvalglnglnleuservalserphe

151015

serserleuglnilelysalaleuglnasnalavalglulysgluval

202530

glnalagluaspasniletyrilegluasnserleutyralathrasp

354045

glyserglyserglyserglyser

5055

<210>38

<211>85

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>slam连接子

<400>38

glnleuargargargglylysthrasnhistyrglnthrthrvalglu

151015

lyslysserleuthriletyralaglnvalglnlysproglyproleu

202530

glnlyslysleuaspserpheproalaglnaspprocysthrthrile

354045

tyrvalalaalathrgluprovalprogluservalglngluthrasn

505560

serilethrvaltyralaservalthrleuprogluserglysergly

65707580

serglyserglyser

85

<210>39

<211>124

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd2连接子

<400>39

lysarglyslysglnargserargargasnaspglugluleugluthr

151015

argalahisargvalalathrglugluargglyarglysprohisgln

202530

ileproalaserthrproglnasnproalathrserglnhispropro

354045

proproproglyhisargserglnalaproserhisargpropropro

505560

proglyhisargvalglnhisglnproglnlysargproproalapro

65707580

serglythrglnvalhisglnglnlysglyproproleuproargpro

859095

argvalglnprolysproprohisglyalaalagluasnserleuser

100105110

proserserasnglyserglyserglyserglyser

115120

<210>40

<211>40

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>tlt-2连接子

<400>40

lyslysarghismetalasertyrsermetcysseraspproserthr

151015

argaspproproglyargprogluprotyrvalgluvaltyrleuile

202530

glyserglyserglyserglyser

3540

<210>41

<211>62

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>lag3连接子

<400>41

hisleutrpargargglntrpargproargargpheseralaleuglu

151015

glnglyilehisproproglnalaglnserlysileglugluleuglu

202530

glngluprogluprogluprogluprogluprogluprogluproglu

354045

progluprogluglnleuglyserglyserglyserglyser

505560

<210>42

<211>60

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>dap12连接子

<400>42

tyrpheleuglyargleuvalproargglyargglyalaalagluala

151015

alathrarglysglnargilethrgluthrgluserprotyrglnglu

202530

leuglnglyglnargseraspvaltyrseraspleuasnthrglnarg

354045

protyrtyrlysglyserglyserglyserglyser

505560

<210>43

<211>107

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd84连接子

<400>43

argleuphelysargargglnglyargilepheprogluglysercys

151015

leuasnthrphethrlysasnprotyralaalaserlyslysthrile

202530

tyrthrtyrilemetalaserargasnthrglnproalagluserarg

354045

iletyraspgluileleuglnserlysvalleuproserlysgluglu

505560

provalasnthrvaltyrsergluvalglnphealaasplysmetgly

65707580

lysalaserthrglnaspserlysproproglythrsersertyrglu

859095

ilevalileglyserglyserglyserglyser

100105

<210>44

<211>113

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd244连接子

<400>44

glupheleuthriletyrgluaspvallysaspleulysthrargarg

151015

asnhisgluglngluglnthrpheproglyglyglyserthriletyr

202530

sermetileglnserglnserseralaprothrserglngluproala

354045

tyrthrleutyrserleuileglnproserarglysserglyserarg

505560

lysargasnhisserproserpheasnserthriletyrgluvalile

65707580

glylysserglnprolysalaglnasnproalaargleuserarglys

859095

gluleugluasnpheaspvaltyrserglyserglyserglysergly

100105110

ser

<210>45

<211>157

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>cd229连接子

<400>45

leutyrservalleuserglnglytyrglulysleuaspthrproleu

151015

argproalaargglnglnprothrprothrseraspserserserasp

202530

serasnleuthrthrglugluaspgluaspargprogluvalhislys

354045

proileserglyargtyrgluvalpheaspglnvalthrglnglugly

505560

alaglyhisaspproalaprogluglyglnalaasptyraspproval

65707580

thrprotyrvalthrgluvalgluservalvalglygluasnthrmet

859095

tyralaglnvalpheasnleuglnglylysthrprovalserglnlys

100105110

glugluserseralathriletyrcysserilearglysproglnval

115120125

valproproproglnglnasnaspleugluileprogluserprothr

130135140

tyrgluasnphethrglyserglyserglyserglyser

145150155

<210>46

<211>151

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>ltbr连接子

<400>46

lysalahisprotyrpheproaspleuvalglnproleuleuproile

151015

serglyaspvalserprovalserthrglyleuproalaalaproval

202530

leuglualaglyvalproglnglnglnserproleuaspleuthrarg

354045

gluproglnleugluproglygluglnserglnvalalahisglythr

505560

asnglyilehisvalthrglyglysermetthrilethrglyasnile

65707580

tyriletyrasnglyprovalleuglyglyproproglyproglyasp

859095

leuproalathrprogluproprotyrproileproglugluglyasp

100105110

proglyproproglyleuserthrprohisglngluaspglylysala

115120125

trphisleualagluthrgluhiscysglyalathrproserasngly

130135140

serglyserglyserglyser

145150

<210>47

<211>110

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>fkbp_pos5-ter-α

<400>47

serglyglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthr

151015

pheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleu

202530

gluaspglylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophe

354045

lysphemetleuglylysglngluvalileargglytrpgluglugly

505560

valalaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileserpro

65707580

asptyralatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohis

859095

alathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglu

100105110

<210>48

<211>98

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>frb_pos5-ter-α

<400>48

serglyglyargvalalaileleutrphisglumettrphisglugly

151015

leugluglualaserargleutyrpheglygluargasnvallysgly

202530

metphegluvalleugluproleuhisalametmetgluargglypro

354045

glnthrleulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleu

505560

metglualaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnval

65707580

lysaspleuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargarg

859095

ileglu

<210>49

<211>173

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>γ-cd3z链

<400>49

metileproalavalvalleuleuleuleuleuleuvalgluglnala

151015

alaalaleuglygluproglnleucystyrileleuaspalaileleu

202530

pheleutyrglyilevalleuthrleuleutyrcysargleulysile

354045

glnvalarglysalaalailethrsertyrglulysserargvallys

505560

pheserargseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasngln

65707580

leutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleu

859095

asplysargargglyargaspproglumetglyglylysproargarg

100105110

lysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmet

115120125

alaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarggly

130135140

lysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysasp

145150155160

thrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg

165170

<210>50

<211>101

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>pd1_pos3

<400>50

serargalaalaargglythrileglyalaargargthrglyglnpro

151015

leulysgluaspproseralavalprovalpheservalasptyrgly

202530

gluleuasppheglntrpargglulysthrprogluproprovalpro

354045

cysvalprogluglnthrglutyralathrilevalpheprosergly

505560

metglythrserserproalaargargglyseralaaspglyproarg

65707580

seralaglnproleuargprogluaspglyhiscyssertrpproleu

859095

glyserglyserser

100

<210>51

<211>114

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>fkbp_pos4-imp

<400>51

serglyglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthr

151015

pheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleu

202530

gluaspglylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophe

354045

lysphemetleuglylysglngluvalileargglytrpgluglugly

505560

valalaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileserpro

65707580

asptyralatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohis

859095

alathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglysergly

100105110

sergly

<210>52

<211>102

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>frb_pos4-imp

<400>52

serglyglyargvalalaileleutrphisglumettrphisglugly

151015

leugluglualaserargleutyrpheglygluargasnvallysgly

202530

metphegluvalleugluproleuhisalametmetgluargglypro

354045

glnthrleulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleu

505560

metglualaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnval

65707580

lysaspleuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargarg

859095

ileglyserglysergly

100

<210>53

<211>97

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>pd1_pos5-ter

<400>53

serargalaalaargglythrileglyalaargargthrglyglnpro

151015

leulysgluaspproseralavalprovalpheservalasptyrgly

202530

gluleuasppheglntrpargglulysthrprogluproprovalpro

354045

cysvalprogluglnthrglutyralathrilevalpheprosergly

505560

metglythrserserproalaargargglyseralaaspglyproarg

65707580

seralaglnproleuargprogluaspglyhiscyssertrpproleu

859095

glu

<210>54

<211>110

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>fkbp_pos4-ter-imp

<400>54

serglyglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthr

151015

pheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleu

202530

gluaspglylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophe

354045

lysphemetleuglylysglngluvalileargglytrpgluglugly

505560

valalaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileserpro

65707580

asptyralatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohis

859095

alathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglu

100105110

<210>55

<211>98

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>frb_pos4-ter-imp

<400>55

serglyglyargvalalaileleutrphisglumettrphisglugly

151015

leugluglualaserargleutyrpheglygluargasnvallysgly

202530

metphegluvalleugluproleuhisalametmetgluargglypro

354045

glnthrleulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleu

505560

metglualaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnval

65707580

lysaspleuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargarg

859095

ileglu

<210>56

<211>101

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>pd1_pos4

<400>56

serargalaalaargglythrileglyalaargargthrglyglnpro

151015

leulysgluaspproseralavalprovalpheservalasptyrgly

202530

gluleuasppheglntrpargglulysthrprogluproprovalpro

354045

cysvalprogluglnthrglutyralathrilevalpheprosergly

505560

metglythrserserproalaargargglyseralaaspglyproarg

65707580

seralaglnproleuargprogluaspglyhiscyssertrpproleu

859095

glyserglysergly

100

<210>57

<211>108

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>fkbp_pos5-ter-imp

<400>57

glyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthrphepro

151015

lysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleugluasp

202530

glylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophelysphe

354045

metleuglylysglngluvalileargglytrpglugluglyvalala

505560

glnmetservalglyglnargalalysleuthrileserproasptyr

65707580

alatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohisalathr

859095

leuvalpheaspvalgluleuleulysleugluglu

100105

<210>58

<211>96

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>frb_pos5-ter-imp

<400>58

glyargvalalaileleutrphisglumettrphisgluglyleuglu

151015

glualaserargleutyrpheglygluargasnvallysglymetphe

202530

gluvalleugluproleuhisalametmetgluargglyproglnthr

354045

leulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleumetglu

505560

alaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnvallysasp

65707580

leuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargargileglu

859095

<210>59

<211>344

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>ir-10ra抑制性结构域

<400>59

ilevalileilephephealaphevalleuleuleuserglyalaleu

151015

alatyrcysleualaleuglnleutyrvalargargarglyslysleu

202530

proservalleuleuphelyslysproserpropheilepheileser

354045

glnargproserprogluthrglnaspthrilehisproleuaspglu

505560

glualapheleulysvalserprogluleulysasnleuaspleuhis

65707580

glyserthraspserglypheglyserthrlysproserleuglnthr

859095

glugluproglnpheleuleuproaspprohisproglnalaasparg

100105110

thrleuglyasnarggluproprovalleuglyaspsercysserser

115120125

glyserserasnserthraspserglyilecysleuglngluproser

130135140

leuserproserthrglyprothrtrpgluglnglnvalglyserasn

145150155160

serargglyglnaspaspserglyileaspleuvalglnasnserglu

165170175

glyargalaglyaspthrglnglyglyseralaleuglyhishisser

180185190

proprogluprogluvalproglyglugluaspproalaalavalala

195200205

pheglnglytyrleuargglnthrargcysalagluglulysalathr

210215220

lysthrglycysleugluglugluserproleuthraspglyleugly

225230235240

prolyspheglyargcysleuvalaspglualaglyleuhispropro

245250255

alaleualalysglytyrleulysglnaspproleuglumetthrleu

260265270

alaserserglyalaprothrglyglntrpasnglnprothrgluglu

275280285

trpserleuleualaleusersercysseraspleuglyileserasp

290295300

trpserphealahisaspleualaproleuglycysvalalaalapro

305310315320

glyglyleuleuglyserpheasnseraspleuvalthrleuproleu

325330335

ileserserleuglnserserglu

340

<210>60

<211>107

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>ir-10b抑制性结构域

<400>60

iletrpmetvalalavalileleumetalaservalphemetvalcys

151015

leualaleuleuglycysphealaleuleutrpcysvaltyrlyslys

202530

thrlystyralapheserproargasnserleuproglnhisleulys

354045

glupheleuglyhisprohishisasnthrleuleuphepheserphe

505560

proleuseraspgluasnaspvalpheasplysleuservalileala

65707580

gluaspsergluserglylysglnasnproglyaspsercysserleu

859095

glythrproproglyglnglyproglnserglu

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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151015

hisalaalaargproglyserglyglyvalglnvalgluthrileser

202530

proglyaspglyargthrpheprolysargglyglnthrcysvalval

354045

histyrthrglymetleugluaspglylyslyspheaspserserarg

505560

aspargasnlysprophelysphemetleuglylysglngluvalile

65707580

argglytrpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargala

859095

lysleuthrileserproasptyralatyrglyalathrglyhispro

100105110

glyileileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleu

115120125

lysleugluglyserglyalaprothrthrthrproalaproargpro

130135140

prothrproalaprothrilealaserglnproleuserleuargpro

145150155160

glualacysargproalaalaglyglyalavalhisthrargglyleu

165170175

aspphealacysaspiletyriletrpalaproleualaglythrcys

180185190

glyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrcysargserarg

195200205

alaalaargglythrileglyalaargargthrglyglnproleulys

210215220

gluaspproseralavalprovalpheservalasptyrglygluleu

225230235240

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245250255

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thrserserproalaargargglyseralaaspglyproargserala

275280285

glnproleuargprogluaspglyhiscyssertrpproleuglu

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<211>485

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>imp-excid-n?

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metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproglyserglyglyargvalalaileleutrphis

202530

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354045

gluargasnvallysglymetphegluvalleugluproleuhisala

505560

metmetgluargglyproglnthrleulysgluthrserpheasngln

65707580

alatyrglyargaspleumetglualaglnglutrpcysarglystyr

859095

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100105110

tyrhisvalpheargargileglyserglyalaprogluprolysser

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proasplysthrhisthrcysproprocysproalaproprovalala

130135140

glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet

145150155160

ilealaargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhis

165170175

gluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluval

180185190

hisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyr

195200205

argvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasngly

210215220

lysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproile

225230235240

glulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnval

245250255

tyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalser

260265270

leuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglu

275280285

trpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro

290295300

valleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrval

305310315320

asplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmet

325330335

hisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuser

340345350

proglylyslysaspileileserphepheleualaleuthrserthr

355360365

alaleuleupheleuleuphepheleuthrleuargpheservalval

370375380

lysargglyargserargalaalaargglythrileglyalaargarg

385390395400

thrglyglnproleulysgluaspproseralavalprovalpheser

405410415

valasptyrglygluleuasppheglntrpargglulysthrproglu

420425430

proprovalprocysvalprogluglnthrglutyralathrileval

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pheproserglymetglythrserserproalaargargglyserala

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aspglyproargseralaglnproleuargprogluaspglyhiscys

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sertrpproleuglu

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<212>prt

<213>人工序列

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metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

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hisalaalaargproglyserglyglyvalglnvalgluthrileser

202530

proglyaspglyargthrpheprolysargglyglnthrcysvalval

354045

histyrthrglymetleugluaspglylyslyspheaspserserarg

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aspargasnlysprophelysphemetleuglylysglngluvalile

65707580

argglytrpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargala

859095

lysleuthrileserproasptyralatyrglyalathrglyhispro

100105110

glyileileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleu

115120125

lysleugluglyserglyalaproalaprovalglyleuvalalaarg

130135140

leualaaspgluserglyhisvalvalleuargtrpleupropropro

145150155160

gluthrprometthrserhisileargtyrgluvalaspvalserala

165170175

glyasnglyalaglyservalglnargvalgluileleugluglyarg

180185190

thrglucysvalleuserasnleuargglyargthrargtyrthrphe

195200205

alavalargalaargmetalagluproserpheglyglyphetrpser

210215220

alatrpsergluprovalserleuleuthrproseraspileleuleu

225230235240

alaglyleuvalalaalaaspalavalalaserleuleuilevalgly

245250255

alavalpheleucysalaargargserargalaalaargglythrile

260265270

glyalaargargthrglyglnproleulysgluaspproseralaval

275280285

provalpheservalasptyrglygluleuasppheglntrpargglu

290295300

lysthrprogluproprovalprocysvalprogluglnthrglutyr

305310315320

alathrilevalpheproserglymetglythrserserproalaarg

325330335

argglyseralaaspglyproargseralaglnproleuargproglu

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metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproglyserglyglyargvalalaileleutrphis

202530

glumettrphisgluglyleugluglualaserargleutyrphegly

354045

gluargasnvallysglymetphegluvalleugluproleuhisala

505560

metmetgluargglyproglnthrleulysgluthrserpheasngln

65707580

alatyrglyargaspleumetglualaglnglutrpcysarglystyr

859095

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100105110

tyrhisvalpheargargileglyserglyalaprothrthrthrpro

115120125

alaproargproprothrproalaprothrilealaserglnproleu

130135140

serleuargproglualacysargproalaalaglyglyalavalhis

145150155160

thrargglyleuaspphealacysaspilephetrpvalleuvalval

165170175

valglyglyvalleualacystyrserleuleuvalthrvalalaphe

180185190

ileilephetrpvalargserlysargargserargalaalaarggly

195200205

thrileglyalaargargthrglyglnproleulysgluaspproser

210215220

alavalprovalpheservalasptyrglygluleuasppheglntrp

225230235240

argglulysthrprogluproprovalprocysvalprogluglnthr

245250255

glutyralathrilevalpheproserglymetglythrserserpro

260265270

alaargargglyseralaaspglyproargseralaglnproleuarg

275280285

progluaspglyhiscyssertrpproleuglu

290295

<210>65

<211>335

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>&#947;-mccar-excid-n?

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metalaileproalavalvalleuleuleuleuleuleuvalglugln

151015

alaalaalaglyserglyglyvalglnvalgluthrileserprogly

202530

aspglyargthrpheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyr

354045

thrglymetleugluaspglylyslyspheaspserserargasparg

505560

asnlysprophelysphemetleuglylysglngluvalilearggly

65707580

trpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargalalysleu

859095

thrileserproasptyralatyrglyalathrglyhisproglyile

100105110

ileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleu

115120125

gluglyserglyalaprothrthrthrproalaproargproprothr

130135140

proalaprothrilealaserglnproleuserleuargprogluala

145150155160

cysargproalaalaglyglyalavalhisthrargglyleuaspphe

165170175

alacysaspileglygluproglnleucystyrileleuaspalaile

180185190

leupheleutyrglyilevalleuthrleuleutyrcysargleulys

195200205

ileglnvalarglysalaalailethrsertyrglulysserargval

210215220

lyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasn

225230235240

glnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspval

245250255

leuasplysargargglyargaspproglumetglyglylysproarg

260265270

arglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplys

275280285

metalaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarg

290295300

glylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlys

305310315320

aspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproargglu

325330335

<210>66

<211>511

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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metalaileproalavalvalleuleuleuleuleuleuvalglugln

151015

alaalaalaglyserglyglyargvalalaileleutrphisglumet

202530

trphisgluglyleugluglualaserargleutyrpheglygluarg

354045

asnvallysglymetphegluvalleugluproleuhisalametmet

505560

gluargglyproglnthrleulysgluthrserpheasnglnalatyr

65707580

glyargaspleumetglualaglnglutrpcysarglystyrmetlys

859095

serglyasnvallysaspleuthrglnalatrpaspleutyrtyrhis

100105110

valpheargargileglyserglyalaprogluprolysserproasp

115120125

lysthrhisthrcysproprocysproalaproprovalalaglypro

130135140

servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileala

145150155160

argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasp

165170175

progluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn

180185190

alalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargval

195200205

valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu

210215220

tyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulys

225230235240

thrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthr

245250255

leuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthr

260265270

cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu

275280285

serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu

290295300

aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys

305310315320

serargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglu

325330335

alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserprogly

340345350

lyslysaspileglygluproglnleucystyrileleuaspalaile

355360365

leupheleutyrglyilevalleuthrleuleutyrcysargleulys

370375380

ileglnvalarglysalaalailethrsertyrglulysserargval

385390395400

lyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasn

405410415

glnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspval

420425430

leuasplysargargglyargaspproglumetglyglylysproarg

435440445

arglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplys

450455460

metalaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarg

465470475480

glylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlys

485490495

aspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproargglu

500505510

<210>67

<211>391

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>67

metalaileproalavalvalleuleuleuleuleuleuvalglugln

151015

alaalaalaglyserglyglyvalglnvalgluthrileserprogly

202530

aspglyargthrpheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyr

354045

thrglymetleugluaspglylyslyspheaspserserargasparg

505560

asnlysprophelysphemetleuglylysglngluvalilearggly

65707580

trpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargalalysleu

859095

thrileserproasptyralatyrglyalathrglyhisproglyile

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340345350

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thrserhisileargtyrgluvalaspvalseralaglyasnglyala

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580585590

proglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmetalaglu

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glyglnproleulysgluaspproseralavalprovalpheserval

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asptyrglygluleuasppheglntrpargglulysthrproglupro

210215220

provalprocysvalprogluglnthrglutyralathrilevalphe

225230235240

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aspargasnlysprophelysphemetleuglylysglngluvalile

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argglytrpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargala

210215220

lysleuthrileserproasptyralatyrglyalathrglyhispro

225230235240

glyileileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleu

245250255

lysleugluglu

260

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<213>人工序列

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argserargalaalaargglythrileglyalaargargthrglygln

505560

proleulysgluaspproseralavalprovalpheservalasptyr

65707580

glygluleuasppheglntrpargglulysthrprogluproproval

859095

procysvalprogluglnthrglutyralathrilevalpheproser

100105110

glymetglythrserserproalaargargglyseralaaspglypro

115120125

argseralaglnproleuargprogluaspglyhiscyssertrppro

130135140

leuglyserglyserserserglyglyargvalalaileleutrphis

145150155160

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165170175

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130135140

glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspile

145150155160

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165170175

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210215220

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225230235240

glualaaspaspvalalathrtyrtyrcysglnglnserasngluasp

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proprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleuglu

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glu

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glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspile

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prothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothrile

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ileserthrglnglnglnvalthrpheleuleulysilelysargthr

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glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspile

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prothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothrile

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290295300

glyglyalavalhisthrargglyleuaspphealacysaspphephe

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ileproleuleuvalvalileleuphealavalaspthrglyleuphe

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ileserthrglnglnglnvalthrpheleuleulysilelysargthr

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arglysglypheargleuleuasnprohisprolysproasnprolys

355360365

asnasnargalaleutyrleuleuargargaspglnargleupropro

370375380

aspalahislysproproglyglyglyserpheargthrproilegln

385390395400

glugluglnalaaspalahisserthrleualalysileglysergly

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serglyserglyserserglyglyvalglnvalgluthrileserpro

420425430

glyaspglyargthrpheprolysargglyglnthrcysvalvalhis

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glytrpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargalalys

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ileileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleulys

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65707580

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100105110

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115120125

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glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspile

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165170175

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ileproleuleuvalvalileleuphealavalaspthrglyleuphe

325330335

ileserthrglnglnglnvalthrpheleuleulysilelysargthr

340345350

arglysglypheargleuleuasnprohisprolysproasnprolys

355360365

asnasnargproargargserproalaglngluaspglylysvaltyr

370375380

ileasnmetproglyargglyglyserglyserglyserglyserser

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prolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleuglu

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