专利名称：植物启动子和植物终止子的制作方法
技术领域：
本发明涉及本发明涉及植物启动子、植物终止子等。
2．相关技术描述多次尝试通过将基因导入植物并使之表达，从而产生提供有用特性的各种转基因植物，而且这些转基因植物中的一些早已成为商业行为。为了产生这些转基因植物，重要的是使导入植物细胞的基因有效表达。启动子是决定基因转录水平的主要因素，所以将感兴趣的基因置于具有高转录活性的启动子的控制下，一般可能增强该基因的表达。而且，由于终止子除了给出终止转录的指令之外，还对转录产生的RNA的加工和降解有重要作用，所在以紧随感兴趣基因翻译区的3’末端之后插入终止子常常可以有效增加该基因的表达。
然而，通过导入感兴趣基因可以在植物育种中使用的植物启动子和植物终止子至今仍远远不足，因此，强烈要求开发能够在植物中有效表达感兴趣基因的新的启动子和终止子。
发明概述在这样的环境下，本发明人集中精力于研究能够在植物细胞中发挥功能的启动子和终止子，并由此发现，通过使用具有特殊核苷酸序列的DNA，可以使感兴趣基因在植物的叶、根、茎等组织中有效表达。本发明在此发现的基础上完成。
由此，本发明提供下列各项1．包含下面的DNA(a)或(b)、特征为能够在植物细胞中发挥功能的启动子(a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA，或(b)包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入，并且与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中由250个或更多碱基组成的任何区域同一性超过90％的核苷酸序列的DNA，该DNA的生物学功能与上述DNA(a)等效。2．包含下面的DNA(a)或(b)、特征为能够在植物细胞中发挥功能的终止子(a)包含SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA，或(b)包含在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入，并且与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中由250个或更多碱基组成的任何区域同一性超过90％的核苷酸序列的DNA，该DNA的生物学功能与上述DNA(a)等效。3．特征为包含以能够发挥功能的形式彼此连接的上述1的启动子和目的基因的嵌合基因。4．特征为包含以能够发挥功能的形式彼此连接的上述1的启动子、目的基因、和上述2的终止子的嵌合基因。5．特征为包含上述1的启动子的载体。6．特征为包含上述1的启动子和目的基因的载体。7．特征为包含上述1的启动子、目的基因、和上述2的终止子的载体。8．产生转化体的方法，其特征为包含将上述1的启动子、上述3或4的嵌合基因、和上述5、6、或7的载体中的任何一种导入宿主细胞的步骤。9．特征为携带已导入宿主细胞中的上述1的启动子、上述3或4的嵌合基因、和上述5、6、或7的载体中的任何一项的转化体。10．特征为宿主细胞是微生物细胞或植物细胞的上述9的转化体。11．表达基因的方法，其特征为包含将上述1的启动子和位于该启动子下游的目的基因导入宿主细胞的步骤，和在宿主细胞中在所述启动子的控制下表达该目的基因的步骤。12．表达基因的方法，其特征为包含将上述2的终止子和位于该终止子上游的目的基因导入宿主细胞的步骤，和在宿主细胞中在所述终止子的控制下表达该目的基因的步骤。
根据下文的详述，本发明应用性的其它方面将是显而易见的。然而，应当这样理解，详述和特殊实施例只是以例示性方式说明了本发明的优选实施方案，因为根据此详述，本发明范围内的各种改变和修饰对本领域技术人员将是显而易见的。
贯穿此说明书及其后权利要求，除非有其它要求，“包含”一词应当理解为意指包括所述整体或步骤、或者整体或步骤的集合，而非排除任何其它整体或步骤、或者整体或步骤的集合。
附图的简要说明
图1显示了包含本发明启动子的质粒pCR16G6P的限制酶图谱。“启动子”指本发明的启动子。同样的，“Amp”表示氨苄青霉素抗性基因；“lacI”表示乳糖操纵子的阻遏蛋白基因；“lacZ”表示β-半乳糖苷酶基因；而“ORI”表示复制起点。
图2显示了包含本发明终止子的质粒pCR16G6T的限制酶图谱。“终止子”指本发明的终止子。同样的，“Amp”表示氨苄青霉素抗性基因；“lacI”表示乳糖操纵子的阻遏蛋白基因；“lacZ”表示β-半乳糖苷酶基因；而“ORI”表示复制起点。
图3显示了插入了本发明启动子的表达载体pBICR16G6P的限制酶图谱和构建过程。“G6-p”指本发明的启动子。“nos-p”指胭脂碱合酶基因的启动子；“nos-t”指胭脂碱合酶基因的终止子；而“35S-p”指花椰菜花叶病毒的35S启动子。同样的，“NPTⅡ”表示卡那霉素抗性基因；“GUS”表示β-葡糖醛酸糖苷酶基因；而“HPT”表示潮霉素抗性基因。
图4显示了插入了本发明启动子和终止子的表达载体pBICR16G6PTΔG的限制酶图谱和构建过程。“G6-p”指本发明的启动子，而“G6-t”指本发明的终止子。“G6-t’”指由“G6-t”缺失HindⅢ切割位点后衍生得到的终止子。“RB”和“LB”分别指位于二元载体上的右边界序列和左边界序列。“GUS”表示β-葡糖醛酸糖苷酶基因。
发明详述本发明由下文更详细的描述。
本发明中使用的基因工程技术可以根据常用步骤进行，例如J.Sambrook、E.F.Frisch和T.Maniatis在《分子克隆(MolecularCloning)》第2版(冷泉港实验室出版社，1989)和D.M.Glover在《DNA克隆(DNA Cloning)》(IRL出版社，1985)中描述的。
在本发明中，术语“启动子”指具有起始位于该DNA下游的感兴趣基因转录的功能的DNA。
本发明的启动子包括下列DNA(a)或(b)(下文称为本发明启动子DNA)(a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA，或(b)包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入，并且与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中由250个或更多碱基组成的任何区域同一性超过90％的核苷酸序列的DNA，该DNA的生物学功能与上述DNA(a)等效。
在本文中，“其中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入的核苷酸序列”的范例可以包括那些包含天然发生的变异(因生物体间的物种或个体差异或者制备DNA的组织间的差异引起)或人工导入DNA的变异的核苷酸序列。“生物学功能与上述DNA(a)等效”的DNA可以是，例如那些包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入的核苷酸序列的DNA(条件是它们保留了在植物细胞中的启动子功能)，和与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:7所示核苷酸序列中由250个或更多碱基组成的任何区域同一性超过90％的DNA。这些DNA可以是那些由天然来源克隆的DNA，或在由天然来源克隆的DNA中包含人工导入的缺失、取代、或加入碱基的DNA，或通过化学合成而人工产生的DNA。
而且通过将本发明启动子和目的基因(位于该启动子的下游)导入宿主细胞的步骤，和在宿主细胞中在该启动子的控制下表达该目的基因的步骤，有可能增加目的基因的表达效率。
该启动子DNA可以由例如胡萝卜(诸如Daucus carota)的基因组DNA通过PCR方法进行分离。
具体而言，由胡萝卜(诸如Daucus carota)叶片收集组织，将得到的组织在液氮中冻结，随后用研钵等物理研磨成细粉状组织碎片。由组织碎片通过常用方法提取基因组DNA，例如通过M.Shure等人(细胞(Cell)35:225,1983)描述的CTAB方法或S.O.Rogers和A.J.Bendich(植物分子细胞学(Plant Mol.BIol.)5:69,1985)描述的尿素-酚方法。例如，可以以得到的基因组DNA作为模板，以具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7中第1位至第20位碱基表示的核苷酸序列的寡核苷酸，和具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7中第2029位至第2052位碱基表示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，进行一轮至多轮PCR(反应条件例如一轮至多轮PCR的每一轮进行30-40个循环94℃1min；55℃2min；74℃3min)，以扩增包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA，或包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入的核苷酸序列的DNA。作为这种引物使用的寡核苷酸可以根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列正确设计，而且可以任选的在它们的5’末端包含额外的核苷酸序列(诸如限制酶识别核苷酸序列)。
可以根据《分子克隆实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》(第2版，1989，冷泉港实验室出版社)或《分子生物学现行方案(Current Protocols In Molecular Biology)》(1987,John,Wiley&Sons,Inc.,ISBNO-471-50338-X)中描述的常用方法,将如上所述扩增的DNA克隆到载体中。具体而言，可以使用诸如TA克隆试剂盒(TA Cloning Kit,Invirogen公司)中的质粒载体或pBluescriptⅡ(STRATAGENE)等质粒载体进行克隆。可以通过《分子克隆实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》(第2版，1989，冷泉港实验室出版社，13.42-13.74)中描述的染料双脱氧终止方法，分析克隆的DNA的核苷酸序列。为了制备用于核苷酸序列分析的样品，可以任选的使用诸如ABI PRISM染料终止物循环测序简便反应试剂盒(ABI PRISM Dye Terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit,PE Biosystems)等商品化的试剂。
将报导基因(例如β-葡糖醛酸糖苷酶基因)连接在如上所述得到DNA的下游，按需要克隆到载体中，然后使用诸如下文描述的基因枪法或土壤杆菌感染法等方法导入培养的植物细胞(诸如烟草培养细胞BY-2)。为了得到该启动子DNA，由培养细胞制备细胞提取物，并通过酶学技术测量提取物的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，以该活性值作为指示剂，或者通过将培养细胞在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的染色液中浸泡并观察蓝色染料的附着，以染料附着程度作为指示剂，从而确认上述DNA的启动子功能的存在与否。或者，可以相似的将与报导基因连接的上述DNA导入植物细胞(诸如来自烟草野生型株系的细胞)，并可以由此细胞再生植株。为了得到该启动子DNA，可以通过测量来自植株或其后代的组织中的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，或者通过将来自植株或其后代的组织或其部分在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的染色液中浸泡并观察蓝色染料的附着，以染料附着程度作为指示剂，从而确认上述DNA的启动子功能的存在与否。除了β-葡糖醛酸糖苷酶，其它基因，诸如虫萤光素酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、和绿色荧光蛋白基因，也可以作为报导基因使用。
而且，该启动子DNA还可以如下获得标记例如至少包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:7所示部分核苷酸序列的DNA，并以此作为探针与得自植物等的DNA进行杂交，以检测并克隆探针特异结合的DNA。
在此方法中，可以将例如得自诸如胡萝卜等植物的基因组DNA文库作为与上述探针进行杂交的DNA。关于这种DNA文库，可以使用商品化的基因组DNA文库，或者可以根据如《分子克隆实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第2版，1989，冷泉港实验室出版社)或《分子生物学现行方案(Current Protocols InMolecular Biology)》(1987,John Wiley and Sons,Inc.,ISBNO-471-50338-X)中描述的用于文库制备的常用方法，例如使用λ载体(诸如λFIXⅡ、λEMBL3、λEMBL4、或λDASHⅡ(STRATAGENE)和用于体外包装的Gigapack包装提取物(Gigapack PackagingExtracts,STRATAGENE)，制备供使用的基因组DNA文库。
使探针与这些DNA杂交的方法可以包括菌落杂交和噬菌斑杂交，而正确的方法可以根据文库制备中使用的载体类型进行选择。在使用质粒载体构建文库的情况中，进行菌落杂交。具体而言，首先将文库中的DNA导入宿主生物体以获得转化体，将得到的转化体稀释，在琼脂培养基上铺板，并于37℃培养至出现菌落。另一方面，在使用噬菌体载体构建文库的情况中，进行噬菌斑杂交。具体而言，首先将宿主生物体和文库中的噬菌体在感染条件下混匀，然后进一步与软琼脂培养基混匀，并在琼脂培养基上铺板，于37℃培养至出现噬菌斑。更具体的说，例如根据《分子克隆实验室手册》(第2版，1989，冷泉港实验室出版社，2.60-2.65)中描述的方法，将大约9.0×105pfu噬菌体文库在NZY琼脂培养基中以0.1-1.0pfu/mm2琼脂培养基的密度铺开，并于37℃培养6-10小时。
在上述两种杂交方法中，将膜铺在上述培养物生长的琼脂培养基表面，并将携带质粒或噬菌体的转化体转移到膜上。用碱处理后，中和膜，并进一步处理将DNA固定在膜上。更具体的说，例如在噬菌斑杂交的情况中，根据，《克隆和测序植物生物技术实验手册(Cloningand Sequencing:Plant Biotechnology Experimental Manual)》(Watanabe和Sugiura编，Noson-bunka-sha,1989)中描述的常用方法，将诸如硝酸纤维素或尼龙膜(如Hybond-N+,Amersham PharmaciaBiotech公司)等膜铺在上述琼脂培养基上，并放置大约1分钟，使噬菌体颗粒吸附到膜上。然后，将膜在碱液(1.5M NaCl、0.5N NaOH)中浸泡大约3分钟以裂解噬菌体颗粒并由此将噬菌体DNA释放到膜上，然后将膜在中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl缓冲液，pH7.5)中浸泡大约5分钟。用清洗液(300mM NaCl、30mM柠檬酸钠、200mMTris-HCl缓冲液)清洗大约5分钟后，将膜于大约80℃烘烤大约90分钟，以将噬菌体DNA固定在膜上。
将制备的膜与作为探针的上述DNA进行杂交。可以如D.M.Glover编的《DNA克隆，一种实用的方法(DNA cloning,a practicalapproach)》(IRL出版社，1985,ISBN 0-947946-18-7)；《克隆和测序植物生物技术实验手册》(Watanabe和Sugiura编，Noson-bunka-sha,1989)；或《分子克隆实验室手册》(第2版,J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，1989)所述进行杂交。
为了用放射性同位素标记作为探针使用的DNA，可以使用例如随机标记试剂盒(Random Labeling Kit,Boehringer Mannheim或TakaraShuzo有限公司)，或者也可能以用作探针的DNA作为模板，用[α-32P]dCTP取代dCTP，通过PCR标记DNA。或者，为了用荧光染料标记作为探针使用的DNA，可以使用例如ECL直接核酸标记和检测系统(ECLDirect Nucleic Acid Labeling and Detection System,AmershamPharmacia Biotech公司)。
可以获得多种用于进行杂交的试剂和温度条件。例如，可以每cm2如上制备的膜配制50-200μl体积的含450-900mM NaCl、45-90mM柠檬酸钠、0.1-1.0％十二烷基磺酸钠(SDS)、和0-200μg/ml变性的非特异的DNA(在某些情况中，可以任选的含0-0.2％清蛋白、Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮等)的预杂交溶液，优选含900mM NaCl、90mM柠檬酸钠、1％SDS、和100μg/ml变性的小牛胸腺DNA的预杂交溶液，将上述膜浸泡在溶液中并于42-68℃温育1-4小时，优选于45℃2小时。然后，将例如含450-900mM NaCl、45-90mM柠檬酸钠、0.1-1.0％SDS、和0-200μg/ml变性的非特异的DNA(在某些情况中，可以任选的含0-0.2％清蛋白、Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮等)的杂交溶液等，优选含900mM NaCl、90mM柠檬酸钠、1％SDS、和100μg/ml变性的小牛胸腺DNA的杂交溶液，与通过上述方法得到的探针(相当于1.0×104-2.0×106cpm/cm2膜的量)混和，以制备50-200μl/cm2膜的体积的混和液，将膜浸泡在混和液中并于42-68℃温育4-20小时，优选于45℃16小时，以实现杂交。杂交反应后，回收膜，并用例如含15-300mM NaCl、1.5-30mM柠檬酸钠、0.1-1.0％SDS的清洗液等于42-68℃，优选用含300mM NaCl、30mM柠檬酸钠、1％SDS的清洗液于55℃，清洗1-4次(每次各10-60分钟)，优选2次(每次各15分钟)。而且，将膜用2xSSC溶液(300mM NaCl、30mM柠檬酸钠)简单漂洗，然后干燥。通过例如放射自显影，确定膜上探针的位置，以检测膜上与所用探针杂交的DNA的位置。鉴定最初的琼脂培养基上与膜上检测到的DNA位置对应的克隆，可以挑取用于分离携带那些DNA的克隆。具体而言，将膜暴露于成像板(Fuji Photo Film有限公司)4小时，并使用BAS 2000(Fuji Photo Film有限公司)分析此成像板以检测信号。由用于制备膜的琼脂培养基，切下检测到信号的相应位置的部分(大约5mm2的胶块)，将这些胶块在大约500μl SM缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液pH7.5、0.1M NaCl、7mM MgSO4、0.01％明胶)中浸泡2-16小时，优选3小时，以洗脱噬菌体颗粒。根据《分子克隆实验室手册》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，1989,2.60-2.65)中描述的方法，将得到的噬菌体颗粒洗脱液在琼脂培养基上铺开，并于37℃培养6-10小时。使用此琼脂培养基，以上述相同方式将噬菌体DNA固定到膜上，并将此膜与上述探针进行杂交。由检测到的信号在用于制备膜的琼脂培养基上相应位置的胶块，洗脱噬菌体颗粒，在琼脂培养基上铺开，并以上述相同方式制备膜，以进行杂交。重复这些鉴定和纯化步骤，以得到携带具有可与所有探针杂交的核苷酸序列的DNA的噬菌体克隆。
可以将通过上述杂交筛选得到的克隆所含DNA亚克隆到可以容易制备或分析DNA的质粒载体中，诸如商品化的pUC18、pUC19、pBluescript KS+、或pBluescript KS-，以制备质粒DNA，而且可以使用例如《分子克隆实验室手册》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，1989,13.42-13.74)中描述的染料双脱氧终止法测定其核苷酸序列。可以根据例如《分子克隆实验室手册》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis,冷泉港实验室出版社，1989,13.15)中描述的引物延伸法制备用于核苷酸序列分析的样品。或者，为了分析核苷酸序列，可以根据例如《分子克隆实验室手册》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，1989,2.60-2.65)中描述的方法在NZYM液体培养基中扩增噬菌体克隆，以制备噬菌体溶液。由此噬菌体溶液，可以使用例如Lambda-TRAP PLUS DNA Isolation Kit(Clontech Laboratories公司)提取噬菌体克隆DNA，并将得到的DNA在上述用于制备核苷酸序列分析样品的引物延伸法中作为模板使用。
该启动子DNA可以通过如上所述测定由此得到的DNA的启动子功能而获得。
该启动子DNA还可以通过在包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA的核苷酸序列中导入突变而获得。具体而言，可以根据例如A.Greener和M.Callahan描述的方法(Strategies 7:32-34,1994)在包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA中随机导入突变，或者可以根据例如W.Kramer等人(核酸研究(Nucleic Acid Research)12:9441,1984)或W.Kramer和H.J.Frits(酶学方法(Methods in Enzymology)154:350,1987)描述的缺口二联体法，或根据T.A.Kunkel(美国国家科学院进展(Proc.of Natl.Acad.Sci.USA)82:488,1985)或T.A.Kunkel等人(酶学方法(Methods in Enzymology)154:367,1987)描述的Kunkel法在包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA中位点特异的导入突变。或者，具有在SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:7所示部分核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入的核苷酸序列的寡核苷酸引物可以作为引物进行PCR，以扩增包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入的核苷酸序列的DNA。此外，可以产生SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列内的一个或多个片段的部分核苷酸序列被其它启动子的部分核苷酸序列取代的嵌合DNA，还可以根据例如S.Henikoff等人(基因(Gene)28:351,1984)或C.Yanisch-Perron等人(基因(Gene)33:103,1985)描述的方法，制备具有其中SEQID NO:1所示部分核苷酸序列被缺失的核苷酸序列的DNA。该启动子DNA可以通过如上所述测定由此得到的DNA的启动子功能而获得。
在如上所述得到的启动子DNA中，本发明启动子可以包含上文定义的DNA(a)或(b)，或者二者兼之，还可以重复包含这些DNA。
另外，本发明启动子还可以包含具有增加基因在植物中的转录效率的效果的核苷酸序列。这些核苷酸序列可以是例如组成性展示其转录效率增加效果的核苷酸序列，或物种、组织、或阶段特异的展示其转录效率增加效果的核苷酸序列，或其转录效率增加效果由例如致病微生物感染、或由诸如光、热、干旱、盐、或创伤等压力诱导的核苷酸序列。具有增加基因在植物中的转录效率的效果的核苷酸序列的特定范例包括，例如其中位于转录点上游第318位至第138位碱基的甘露碱合酶基因区连接在位于转录点上游第333位至第116位碱基的土壤杆菌章鱼碱合酶基因区的下游的转录激活核苷酸序列，和其中位于转录点上游第333位至第116位碱基的章鱼碱合酶基因区连接在位于转录点上游第318位至第213位碱基的甘露碱合酶基因区的下游的转录激活核苷酸序列(植物杂志(The Plant Journal)7(4):661-676,1995)；包含花椰菜花叶病毒35S启动子中位于转录点上游第343位至第91位碱基的核苷酸序列(自然(Nature)313:810-812,1985)；包含番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因(rbc-3A)中位于转录点上游第1099位至第205位碱基的核苷酸序列(植物细胞(Plant Cell)1:217-227,1990)；包含烟草PR1a基因中位于转录点上游第902位至第287位碱基的核苷酸序列(植物细胞(PlantCell)2:357-366,1990)；和包含马铃薯蛋白酶抑制物基因(PⅠ-Ⅱ)中位于转录点上游第1300位至第195位碱基的核苷酸序列(植物细胞(Plant Cell)2:61-70,1990)。
此外，本发明启动子还可以包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中具有转录效率增加效果的核苷酸序列。还可以鉴定这些核苷酸序列，并制备重复包含这些核苷酸序列的本发明启动子，或通过将这些核苷酸序列与在植物细胞中具有启动子功能的另一种DNA进行连接制备新的植物启动子。为了鉴定这些核苷酸序列，例如，可以在植物细胞中在各种本发明启动子DNA的控制下表达报导基因，并比较表达量以分析有助于转录效率增加效果的核苷酸序列。更具体的说，例如，制备包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入的核苷酸序列的各种DNA，并将报导基因(如β-葡糖醛酸糖苷酶基因)连接在各种DNA的下游。然后使用诸如下文描述的基因枪法或土壤杆菌感染法等方法，将这些构建物导入培养的植物细胞(诸如烟草培养细胞BY-2)。为了确定有助于转录效率增加效果的核苷酸序列，通过由培养细胞制备细胞提取物，并通过酶学技术测量提取物的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，以该活性值作为指示剂，或者通过将培养细胞在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的染色液中浸泡并观察蓝色染料的附着，以染料附着程度作为指示剂，从而比较各种细胞中报导基因的表达量，而且可以将结果与与报导基因连接的上述DNA的核苷酸序列进行对比。或者，还可以相似的将与报导基因连接的上述DNA导入植物细胞(诸如烟草野生型株系)，并可以由此细胞再生植株。为了确定有助于转录效率增加效果的核苷酸序列，通过测量来自植株或其后代的组织中的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，或通过将来自植株或其后代的组织或其部分在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的染色液中浸泡并观察蓝色染料的附着，以染料附着程度作为指示剂，从而比较各种上述DNA控制下的报导基因的表达量。
在本发明中，术语“终止子”指具有给出终止位于该DNA上游感兴趣基因转录的指令功能的DNA。本发明的终止子包括下列DNA(a)或(b)(下文称为本发明终止子DNA)(a)包含SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA，或(b)包含在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入，并且与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中由250个或更多碱基组成的任何区域同一性超过90％的核苷酸序列的DNA，该DNA的生物学功能与上述DNA(a)等效。
在本文中，“具有一个或多个碱基缺失、取代、或加入的核苷酸序列”的范例可以包括那些包含天然发生的变异(因生物体间的物种或个体差异或者制备DNA的组织间的差异引起)或人工导入DNA中的变异的核苷酸序列。“生物学功能与上述DNA(a)等效”的DNA可以是，例如，那些包含在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入的核苷酸序列的DNA(条件是它们保留了在植物细胞中的终止子功能)。这些DNA可以是那些由天然来源克隆的DNA，或在由天然来源克隆的DNA中包含人工导入的缺失、取代、或加入碱基的DNA，或通过化学合成而人工产生的DNA。
而且通过将本发明终止子和目的基因(位于该终止子的上游)导入宿主细胞的步骤，和在宿主细胞中在该终止子的控制下表达该目的基因的步骤，有可能增加目的基因的表达效率。
本发明终止子DNA可以根据上述用于获得本发明启动子DNA的方法根据SEQ ID NO:2所示核苷酸序列分离。具体的实施例可以是以得自诸如胡萝卜等植物的基因组DNA作为模板，以具有SEQ ID NO:2中第1位至第20位碱基表示的核苷酸序列的寡核苷酸，和具有与SEQID NO:2中第827位至第851位碱基表示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，进行一轮至多轮PCR(反应条件例如一轮至多轮PCR的每一轮进行30-40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)。
为了确认该终止子DNA在植物细胞中的终止子功能，可以例如将能够在植物细胞中发挥功能的启动子、诸如β-葡糖醛酸糖苷酶基因等报导基因、和该终止子DNA以能够表达的方式连接在一起，同时，作为对照，以相同方式连接启动子和β-葡糖醛酸糖苷酶基因。使用诸如下文描述的基因枪法或土壤杆菌感染法等方法，将各种构建物导入培养的植物细胞(例如烟草培养细胞BY-2)。然后，通过由各种细胞制备细胞提取物，并测量提取物的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，以该活性值作为指示剂，或者通过将所述细胞在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的染色液中浸泡并观察蓝色染料的附着，以染料附着程度作为指示剂，确认了β-葡糖醛酸糖苷酶表达量在导入了连接在一起的启动子、β-葡糖醛酸糖苷酶基因和该终止子DNA的植物细胞中比对照高。或者相似的，将能够在植物细胞中发挥功能的启动子、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、和该终止子DNA连接在一起，同时，作为对照，以相同方式连接启动子和β-葡糖醛酸糖苷酶基因，然后将各种构建物导入植物细胞(诸如来自烟草野生型株系的细胞)，并可以由此细胞再生植株。可以通过测量来自再生植株或其后代的组织中的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，或者通过将来自植株或其后代的组织或其部分在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的染色液中浸泡并观察蓝色染料的附着，以染料附着程度作为指示剂，从而确认该终止子DNA的终止子功能的存在与否。
而且，该终止子DNA还可以如下获得标记例如至少包含SEQ IDNO:2所示部分核苷酸序列的DNA，并以此作为探针与得自植物等的DNA杂交，以检测并克隆探针特异结合的DNA。
在此方法中，可以将例如得自诸如胡萝卜等植物的基因组DNA文库作为与上述探针进行杂交的DNA。关于这种DNA文库，可以使用商品化的基因组DNA文库，或者可以根据如《分子克隆实验室手册》(第2版，1989，冷泉港实验室出版社)或《分子生物学现行方案》(1987,John Wiley and Sons,Inc.,ISBNO-471-50338-X)中描述的用于文库制备的常用方法，例如使用λ载体(诸如λFIXⅡ、λEMBL3、λEMBL4、或λDASHⅡ(STRATAGENE)和用于体外包装的Gigapack包装提取物(Gigapack Packaging Extracts,STRATAGENE)，制备供使用的基因组DNA文库。
使探针与这些DNA杂交的方法可以包括菌落杂交和噬菌斑杂交，而正确的方法可以根据文库制备中使用的载体类型进行选择。在使用质粒载体构建文库的情况中，进行菌落杂交。具体而言，首先将文库中的DNA导入宿主生物体以获得转化体，将得到的转化体稀释，在琼脂培养基上铺板，并于37℃培养至出现菌落。另一方面，在使用噬菌体载体构建文库的情况中，进行噬菌斑杂交。具体而言，首先将宿主生物体和文库中的噬菌体在感染条件下混匀，然后进一步与软琼脂培养基混匀，并在琼脂培养基上铺板，于37℃培养至出现噬菌斑。更具体的说，例如根据《分子克隆实验室手册》(第2版，1989，冷泉港实验室出版社，2.60-2.65)中描述的方法，将大约9.0×105pfu噬菌体文库在NZY琼脂培养基中以0.1-1.0pfu/mm2琼脂培养基的密度铺开，并于37℃培养6-10小时。
在上述两种杂交方法中，将膜铺在上述培养物生长的琼脂培养基表面，并将携带质粒或噬菌体的转化体转移到膜上。用碱处理后，中和膜，并进一步处理将DNA固定在膜上。更具体的说，例如在噬菌斑杂交的情况中，根据，《克隆和测序植物生物技术实验手册》(Watanabe和Sugiura编，Noson-bunka-sha,1989)中描述的常用方法，将诸如硝酸纤维素或尼龙膜(如Hybond-N+,Amersham Pharmacia Biotech公司)等滤膜铺在上述琼脂培养基上，并放置大约1分钟，使噬菌体颗粒吸附到膜上。然后，将膜在碱液(1.5M NaCl、0.5N NaOH)中浸泡大约3分钟以裂解噬菌体颗粒并由此将噬菌体DNA释放到膜上，然后将膜在中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl缓冲液，pH7.5)中浸泡大约5分钟。用清洗液(300mM NaCl、30mM柠檬酸钠、200mM Tris-HCl缓冲液)清洗大约5分钟后，将膜于大约80℃烘烤大约90分钟，以将噬菌体DNA固定在膜上。
将制备的膜与作为探针的上述DNA进行杂交。可以如D.M.Glover编的《DNA克隆，一种实用的方法(DNA cloning,a practicalapproach)》(IRL出版社，1985,ISBN 0-947946-18-7)；《克隆和测序植物生物技术实验手册》(Watanabe和Sugiura编，Noson-bunka-sha,1989)；或《分子克隆实验室手册》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，1989)所述进行杂交。
为了用放射性同位素标记作为探针使用的DNA，可以使用例如随机标记试剂盒(Random Labeling Kit,Boehringer Mannheim或TakaraShuzo有限公司)，或者也可能以用作探针的DNA作为模板，用[α-32P]dCTP取代dCTP，通过PCR标记DNA。或者，为了用荧光染料标记作为探针使用的DNA，可以使用例如ECL直接核酸标记和检测系统(ECLDirect Nucleic Acid Labeling and Detection System,AmershamPharmacia Biotech公司)。
可以获得多种用于进行杂交的试剂和温度条件。例如，可以每cm2如上制备的膜配制50-200μl体积的含450-900mM NaCl、45-90mM柠檬酸钠、0.1-1.0％十二烷基磺酸钠(SDS)、和0-200μg/ml变性的非特异的DNA(在某些情况中，可以任选的含0-0.2％清蛋白、Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮等)的预杂交溶液，优选含900mM NaCl、90mM柠檬酸钠、1％SDS、和100μg/ml变性的小牛胸腺DNA的预杂交溶液，将上述膜浸泡在溶液中并于42-68℃温育1-4小时，优选于45℃2小时。然后，将例如含450-900mM NaCl、45-90mM柠檬酸钠、0.1-1.0％SDS、和0-200μg/ml变性的非特异的DNA(在某些情况中，可以任选的含0-0.2％清蛋白、Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮等)的杂交溶液等，优选含900mM NaCl、90mM柠檬酸钠、1％SDS、和100μg/ml变性的小牛胸腺DNA的杂交溶液，与通过上述方法得到的探针(相当于1.0×104-2.0×106cpm/cm2膜的量)混和，以制备50-200μl/cm2膜的体积的混和液，将膜浸泡在混和液中并于42-68℃温育4-20小时，优选于45℃16小时，以实现杂交。杂交反应后，回收膜，并用例如含15-300mM NaCl、1.5-30mM柠檬酸钠、0.1-1.0％SDS的清洗液等于42-68℃，优选用含300mM NaCl、30mM柠檬酸钠、1％SDS的清洗液于55℃，清洗1-4次(每次各10-60分钟)，优选2次(每次各15分钟)。而且，将膜用2×SSC溶液(300mM NaCl、30mM柠檬酸钠)简单漂洗，然后干燥。通过例如放射自显影，确定膜上探针的位置，以检测膜上与所用探针杂交的DNA的位置。鉴定最初的琼脂培养基上与膜上检测到的DNA位置对应的克隆，可以挑取用于分离携带那些DNA的克隆。具体而言，将膜暴露于成像板(Fuji Photo Film有限公司)4小时，并使用BAS 2000(Fuji Photo Film有限公司)分析此成像板以检测信号。由用于制备膜的琼脂培养基，切下检测到信号的相应位置的部分(大约5mm2的胶块)，将这些胶块在大约500μl SM缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液pH7.5、0.1M NaCl、7mM MgSO4、0.01％明胶)中浸泡2-16小时，优选3小时，以洗脱噬菌体颗粒。根据《分子克隆实验室手册》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，1989,2.60-2.65)中描述的方法，将得到的噬菌体颗粒洗脱液在琼脂培养基上铺开，并于37℃培养6-10小时。使用此琼脂培养基，以上述相同方式将噬菌体DNA固定到膜上，并将此膜与上述探针进行杂交。由检测到的信号在用于制备膜的琼脂培养基上相应位置的胶块，洗脱噬菌体颗粒，在琼脂培养基上铺开，并以上述相同方式制备膜，以进行杂交。重复这些鉴定和纯化步骤，以得到携带具有可与所用探针杂交的核苷酸序列的DNA的噬菌体克隆。
可以将通过上述杂交筛选得到的克隆所含DNA亚克隆到可以容易制备或分析DNA的质粒载体中，诸如商品化的pUC18、pUC19、pBluescript KS+、或pBluescript KS-，以制备质粒DNA，而且可以使用例如《分子克隆实验室手册》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，1989,13.42-13.74)中描述的染料双脱氧终止法测定其核苷酸序列。可以根据例如《分子克隆实验室手册》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis,冷泉港实验室出版社，1989,13.15)中描述的引物延伸法制备用于核苷酸序列分析的样品。或者，为了分析核苷酸序列，可以根据例如《分子克隆实验室手册》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，1989,2.60-2.65)中描述的方法在NZYM液体培养基中扩增噬菌体克隆，以制备噬菌体溶液。由此噬菌体溶液，可以使用例如Lambda-TRAP PLUS DNA Isolation Kit(Clontech Laboratories公司)提取噬菌体克隆DNA，并将得到的DNA在上述用于制备核苷酸序列分析样品的引物延伸法中作为模板使用。
该终止子DNA可以通过如上所述测定由此得到的DNA的终止子功能而获得。
为了在诸如植物等宿主细胞中使用本发明启动子表达目的基因，可以使用其中本发明启动子和目的基因还有根据需要的终止子以能够发挥功能的方式连接在一起的基因(下文称为本发明嵌合基因)。在本文中，目的基因是那些要在诸如植物等宿主细胞中表达的基因，包括例如编码诸如酶、存储蛋白、受体、转录因子、或信号转导因子等蛋白质的基因，这些基因可以以有义或反义方向(取决于它们的目的)适当的连接在本发明启动子的下游。所用终止子不受特别限制，只要它们在导入的宿主细胞中具有给出终止转录的指示功能，而且可以包括，例如得自土壤杆菌Ti质粒的胭脂碱合酶基因的终止子(nos-t)和得自诸如GV1和GV2病毒等植物病毒的终止子，以及本发明终止子。此外，本发明嵌合基因可以重复包含本发明启动子或其部分的核苷酸序列。在本文中，术语“以能够发挥功能的方式”指本发明嵌合基因所含的目的基因与本发明启动子和/或终止子的连接方式使得，当用该嵌合基因转化宿主细胞后，基因在宿主细胞中在启动子和/或终止子的控制下表达。
有关包含本发明启动子的载体，术语“载体”指能够在宿主细胞中繁殖的DNA，包括例如能够在诸如大肠杆菌、酵母、植物细胞、或动物细胞等细胞中繁殖的质粒、噬菌体、和噬菌粒，而且根据宿主细胞和它们的目的选择适当的载体。特定的范例可以是基于pUC的质粒(诸如pUC118、pUC119,Takara Shuzo有限公司)、基于pSC101的质粒、Ti质粒(诸如pBI101、pBI121,Clontech Laboratories公司)、Bluescript噬菌粒(诸如pBluescript SK(+/-),STRATAGENE)、基于M13的噬菌体(诸如mp10、mp11,Amersham Pharmacia Biotech公司)、基于λ的噬菌体(诸如λgt10、λgt11,STRATAGENE)或粘粒(诸如SuperCosⅠ,STRATAGENE)，而且通过常用基因工程技术将本发明启动子掺入这些载体，可以构建包含本发明启动子的载体。
如果在包含本发明启动子的这些载体中，启动子下游还存在基因插入位点和终止子，则此载体可以优选用于构建在宿主细胞中表达目的基因的载体。在本文中，术语“基因插入位点”指例如能够被基因工程技术中常用的限制酶特异识别并切割的核苷酸序列，优选的，指在包含本发明启动子和终止子的载体上唯一存在的这类限制酶识别核苷酸序列。这种基因插入位点、本发明启动子、和终止子的定位优选是，当目的基因插入该基因插入位点后，本发明启动子、目的基因、和终止子在载体上以能够发挥功能的方式连接在一起。这种载体可以通过例如将本发明启动子DNA插入包含基因插入位点和终止子的质粒而构建，具体而言，插入pBI101.3(Clontech Laboratories公司)等等的多克隆位点(基因插入位点)。或者，还可以通过将本发明启动子和终止子插入包含基因插入位点的载体而构建，具体而言，插入pBIN19(核酸研究(Nucl.Acid Res.)12:8711-8721,1984)等等的多克隆位点(基因插入位点)。
包含本发明嵌合基因的载体可以优选用于将嵌合基因导入宿主细胞，并且可以通过将嵌合基因克隆到上述载体中，或通过将目的基因克隆到包含本发明启动子、基因插入位点、和终止子的上述载体的基因插入位点而制备。例如，使用pBI101.3(Clontech Laboratories公司)制备的上述载体可以用限制酶进行切割，以除去该载体上存在的报导基因(β-葡糖醛酸糖苷酶)，然后可以插入目的基因取代报导基因，以制备包含本发明嵌合基因的载体。
上述本发明载体可以包含目的基因和/或本发明启动子和终止子，而且它还可以包含用于选择导入了载体的宿主细胞的标记基因(例如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因、能够赋予植物对除草剂的抗性的基因等等)。此外，载体还可以以重复方式包含本发明启动子的核苷酸序列。
可以根据诸如《分子克隆实验室手册》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，1989)中描述的CaCl2法或电穿孔法等方法，将本发明载体导入诸如大肠杆菌或土壤杆菌等宿主细胞。导入了本发明载体的上述微生物细胞(转化体)可以用于制备本发明嵌合基因或用于将嵌合基因导入植物细胞。
或者，可以通过例如基因枪法(使用基因枪直接导入植物组织或培养细胞的方法)将编码本发明启动子的DNA或本发明嵌合基因的DNA导入作为宿主细胞的植物细胞。相似的，还可以通过诸如土壤杆菌感染法(用土壤杆菌感染植物组织的方法)、电转染法(原生质体的电穿孔法或电转染法)、或基因枪法等任何众所周知的方法将本发明载体导入作为宿主细胞的植物细胞。
在其中宿主细胞中导入了本发明启动子、本发明嵌合基因、或本发明载体任何一种的转化体中，那些植物转化体的范例可以包括诸如水稻、玉米、大麦、和小麦等单子叶植物和包括豆类(诸如大豆、豌豆、蚕豆、和苜蓿)、茄类植物(诸如烟草、番茄、和马铃薯)、芸苔科植物(诸如甘蓝、油菜、和芥菜)、葫芦类植物(诸如甜瓜、南瓜、和黄瓜)、伞形类植物(诸如胡萝卜和芹菜)、紫菀类植物(诸如莴苣)等双子叶植物。
可以通过将本发明启动子、本发明嵌合基因、或本发明载体导入上述宿主细胞产生转化体。例如，可以得到在基因组DNA上目的基因上游插入了本发明启动子、并在本发明启动子的控制下表达该目的基因的宿主细胞，或在基因组DNA中插入了本发明嵌合基因、并在本发明启动子的控制下表达该嵌合基因所含基因的宿主细胞，或包含内含本发明嵌合基因的载体、并在本发明启动子的控制下表达嵌合基因所含基因的宿主细胞。
由此得到的转化体植物细胞可以根据例如S.B.Gelvin、R.A.Schilperoot和D.P.S.Verma的《植物分子生物学手册(PlantMolecular Biology Manual)》(Kluwer Academic Publishers,1988)、Ko Simamoto和Kiyotaka Okada编的《用于植物模型(水稻和拟南芥)的实验方案(Experimental protocols for model plants(rice andArabidopsis thaliana))(Shujun-sha,ISBN4-87962-157-9,C3345,1996，第78-143页)或Hirofumi Uchimiya的《植物基因工程手册如何生产转基因植物》(Kodansha-Scientific,1990,ISBN4-06-153513-7 C3045，第28-33页)中描述的常用植物组织培养技术中的任何方法进行再生；并可以由此得到所述植物细胞衍生的经转化植株。此外，通过培养和繁殖由此得到的植株，可以得到它们的后代。在本发明中，所有这些都包括于转化体中。
为了确认目的基因的导入成功与否，可以根据常用基因工程技术由上述转化体提取DNA，用限制酶切割，并用于进行Southern杂交(以转化宿主细胞所用DNA或其部分作为探针)。相似的，为了研究目的基因的表达状态，可以根据常用基因工程技术由这些转化体提取RNA，并用于进行Northern杂交(以具有将在本发明启动子的控制下表达的感兴趣基因的有义或反义核苷酸序列的寡核苷酸或DNA作为探针)。
通过以有义方向将具体基因连接在本发明启动子的控制下并使之在宿主生物体的细胞中表达，可以为诸如植物等宿主生物体提供有用性状。例如，通过表达诸如苯丙氨酸脱氨酶基因(PAL)、查尔酮合酶基因(CHS)、几丁质酶基因(CHT)、溶菌酶基因或PR蛋白质基因等防卫基因；诸如Pto基因等抗病基因；病毒外壳蛋白基因；BT(苏云金芽孢杆菌)杀虫蛋白基因等等，可以在宿主生物体的组织中增强针对细菌、真菌、病毒、昆虫等的抗性。相似的，通过在宿主细胞中表达诸如大豆的大豆球蛋白或β-conglycinin基因等存储蛋白基因，可以增加饲料农作物中各种蛋白质的含量或基本氨基酸的含量；通过表达例如巴西坚果的2S清蛋白基因、玉米或水稻的10kDa或15kDa蛋白质基因，可以增加饲料农作物中的甲硫氨酸含量或赖氨酸含量；通过表达诸如bioA、bioB、bioC、bioD、bioF、或bioH酶基因等生物素生物合成相关酶基因，可以增加饲料农作物中的生物素含量；通过表达例如硬脂酰-ACP-去饱和酶基因、酰基-ACP-硫酯酶基因、或3-磷酸酰基转移酶基因，可以使由磷脂含量降低和油酸含量及亚麻酸含量升高引起的脂类氧化稳定性的增强和脂类的改进成为可能；或者通过在宿主细胞中表达酰基转移酶基因，可以通过增加不饱和脂肪酸的比例增强对低温的抵抗力。通过在宿主细胞中表达诸如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、或新霉素抗性基因等涉及抗生素抗性的基因，还可以提供可用于转化体选择的抗生素抗性。此外，通过在宿主细胞中表达诸如L-膦丝菌素乙酰基转移酶或原卟啉原氧化酶(PPO)基因等涉及除草剂抗性的基因，还可能产生除草剂抗性农作物植株。
另一方面，还可以将特定基因以反义方向连接在本发明启动子的控制下，并在诸如植物等宿主生物体的细胞中表达，以赋予宿主生物体以有用性状。例如，通过在宿主细胞中表达针对诸如水稻异构酶等支链淀粉降解酶基因的反义基因，可以改进水稻种子的淀粉成分；通过在宿主细胞中表达针对诸如南瓜1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合酶等乙烯合酶基因的反义基因，可以增强水果、花等的保存稳定性；或者通过在宿主细胞中表达针对番茄的多聚半乳糖醛酸酶基因的反义基因，也可以增强水果的保存稳定性。
此外，通过在宿主细胞中表达诸如S基因座特异性RNA酶基因等雄性不育相关基因，还可以控制植物的繁殖力。
实施例本发明由下列实施例举例说明，但是本发明不受这些实施例的限制。实施例1本发明的启动子和终止子的分离本发明的启动子和终止子是使用由胡萝卜叶制备的基因组DNA进行反式聚合酶链式反应(反式PCR)得到的。步骤描述如下。(1)胡萝卜基因组DNA的制备取10g6周龄幼苗的胡萝卜叶，在液氮中磨碎，重悬于5ml 2xCTAB溶液(2％十六烷基三甲基溴化铵、100mMTris-HCl缓冲液pH8.0、20mMEDTA pH8.0、1.4M NaCl、1％聚乙烯吡咯烷酮)，然后于55℃温育10分钟。向此中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，于室温轻轻混匀30分钟，然后离心分别回收上层和下层。(1)向上层中加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1),(2)向下层加入等体积的1xCTAB溶液(用无菌蒸馏水2倍稀释2xCTAB得到的溶液)。将两份混和物于室温轻轻混匀10分钟，再次离心，合并由(1)和(2)回收的上层。向此中，加入1/10体积的10％CTAB溶液(10％十六烷基三甲基溴化铵、0.7M NaCl)和等体积的沉淀缓冲液(2％十六烷基三甲基溴化铵、50mM Tris-HCl缓冲液pH8.0、10mM EDTA pH8.0)，轻轻混匀，然后离心。回收沉淀，重悬于1M NaCl-TE(1M NaCl、10mM Tris-HCl缓冲液pH8.0、1mM EDTApH8.0)，然后加入等体积的异丙醇并轻轻混匀，随后离心。将得到的沉淀用70％乙醇漂洗，简单干燥，然后重悬于TE。向此悬浮液中，加入RNA酶至终浓度10μg/ml,于37℃温育30分钟，然后加入1/4体积的4M醋酸铵和2倍体积的100％乙醇，混匀，并静置。通过将DNA沉淀缠绕在巴斯德吸管上回收，用70％乙醇漂洗，简单干燥，并重悬于TE(10mM Tris-HCl缓冲液pH8.0、1mM EDTA pH8.0)。将此DNA溶液适当稀释，并进行吸光值测量和琼脂糖凝胶电泳。结果确认回收了大约350μg基因组DNA。(2)包含本发明启动子和终止子的DNA的PCR扩增取10μg步骤(1)得到的基因组DNA，用100U PvuⅡ完全消化。然后加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积的100％乙醇，混匀，并于4℃以15000rpm离心10分钟回收沉淀的DNA。将沉淀用70％乙醇漂洗，并重悬于TE至终浓度20ng/μl。使用此DNA溶液和连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)进行连接反应，反应体系400μl，终浓度1ng/μl。然后将反应混和物作为模板，使用具有下列核苷酸序列的寡核苷酸A和B进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸A:5’-GGGTT TCAAT GGATT CGATG-3’(20mer)寡核苷酸B:5’-GCAGA TGCTC AGAAC ACTGC-3’(20mer).而且，使用上述PCR混和物的一部分和具有下列核苷酸序列的寡核苷酸C和D进行另一次PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃3min)寡核苷酸C:5’-GGCAG CTGGC ACCCA TGATA TTTAG AATG-3’(29mer)寡核苷酸D:5’-GGCAG CTGTT CATAA TTTAC AGAGT GAGTG ACAGTCAG-3’(38mer).通过在0.8％琼脂糖凝胶上分析反应后溶液的一部分，确认了大约3kb的DNA片段得到了扩增。(3)本发明启动子和终止子的克隆和测序向步骤(2)得到的PCR混和物中加入TE，将体积调整至200μl。向此溶液中，加入等体积的中性酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，彻底混匀，然后于20℃以15000rpm离心5分钟回收上层。向此中，加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积的100％乙醇，混匀，然后于4℃以15000rpm离心10分钟回收沉淀的DNA。用70％的乙醇漂洗后，将DNA重悬于TE，并用30U PvuⅡ完全消化。反应后，如上所述进行酚处理和乙醇沉淀。将回收的DNA重悬于50μlTE，并用旋转层析柱S-400(Amersham Pharmacia Biotech公司)进行纯化。取1μl洗脱液在0.8％琼脂糖凝胶上进行分析，揭示了存在大约2kb和大约1kb的DNA片段。取2μg pUC18载体，用10U SmaⅠ完全消化，并用碱性磷酸酶(Takara Shuzo有限公司)进行去磷酸化。将反应液如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，回收载体DNA，然后重悬于TE。取50ng此载体DNA和50ng上述片段，使用连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)进行连接反应，然后导入大肠杆菌JM109菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞。将完成导入步骤的细菌菌株在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上进行培养，并由生长的克隆制备质粒DNA。通过用限制酶切割DNA并进行琼脂糖凝胶电泳，选择出分别含有大约2kb和大约1kb的目的DNA片段的候选克隆。将具有存在于pUC18载体中的核苷酸序列的下列寡核苷酸E和F作为引物，使用Taq染料双脱氧终止物循环测序试剂盒(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle SequencingKit,PE Biosystems)和荧光测序仪(PE Biosystems)分析候选克隆携带的DNA的核苷酸序列寡核苷酸E:5’-AACAA TTTCA CACAG GAAAC AGCTA TGACC-3’(30mer)寡核苷酸F:5’-CAGTC ACGAC GTTGT AAAAC GACGG CCAGT-3’(30mer)根据由此揭示的核苷酸序列，合成寡核苷酸，并作为引物以上述相同方式用于分析核苷酸序列。由此测定了SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。实施例2导入了本发明启动子的转基因植物的产生(1)Ti质粒表达载体的构建合成具有下列核苷酸序列(包含用于克隆的限制酶识别核苷酸序列)的寡核苷酸G和H，并作为引物，以实施例1中得到的具有SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的质粒作为模板，进行PCR(40个循环94℃1min；55℃2min；74℃3min)寡核苷酸G:5’-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3’(28mer)寡核苷酸H:5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer),将扩增的DNA片段用10U HindⅢ和10U XbaⅠ完全消化，然后将部分消化产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行分离。切下大约1.7kb的DNA条带，使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)纯化胶块所含DNA。相似的，将剩余溶液在4％Nusieve琼脂糖凝胶(FMC BioProducts)上进行分离，切下大约250bp的条带，并纯化胶块所含DNA。取2μg由pBIN19(S.Ohta等人，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)31(6):805-813,1990和Y.Hiei等人，植物杂志(Plant J.)6:271-282,1994)衍生的载体pIG121HM(见图3)，用10U HindⅢ和10U XbaⅠ消化，并用碱性磷酸酶进行去磷酸化。然后如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收载体DNA。将载体DNA和上述两种DNA片段(大约1.7kb和大约250bp)使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌HB101菌株(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的感受态细胞，并将完成导入步骤的细菌菌株在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基上进行培养。由生长的克隆制备质粒DNA，用限制酶HindⅢ和XbaⅠ切割，并在琼脂糖凝胶电泳上分析，以选择同时包含上述大约1.7kb DNA和大约250bp DNA片段的质粒。然后，将选择的质粒作为模板，以上述寡核苷酸G和H作为引物，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸G:5’-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3’(28mer)寡核苷酸H:5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer).由此确认了大约2kb的DNA片段得到了扩增，并由此得到了在β-葡糖醛酸糖苷酶基因上游包含本发明启动子的Ti质粒表达载体pBICR16G6P(图3)。(2)获取转基因植物通过S.B.Gelvin、R.A.Schilperoort和D.P.S.Verma(《植物分子生物学/手册(Plant Molecular Biology/Manual)》,1988,Kluwer Academic Publishers)和Valvekens等人(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:5536-5540,1988)描述的方法得到转基因植物。
将可以由购买的标准菌株根据R.Deblaere等人(核酸研究(Nucleic Acid Res.)13:4777-4788,1985)描述的方法制备的土壤杆菌C58C1菌株，在YEB培养基中于30℃振摇培养过夜，然后接种新鲜的YEB培养基，并进一步培养至培养液混浊度达到OD600=0.6。以下操作在低温室中进行。由培养液离心收集细菌细胞，重悬于预冷的无菌蒸馏水，并再次离心回收。此细菌细胞的清洗步骤重复2次，并使用10％甘油溶液而非无菌蒸馏水进行相似步骤。将由此得到的细菌细胞重悬于10％甘油，从而得到了比培养液浓缩400倍的悬浮液。向由此制备的细菌细胞悬浮液中，通过电穿孔法导入如上所述构建的包含本发明启动子的Ti质粒表达载体pBICR16G6P(见图1)或作为对照的pIG121HM载体，并将完成导入处理的细菌菌株在含50μg/ml卡那霉素的YEB平板上进行培养。由生长的卡那霉素抗性克隆通过碱-SDS法制备质粒DNA，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分析。通过溴乙锭染色检测DNA条带，确认了已经导入了Ti质粒表达载体。然后，将此质粒DNA作为模板，以上述寡核苷酸G和H作为引物，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸G:5’-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3’(28mer)寡核苷酸H:5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer).由此确认了大约2kb的DNA片段得到了扩增，证实已经导入了需要的表达载体。
将一片无菌培养的烟草叶片(0.7cm2)在土壤杆菌液体培养物(在含50μg/ml卡那霉素的YEB液体培养基中于30℃培养过夜)中浸泡2分钟，用无菌滤纸吸去多余液体后，放置在MS-NB培养基上。于25℃共培养5天(光照16小时，黑暗8小时)后，将叶片用MS液体培养基清洗，并放置于MS-NBC培养基上。再培养5天后，将叶片转移到含100μg/ml卡那霉素的MS-NBCK培养基上，并静止培养大约1个月。从叶片上切下再生芽，并在MS-CK培养基上进行次培养。大约1个月后，将生根的再生植株种植于土壤中以获得自花授粉的种子。实施例3转基因植物中转基因的确认将转基因烟草种子在2.5％次氯酸钠/0.002％Triton X-100中浸泡5分钟，随后用无菌水清洗4-5次，并通过在含100μg/ml卡那霉素的MS培养基上培养从而无菌发芽。由展示卡那霉素抗性的植株，通过CTAB方法制备基因组DNA。取50ng此DNA作为模板，以包含GUS基因(一种报导基因)的部分核苷酸序列的寡核苷酸Ⅰ和包含本发明启动子(包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA)的部分核苷酸序列的寡核苷酸J的组合作为引物寡核苷酸I:5’-ATCAA CACCT CAACA TTGAT GTTAG CGTAC-3’(30mer)寡核苷酸J:5’-TCTGC ATCGG CGAAC TGATC-3’(20mer)或以包含GUS基因(一种报导基因)的部分核苷酸序列的寡核苷酸K和包含NOS终止子的部分核苷酸序列的寡核苷酸L的组合作为引物寡核苷酸K:5’-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C-3’(21mer)寡核苷酸L:5’-GATAA TCATC GCAAG ACCGG-3’(20mer),进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；72℃ 3min)，并将部分PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离。结果是，确认了大约310bp和大约400bp的需要的DNA片段分别得到了扩增。实施例4A转基因表达的确认根据Jefferson(植物分子生物学报告(Plant Mol.Biol.Rep.)5:387-405,1987)描述的方法，测量实施例2中得到的转基因植株的幼苗的叶部和根部中的GUS活性和GUS染色。GUS活性使用4-甲基伞形酰葡糖苷酸(4-methylumbelliferyl glucuronide)作为底物通过荧光法测量，而活性染色使用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)作为底物进行，测量附着的蓝色染料(靛蓝)的量。(1)GUS染色将上述转基因烟草种子在含100μg/ml卡那霉素的MS培养基上培养从而无菌发芽。1周后、3周后、或1个月后，拔出卡那霉素抗性植株，并在GUS染色液(1mM X-Gluc、0.5mM K3Fe(CN)6、0.5mM K4Fe(CN)6、0.3％Triton X-100)中于37℃浸泡过夜，使反应能够进行。反应后，用100％乙醇脱色，并观察染色图案。结果是，在导入了包含本发明启动子的Ti质粒表达载体pBICR16G6P(见图1)的转基因烟草中，在表达载体上连接在本发明启动子下游的β-葡糖醛酸糖苷酶基因在叶、根、和茎中高度表达。(2)GUS活性测量将上述转基因烟草种子在含100μg/ml卡那霉素的培养基上无菌发芽，并于25℃进一步培养。发芽1周后、3周后、或1个月后，将取自卡那霉素抗性植株的0.8g根和0.5g叶置于研钵中，分别补加1ml和0.5ml提取缓冲液(50mM磷酸缓冲液pH7.0、10mM EDTA、0.1％TritonX-100、0.1％十二烷基肌氨酸钠、10mM巯基乙醇)，并加入适当量的海沙一起研磨。将研磨液转移到Eppendorf管中，离心，并回收上清液。取10-70μl此液体，加入500μl反应底物溶液(50mM磷酸缓冲液pH7.0、10mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.1％十二烷基肌氨酸钠、10mM巯基乙醇、1mM 4-甲基伞形酰-β-D-葡糖苷酸)，并于37℃温育。于规则时间间隔由反应液取样100μl，立即加入900μl终止液(0.2M碳酸钠)并混匀。在荧光分光光度计(HITACHI有限公司，F-2000)中测量由此制备的样品的荧光(激发波长365nm，发射波长455nm)。由测量值和叶或根提取物的蛋白质浓度，计算GUS活性。结果显示于表1。通过使用Bio-Rad Laboratories的蛋白质分析试剂的方法进行蛋白质浓度的定量。在取自导入了Ti质粒表达载体pBICR16G6P(其包含与β-葡糖醛酸糖苷酶基因连接的本发明启动子的DNA)的转基因烟草的叶和根样品中检测到GUS活性。具有最高GUS活性的一株转化体展示的GUS活性比用pIG121HM载体(其包含与β-葡糖醛酸糖苷酶基因连接的35S启动子的DNA)转化的对照转化体高8倍。
表1转基因烟草的GUS活性测量结果。。播种后1周
播种后3周
播种后1个月
实施例4B转基因表达的确认(1)获取转基因植物根据与上述实施例基本相同的方法，其中使用携带Ti质粒表达载体pBICR16G6P的土壤杆菌C58C1菌株将载体导入靶植株，从而制备另一种转基因植物拟南芥。
无菌发芽后，将一段(大约1cm)拟南芥根(在MS培养基上于23℃培养2-3周)在CIM琼脂培养基上培养2天，然后在土壤杆菌液体培养物(在含50μg/ml卡那霉素的YEB液体培养基中于30℃培养过夜)中浸泡2分钟，用无菌滤纸吸去多余液体后，放置在CIM琼脂培养基上。培养2天后，将根段转移到SIMC琼脂培养基上。再培养2天后，将根段转移到SIMCH琼脂培养基上。从根段上切下再生芽，并在MS培养基上进行次培养。大约1个月后，将生根的个体种植于土壤或褐块石棉(rock wool)中并在培养室中培养以获得近交种子。(2)转基因植物中转基因的确认将转基因拟南芥的种子在1.0％次氯酸钠中浸泡5分钟，随后用无菌水清洗3-5次，然后在含20μg/ml潮霉素的MS培养基上无菌发芽。由取自展示潮霉素抗性的植株的4或5片莲座叶，通过CTAB方法制备基因组DNA。取50ng此DNA作为模板，以包含GUS基因(一种报导基因)的部分核苷酸序列的寡核苷酸Ⅰ和包含本发明启动子(包含SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA)的部分核苷酸序列的寡核苷酸J的组合作为引物寡核苷酸I:5’-ATCAA CACCT CAACA TTGAT GTTAG CGTAC-3’(30mer)寡核苷酸J:5’-TCTGC ATCGG CGAAC TGATC-3’(20mer)或以包含GUS基因(一种报导基因)的部分核苷酸序列的寡核苷酸K和包含NOS终止子的部分核苷酸序列的寡核苷酸L的组合作为引物寡核苷酸K:5’-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C-3’(21mer)寡核苷酸L:5’-GATAA TCATC GCAAG ACCGG-3’(20mer),进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；72℃ 3min)，并将部分PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离。结果证实大约310bp和大约400bp的需要的DNA片段分别得到了扩增。(3)转基因表达的确认根据Jefferson(植物分子生物学报告(Plant Mol.Biol.Rep.)5:387-405,1987)描述的方法，测量实施例4B(1)和(2)中得到的转基因植株幼苗的叶部和根部中的GUS活性和GUS染色。GUS活性使用4-甲基伞形酰葡糖苷酸作为底物通过荧光法测量，而活性染色使用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)作为底物进行，测量附着的蓝色染料(靛蓝)的量。(3-1)GUS染色将上述转基因拟南芥种子在含20μg/ml潮霉素的MS培养基上培养从而无菌发芽。3周后，拔出潮霉素抗性植株，并在GUS染色液(1mMX-Gluc、0.5mM K3Fe(CN)6、0.5mM K4Fe(CN)6、0.3％Triton X-100)中于37℃浸泡过夜，使反应能够进行。反应后，用100％乙醇脱色，并观察染色图案。结果是，在导入了包含本发明启动子的Ti质粒表达载体pBICR16G6P(见图1)的转基因拟南芥中，在表达载体上连接在本发明启动子下游的β-葡糖醛酸糖苷酶基因在叶、根、和茎中高度表达。(3-2)GUS活性测量将上述转基因拟南芥种子在含20μg/ml潮霉素的培养基上培养从而无菌发芽，并于23℃进一步培养。播种3周后，将取自展示潮霉素抗性的3株个体的根和叶置于研钵中，分别补加1ml和1ml提取缓冲液(50mM磷酸缓冲液pH7.0、10mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.1％十二烷基肌氨酸钠、10mM巯基乙醇)，并加入适当量的海沙一起研磨。将研磨液转移到Eppendorf管中，离心，并回收上清液。取10-70μl此液体，加入500μl反应底物溶液(50mM磷酸缓冲液pH7.0、10mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.1％十二烷基肌氨酸钠、10mM巯基乙醇、1mM 4-甲基伞形酰-β-D-葡糖苷酸)，并于37℃温育。于规则时间间隔由反应液取样100μl，立即加入900μl终止液(0.2M碳酸钠)并混匀。在荧光分光光度计(HITACHI有限公司，F-2000)中测量由此制备的样品的荧光(激发波长365nm，发射波长455nm)。由测量值和叶或根提取物的蛋白质浓度，计算GUS活性。通过使用Bio-Rad Laboratories的蛋白质分析试剂的方法进行蛋白质浓度的定量。结果在取自导入了Ti质粒表达载体pBICR16G6P(其中包含与β-葡糖醛酸糖苷酶基因连接的本发明启动子的DNA)的转基因拟南芥的叶和根样品中检测到了GUS活性。一些转化体展示的GUS活性比用pIG121HM载体(其包含与β-葡糖醛酸糖苷酶基因连接的35S启动子的DNA)转化的对照转化体高几倍。实施例5导入了本发明启动子的转基因植物的产生和转基因表达的确认如实施例2(1)所示，将包含pBICR16G6P载体的细菌克隆在2ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中于37℃培养过夜。然后，将预培养物接种500ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基并于37℃培养过夜。以8000rpm离心10分钟收集细菌细胞，并使用QIAGEN质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司)纯化载体DNA。
使用基因轰击方法(C.M.基因枪系统，Rehbock公司，东京，日本Yang N-S,Christou P，用于基因转移的微粒轰击技术(ParticleBombardment Technology for Gene Transfer),W.H.Freeman Co.Publishers，纽约，第52-59页)，将回收的载体导入大豆平展叶片(取自温室生长的植株)以及根据J.Finer和A.Nagasawa描述的方法(植物细胞、组织和器官培养(Plant Cell,Tissue and OrganCulture)15:125-136,1988)诱导和培养的大豆体细胞胚中。将0.5～1μm金颗粒(Tokuriki Honten有限公司，日本)用乙醇清洗几次，并用无菌水配制60mg/ml的金颗粒悬浮液。取50μl金颗粒悬浮液、50μl 2.5M CaCl2、20μl 0.1M亚精胺与20μl pBICR16G6P载体悬浮液(0.5μg/ml)混匀。于室温静置30分钟后，以9000rpm离心10秒钟回收金颗粒，并悬浮于65μl 75％乙醇。以9000rpm离心10秒钟回收金颗粒，并重悬于300μl 100％乙醇。将此金颗粒悬浮液超声波处理(TOMY SEIKO有限公司)，取20μl悬浮液转移至发射器(Rehbock有限公司，日本)并干燥(分两次转移，每次10μl)。在110mmHg、335m/秒的条件下，用此金颗粒两次轰击MS琼脂培养基上的大豆平展叶片或体细胞胚。
至于对照实验，用pBI121和pBI221(Clontech Laboratories公司)轰击所述大豆平展叶片或体细胞胚。基因轰击后，将大豆平展叶片或体细胞胚于25℃放置24小时，然后用GUS染色缓冲液(1mMX-Gluc、0.5mM K3Fe(CN)6、0.5mM K4Fe(CN)6、0.3％ Triton X-100)于37℃浸泡过夜。于室温用100％乙醇脱色后，在体细胞胚以及平展叶片上观察到GUS表达产生的蓝点。因此，在大豆平展叶片和体细胞胚中都确认有pBICR16G6P的强GUS活性。实施例6包含本发明启动子和终止子的载体的构建(1)Ti质粒衍生物(pBIΔ)的构建为了构建包含本发明启动子和终止子的植物表达载体，作为第一步，如图4所示构建了Ti质粒衍生物(pBIΔ)。合成具有下列核苷酸序列(包含用于克隆的限制酶识别核苷酸序列)的寡核苷酸P和Q并作为引物，取5ng pBI101载体(Clontech Laboratories公司)作为模板，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸P:5’-GGGAA TTCTC AGATT GTCGT TTCCC GCCTT CAG-3’(33mer)寡核苷酸Q:5’-CAGAT CTGGG GAACC CTGTG GTTG-3’(24mer)将扩增的DNA片段用30U EcoRⅠ和30U SphⅠ完全消化，并将部分消化产物在4.0％ Nusieve琼脂糖凝胶(FMC BioProducts)上进行分离。切下186bp的DNA条带，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)纯化胶块所含DNA。取2μg载体pBI101(Clontech Laboratories),用10U EcoRⅠ和10U SphⅠ消化。然后如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收载体DNA。将载体DNA和上述DNA片段使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌细胞在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基上进行培养。由生长的克隆制备质粒DNA，用限制酶EcoRⅠ和SphⅠ切割，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，以选择包含上述186bp DNA片段的质粒(pBIΔ)。EcoRⅠ位点是该质粒T-DNA区中的唯一限制酶识别位点。(2)包含本发明启动子的pCR16G6P中HindⅢ和XbaⅠ识别位点的导入合成具有下列核苷酸序列(包含用于克隆的限制酶识别核苷酸序列)的寡核苷酸R和S并作为引物，以具有实施例1中得到的SEQ IDNO:7所示核苷酸序列的质粒作为模板，进行PCR(40个循环94℃1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸R:5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer)寡核苷酸S:5’-AACAA TGTAT GTCCG GTGTA CATCT ATGAC-3’(30mer)将扩增的DNA片段用50U XbaⅠ完全消化，并将部分消化产物在4.0％Nusieve琼脂糖凝胶(FMC BioProducts)上进行分离。切下大约250bp的DNA条带，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)纯化胶块所含DNA。取2μg具有实施例1中得到的SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的pCR16G6P载体，用10U XbaⅠ消化，并用碱性磷酸酶进行去磷酸化。然后如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收载体DNA。将载体DNA和回收的250bp的DNA片段使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌细胞在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基上进行培养。由生长的克隆制备质粒DNA，用限制酶XbaⅠ切割，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，以选择包含上述250bp的DNA片段的质粒。然后，以选择的质粒作为模板，以上述寡核苷酸S作为引物寡核苷酸S:5’-AACAA TGTAT GTCCG GTGTA CATCT ATGAC-3’(30mer)使用Taq染料双脱氧终止循环测序试剂盒(Taq Dye Deoxy TerminatorCycle Sequencing Kit,PE Biosystems)和荧光测序仪(PEBiosystems)分析选择的质粒中携带的核苷酸序列。结果证实该质粒，即pBICR16G6P-2(图4)，在β-葡糖醛酸糖苷酶基因的上游包含本发明的启动子。(3)包含本发明终止子的载体的构建由包含SEQ ID NO:2中的DNA片段的pCR16G6T构建包含本发明终止子核苷酸序列的pBICR16G6T-2，其中加入了用于基因克隆的SacⅠ和EcoRⅠ识别位点。取50ng pC16质粒DNA(植物细胞生理学(PlantCell Physiology)38(9):1080-1086,1997,JP 07-18828)用50UDraⅠ和50U SacⅠ完全消化，并将部分消化产物在4.0％Nusieve琼脂糖凝胶(FMC BioProducts)上进行分离。切下大约189bp的DNA条带，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)纯化胶块所含DNA。
合成具有下列核苷酸序列(包含用于克隆的限制酶识别核苷酸序列)的寡核苷酸T和U并作为引物，以5ng包含SEQ ID NO:2中的DNA片段的pCR16G6T作为模板，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸T:5’-TTCAT AATTT ACAGA GTGAG TGACA GTCAG-3’(30mer)寡核苷酸U:5’-GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC-3’(34mer)将扩增的DNA片段用20U EeoRⅠ和20U DraⅠ完全消化，并将部分消化产物在4.0％Nusieve琼脂糖凝胶(FMC BioProducts)上进行分离。切下800bp的DNA条带，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)纯化胶块所含DNA。取2μg pUC18载体(Takara Shuzo有限公司)，用20U EcoRⅠ和20U DraⅠ消化。然后如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收载体DNA。将载体DNA和上述两种DNA片段使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌JM109菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌在含100μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml X-Gal的LB培养基上进行培养。由白色菌落制备载体DNA，用限制酶EcoRⅠ和SacⅠ切割，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，以选择包含989bp的DNA片段的载体(pCR16G6T-2)。(4)包含本发明启动子和终止子的Ti质粒载体的构建取2μg此实施例6(2)中描述的pCR16G6P-2，用20U EeoRⅠ和20U SalⅠ完全消化，并将部分消化产物在0.8％琼脂糖凝胶(DojindoLaboratories)上进行分离。切下大小为2kb的DNA条带，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)纯化胶块所含DNA片段G。相似的，取2μg此实施例6(3)中描述的pCR16G6T-2，用20U EcoRⅠ和20U SalⅠ完全消化，并将部分消化产物在4％Nusieve琼脂糖凝胶(FMCBioProducts)上进行分离。切下大小为1kb的DNA条带，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)纯化胶块所含DNA片段H。同样将pBluescript KS载体(Clontech Laboratories公司)用EcoRⅠ完全消化，并用碱性磷酸酶进行去磷酸化。然后如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收载体DNA。将载体DNA和上述两种DNA片段H和G使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌JM109菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌在含100μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml X-Gal的LB培养基上进行培养。由白色菌落制备载体DNA，用限制酶EeoRⅠ切割，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分析，以选择包含3kb的DNA片段的载体。然后将该载体用20U EcoRⅠ完全消化。另一方面，将(1)中描述的pBIΔ用20U EcoRⅠ完全消化，并用碱性磷酸酶(Takara Shuzo有限公司)进行去磷酸化。将载体DNA和3kb的DNA片段使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌细胞在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基上进行培养。由生长的克隆制备载体DNA，用限制酶EcoRⅠ或EcoRⅠ和SalⅠ切割，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分析，以选择分别包含3kb的DNA片段或大约2kb和1kb的DNA片段的载体(pBICR16G6PT)。(5)pBICR16G6PT中HindⅢ识别位点的缺失取1μg pBICR16G6PT，用HindⅢ完全消化，并通过乙醇沉淀回收DNA。然后，将该DNA片段用5U T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)补平末端，并如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收DNA片段。将该DNA片段使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基上进行培养。由生长的克隆制备载体DNA，用限制酶HindⅢ切割，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分析，以选择缺失了HindⅢ识别位点的载体(pBICR16G6PTΔ)。实施例7转基因表达的确认(1)pBICR16G6PTΔ中GUS基因的导入取2μg pBI221质粒DNA(Clontech Laboratories公司)，用20USmaⅠ和20U SacⅠ完全消化，并通过乙醇沉淀回收DNA。然后，将此DNA片段用5U T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)补平末端，并如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收DNA片段。然后将DNA片段在1.0％琼脂糖凝胶(Dojindo Laboratories)上进行分离。切下大小大约1.7kb的DNA条带，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)纯化胶块所含GUS基因。同样取2μg pBluescript KS载体(ClontechLaboratories公司)，用20U SmaⅠ完全消化，并用碱性磷酸酶进行去磷酸化。然后如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收载体DNA片段。将50μg载体DNA和100ng上述1.7kb GUS基因片段使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌JM109菌株(TakaraShuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌细胞在含100μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml X-Gal的LB培养基上进行培养。
合成具有下列核苷酸序列(包含基于pBluescript KS(寡核苷酸K)和GUS基因(寡核苷酸M)的核苷酸序列)的寡核苷酸M和K，并作为引物，与上述转化体的白色菌落悬浮液一起，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸M:5’-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3’(17mer)寡核苷酸K:5’-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT-3’(21mer)然后将扩增的DNA片段在4.0％ Nusieve琼脂糖凝胶(FMCBioProducts)上进行分离。选择显示有410bp的DNA片段扩增的克隆用于进一步的构建。取2μg经纯化的质粒DNA，用20U SalⅠ和20UBamHⅠ完全消化，然后将DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶(DojindoLaboratories)上进行分离。切下大小大约1.7kb的DNA条带，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)纯化胶块所含DNA片段。取2μgpBICR16G6PTΔ，用20U SalⅠ和20U BamHⅠ消化，并用碱性磷酸酶(Takara Shuzo有限公司)进行去磷酸化。将50ng载体DNA和20ng上述1.7kb的DNA片段使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基上进行培养。
合成具有下列核苷酸序列的寡核苷酸U和K，并作为引物，与上述转化体的白色菌落悬浮液一起，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸U:5’-GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC-3’(34mer)寡核苷酸K:5’-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT-3’(21mer)然后将扩增的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶(Dojindo Laboratories)上进行分离。选择显示大约1.1kb的DNA片段扩增的克隆用于进一步的实验(pBICR16G6PTΔG)。将包含pBICR16G6PTΔG载体的细菌克隆用2ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基于37℃培养过夜。然后，将预培养物接种500ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基并于37℃培养过夜。以8000rpm离心10分钟收集细菌细胞，并使用QIAGEN质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司)纯化载体DNA。(2)通过基因轰击的GUS基因表达的确认使用实施例5描述的Morikawa等人的方法(C.M.基因枪系统，Rehbock公司，东京，日本)，将pBICR16G6PTΔG导入大豆体细胞胚。至于对照实验，以相同方式导入pBI221(Clontech Laboratories公司)。将经轰击的大豆体细胞胚于25℃放置24小时，并用GUS染色缓冲液于37℃浸泡过夜。在经pBICR16G6PTΔG轰击的大豆体细胞胚中观察到强GUS染色图案。实施例8本发明启动子中突变位点的引入(1)启动子中突变位点的引入(1-1)本发明启动子中SacⅠ识别位点的缺失取2μg pBICR16G6P，用20U SacⅠ完全消化。然后，将此DNA片段用5U T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)补平末端，并如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收DNA片段。然后将此DNA片段在1.0％琼脂糖凝胶(Dojindo Laboratories)上进行分离，切下大小大约(a)3.9kb和(b)880bp的DNA条带，并使用玻璃珠(Bio-RadLaboratories)纯化各胶块所含DNA片段(a)和(b)。将50ng DNA片段(a)和100ng DNA片段(b)使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌JM109菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌细胞在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养过夜。
合成具有下列核苷酸序列(即包含上述核苷酸序列)的寡核苷酸M和G，并作为引物，与上述转化体的生长菌落悬浮液一起，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸M:5’-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3’(17mer)寡核苷酸G:5’-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3’(28mer)然后将扩增的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶(Dojindo Laboratories)上进行分离。选择显示大约2kb的DNA片段扩增的克隆，并使用Qia制备旋转试剂盒(Qia-prep spin kit,QIAGEN公司)纯化质粒DNA。将经纯化的质粒DNA用SacⅠ切割，并通过1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分析，以选择SacⅠ识别位点缺失的质粒。SEQ ID NO:3所示基因核苷酸序列是SacⅠ识别位点缺失的质粒的范例。(1-2)本发明启动子中SphⅠ识别位点的缺失如(1-1)所述，可以缺失SEQ ID NO:7所示DNA片段中的SphⅠ识别位点。取2μg pBICR16G6P，用20U SphⅠ完全消化。然后，将此DNA片段用5U T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)补平末端，并如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收DNA片段。然后将此DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶(Dojindo Laboratories)上进行分离，切下大小大约(c)3.0kb和(d)1.6kb的DNA条带，并使用玻璃珠(Bio-RadLaboratories)纯化胶块中所含的DNA片段(c)和(d)。将50ng DNA片段(c)和100ng DNA片段(d)使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌JM109菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌细胞在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养过夜。
合成具有下列核苷酸序列(即包含上述核苷酸序列)的寡核苷酸M和N，并作为引物，与上述转化体的生长菌落悬浮液一起，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸M:5’-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3’(17mer)寡核苷酸N:5’-AGGAC GACTT AGGTG AATAC-3’(20mer)然后将扩增的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶(Dojindo Laboratories)上进行分离。选择显示大约1.6kb的DNA片段扩增的克隆，并使用Qia制备旋转试剂盒(Qia-prep spin kit,QIAGEN公司)纯化质粒DNA。将经纯化的质粒DNA用SphⅠ切割，并通过1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分析，以选择SphⅠ识别位点缺失的质粒。SEQ ID NO:4所示基因核苷酸序列是SphⅠ识别位点缺失的质粒核苷酸序列的范例。同样，SphⅠ识别位点缺失的启动子可以用于如(1-1)所述进一步缺失SacⅠ识别位点。(1-3)本发明启动子中XbaⅠ识别位点的缺失如(1-1)和(1-2)所述，可以缺失SEQ ID NO:7所示DNA片段中的XbaⅠ识别位点。取2μg pBICR16G6P，用20U XbaⅠ完全消化。然后，将此DNA片段用5U T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)补平末端，并如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收DNA片段。然后将此DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶(Dojindo Laboratories)上分离大小大约(e)7.0kb的DNA片段，并在4.0％Nusieve琼脂糖凝胶(FMC BioProducts)上分离大小大约(f)250bp的DNA条带。使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)纯化胶块所含DNA片段(e)和(f)。将50ng DNA片段(e)和20ng DNA片段(f)使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌JM109菌株(TakaraShuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌细胞在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养过夜。
合成具有下列核苷酸序列(即包含上述核苷酸序列)的寡核苷酸M和N，并作为引物，与上述转化体的生长菌落悬浮液一起，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸M:5’-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3’(17mer)寡核苷酸O:5’-ATACA TCTTT TCAAA TTTCA-3’(20mer)然后将扩增的DNA片段在4.0％ Nusieve琼脂糖凝胶(FMCBioProducts)上进行分离。选择显示大约250bp的DNA片段扩增的克隆，并使用Qia制备旋转试剂盒(Qia-prep spin kit,QIAGEN公司)纯化质粒DNA。将经纯化的质粒DNA用XbaⅠ切割，并通过1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分析，以选择XbaⅠ识别位点缺失的质粒。SEQ ID NO:5所示基因核苷酸序列是XbaⅠ识别位点缺失的质粒核苷酸序列的范例。同样，XbaⅠ识别位点缺失的启动子可以用于分别如(1-1)或(1-2)所述进一步缺失SacⅠ或SphⅠ识别位点。(2)包含本发明突变启动子的植物表达载体的构建可以通过实施例2中描述的方法构建表达载体。合成具有下列核苷酸序列(包含用于克隆的限制酶识别核苷酸序列)的寡核苷酸G和H，并作为引物，以具有SEQ ID NO:3、4或5所示核苷酸序列的质粒作为模板，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸G:5’-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3’(28mer)寡核苷酸H:5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer)，将扩增的DNA片段用10U HindⅢ和10U XbaⅠ完全消化，然后将部分消化产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行分离。分别切下大约2.0kb的DNA条带或大约1.7kb和250bp的DNA条带，使用玻璃珠(Bio-RadLaboratories)纯化胶块所含DNA片段。取2μg由pBIN19(S.Ohta等人，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)31(6):805-813,1990和Y.Hiei等人，植物杂志(Plant J.)6:271-282,1994)衍生的载体pIG121HM(见图3)，用10U HindⅢ和10U XbaⅠ消化，并用碱性磷酸酶进行去磷酸化。然后如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收载体DNA。将载体DNA和上述两种DNA片段(大约2.0kb、1.7kb和大约250bp)使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞，并将完成导入步骤的细菌菌株在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基上进行培养。然后由生长的克隆制备质粒DNA，用限制酶HindⅢ和XbaⅠ切割，并在琼脂糖凝胶电泳上分析，以选择包含上述2.0kb或1.7kb和250bpDNA片段的载体。然后，将选择的载体作为模板，以上述寡核苷酸G和H作为引物，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃3min)寡核苷酸G:5’-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3’(28mer)寡核苷酸H:5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer)结果证实大约2kb的DNA片段得到了扩增，由此得到了在β-葡糖醛酸糖苷酶基因上游包含具有本发明SEQ ID NO:3、4或5所示核苷酸序列的启动子的Ti质粒表达载体。而且，上述质粒中包含的NOS终止子可以换为得自pBICR16G6PT或实施例6中所述pBICR16G6PTΔ的终止子。实施例9包含本发明启动子和终止子的载体的构建和转基因表达的确认(1)包含本发明终止子的表达载体中GUS基因的导入可以如实施例7(1)所述将GUS基因导入表达载体。取2μg pBI221质粒DNA(Clontech Laboratories公司)，用20U SmaⅠ和20U SacⅠ完全消化，并通过乙醇沉淀回收DNA。然后，将此DNA片段用5U T4DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)补平末端，并如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收DNA片段。然后将DNA片段在1.0％琼脂糖凝胶(Dojindo Laboratories)上进行分离。切下大小大约1.7kb的DNA条带，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)纯化胶块所含GUS基因。同样取2μg pBluescript KS载体(Clontech Laboratories公司)，用20U SmaⅠ完全消化，并用碱性磷酸酶进行去磷酸化。然后如上所述进行酚处理和乙醇沉淀，从而回收载体DNA片段。将50μg载体DNA和100ng上述1.7kb GUS基因片段使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌JM109菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌细胞在含100μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml X-Gal的LB培养基上进行培养。
合成具有下列核苷酸序列(包含基于pBluescript KS(寡核苷酸K)和GUS基因(寡核苷酸M)的核苷酸序列)的寡核苷酸M和K，并作为引物，与上述转化体的白色菌落悬浮液一起，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸M:5’-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3’(17mer)寡核苷酸K:5’-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT-3’(21mer)然后将扩增的DNA片段在4.0％Nusieve琼脂糖凝胶(FMCBioProducts)上进行分离。选择显示410bp的DNA片段扩增的克隆用于进一步的构建。取2μg经纯化的质粒DNA，用20U SalⅠ和20U BamHⅠ完全消化，然后将DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶(DojindoLaboratories)上进行分离。切下大小大约1.7kb的DNA条带，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)纯化胶块所含DNA片段。取2μgpBICR16G6PT，用20U SalⅠ和20U BamHⅠ消化，并用碱性磷酸酶(Takara Shuzo有限公司)进行去磷酸化。将50ng载体DNA和20ng上述1.7kb的DNA片段使用连接试剂盒进行连接反应后，将连接产物导入大肠杆菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受态细胞，并将经转化的细菌在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基上进行培养。
合成具有下列核苷酸序列的寡核苷酸U和K，并作为引物，与上述转化体的白色菌落悬浮液一起，进行PCR(40个循环94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸U:5’-GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC-3’(34mer)寡核苷酸K:5’-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT-3’(21mer)然后将扩增的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶(Dojindo Laboratories)上进行分离。选择显示大约1.1kb的DNA片段扩增的克隆用于进一步的实验(pBICR16G6PTG)。将包含pBICR16G6PTG的细菌克隆用2ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基于37℃培养过夜。然后，将预培养物接种500ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基，并于37℃培养过夜。以8000rpm离心10分钟收集细菌细胞，并使用QIAGEN质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司)纯化质粒DNA。pBICR16G6PTG或pBICR16G6PTΔG中包含的SEQ ID NO:7中的本发明启动子可以换成实施例8中所述启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子(自然(Nature)313:810-812)或NOS启动子(核酸研究(Nucleic Acid Res.)11(2):369-385,1983)交换。(2)使用转基因烟草的GUS基因表达的确认如实施例2(2)所述，将一片无菌培养的烟草叶片(0.7cm2)在包含实施例8和9的表达载体的土壤杆菌培养物(在含50μg/ml卡那霉素的YEB液体培养基中于30℃培养过夜)中浸泡2分钟，用无菌滤纸吸去多余液体后，放置在MS-NB培养基上。于25℃共培养5天(光照16小时，黑暗8小时)后，将叶片用MS液体培养基清洗，并放置于MS-NBC培养基上。再培养5天后，将叶片转移到含选择药物的MS-NBCK培养基上，并静止培养大约1个月。从叶片上切下再生芽，并在MS-CK培养基上进行次培养。大约1个月后，将生根的个体种植于土壤中以获得自花授粉的种子。可以如实施例3所述在上述转基因烟草中确认GUS基因。同样可以通过实施例4中所述方法确认基于本发明终止子的GUS表达活性。(3)使用基因轰击的GUS基因表达的确认使用实施例5描述的Morikawa等人的方法(C.M.基因枪系统，Rehbock公司，东京，日本)，可以将载体DNA导入大豆体细胞胚。至于对照实验，可以以相同方式导入pBI221(Clontech Laboratories公司)。将经轰击的大豆体细胞胚于25℃放置24小时，并用GUS染色缓冲液于37℃浸泡过夜。在经上述载体轰击的大豆体细胞胚中观察到强GUS染色图案。
实施例中使用的培养基的组成如下(1)植物培养基(ⅰ)MS琼脂培养基(用于烟草)将4.4g MURASHIGE AND SKOOG基本培养基(Sigma Chemical公司)和30g蔗糖溶于1L蒸馏水，用1N KOH调至pH5.8，补加8g琼脂(Wako Pure Chemical Industries公司)，然后高压灭菌。(ⅱ)MS-NB琼脂培养基MS琼脂培养基补充0.1μg/ml 1-萘乙酸(NAA)和1.0μg/ml 6-苄氨基嘌呤(BA)。(ⅲ)MS-NBC琼脂培养基MS-NB琼脂培养基补加300μg/ml头孢噻肟。(ⅳ)MS-NBCK琼脂培养基MS-NB琼脂培养基补加100μg/ml卡那霉素和300μg/ml头孢噻肟。(ⅴ)MS-CK琼脂培养基MS琼脂培养基补加100μg/ml卡那霉素和300μg/ml头孢噻肟。(ⅵ)MS琼脂培养基(用于拟南芥)将4.4g MURASHIGE AND SKOOG(Sigma Chemical公司)和20g蔗糖溶于1L蒸馏水，用1N KOH调至pH6.3，补加2g Gellan gun(WakoPure Chemical Industries公司)，然后高压灭菌。(ⅶ)CIM琼脂培养基MS琼脂培养基补加0.5μg/ml 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和0.05μg/ml激动素。(ⅷ)SIMC琼脂培养基MS琼脂培养基补加5μg/ml N6-(2-异戊烯基)腺嘌呤(2-iP)、0.15μg/ml吲哚乙酸(IAA)、和300μg/ml头孢噻肟。(ⅸ)SIMCH琼脂培养基SIMC琼脂培养基补加20μg/ml潮霉素。(2)细菌和噬菌体培养基(ⅰ)LB培养基将10g细菌用胰蛋白胨(Difco Laboratories)、5g细菌用酵母提取物(Difco Laboratories)、和10g NaCl溶于1L蒸馏水，用5N NaOH调pH7.0，并高压灭菌。当用于平板时，在高压灭菌前加入15g琼脂。(ⅱ)YEB培养基将5g细菌用牛肉提取物(Difco Laboratories)、1g细菌用酵母提取物(Difco Laboratories)、5g多蛋白胨、5g蔗糖、0.2ml 10N NaOH溶于1L蒸馏水，高压灭菌，然后在使用前加入0.2ml过滤除菌的1MMgSO4。当制备琼脂培养基时，在高压灭菌前加入15g琼脂。
发明效果根据本发明，提供了能够在植物中有效表达感兴趣基因的启动子和终止子。
序列表<110>Sumitomo Chemical Co.Ltd.<120>植物启动子和终止子<130>P149669<160>9<210>1<211>2052<212>DNA<213>Daucus carota L.<220><221>启动子<222>(1)...(2052)<400>1catgtgtgcc ctacagcaca tagggcctgt ttggttgaga gaagcagaag ctgcttctga 60cttcttcttc ttttgacctg tttgtataaa gaagtagaaa tatttttaaa aagctgcgaa120tactaacttc tctctcacaa cttccgcttc ttttccaaac actttattaa cttttttact180tctcatttct actccacttc tttgctataa gcaagaaatc acttctttta agctaaccca240aacggcctca ataaaagatc attcataaat gtatctttca attttaggat aacaatacgt300gaacagggtt attttttaac gtgtcaacaa attctaataa ttttacctgg ccggtgaaca360ccgtcttcca agataatata ttttaatttt gtagcctccc ttttaaccaa attcgcatgc420aggacgactt aggtgaatac acattgtact gtgagtcttt aaacaaagaa caagtggttc480atgctcagcc atcaaaattg acaaaacccg acacaacact ctatccacgt actatacttt540tggccgaatg cttctcaaaa tgttttttat atgtaaaata atgcccatcc aaggataagt600aaaattcccg tttaaccagt ttgttaatat atatgtttac acttacaaga ggatattcgt660aatactttta gacgacaaga gacttaggtc aaaaatggac gctggtaaac agcctagact720tggtcactga taaatagata attgttagta 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300gaacagggtt attttttaac gtgtcaacaa attctaataa ttttacctgg ccggtgaaca 360ccgtcttcca agataatata ttttaatttt gtagcctccc ttttaaccaa attcgcatgc 420aggacgactt aggtgaatac acattgtact gtgagtcttt aaacaaagaa caagtggttc 480atgctcagcc atcaaaattg acaaaacccg acacaacact ctatccacgt actatacttt 540tggccgaatg cttctcaaaa tgttttttat atgtaaaata atgcccatcc aaggataagt 600aaaattcccg tttaaccagt ttgttaatat atatgtttac acttacaaga ggatattcgt 660aatactttta gacgacaaga gacttaggtc aaaaatggac gctggtaaac agcctagact 720tggtcactga taaatagata attgttagta taatatagta ggatctacaa tgacattaaa 780attagagcta ttaattaagt tactaataaa taagagaggt tagtaaacag aaagcaggta 840aaaacaagag cttgctgctg tgtgtttagt tgttgtgcat ttctttaaaa gtaatgtaaa 900ctgatctaaa gcacatagaa atttagtaca ggttaaaact tttacaagaa tttatattaa 960acgaaaatca ttttataaca tgtctctcgg ctgtcattat aatagggatc acttactgat 1020catccattaa aaccttgtta aaacaaattc aatgagataa aatatcttac aatgaaaaga 1080aggacaatgt ctctttgaaa aaacaaatag gtactccctc cgtccctctg aaatgtatac 1140atatggattg gacacggaga 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2056<210>6<211>739<212>DNA<213>Daucus carota L.<220><221>cDNA(14)…(478)<300><301>Mika Yamamoto<302>与细胞间致病相关(PR)蛋白和花粉变应原高度同源的胡萝卜主要根部蛋白<303>植物细胞生理学<304>38<305>9<306>1080-1086<307>D883881993-12-241995-07-25<400>6cattctaaat atc atg ggt gcc cag agc cat tca ctc gag atc act tct 49met gly ala gln ser his ser leu glu ile thr ser5 10tca gtc tcc gca gag aaa ata ttc agc ggc att gtc ctt gat gtt gat 97ser val ser ala glu lys ile phe ser gly ile val leu asp val asp15 20 25aca gtt att ccc aag gct gcc ccc gga gct tac aag agt gtc gat gtt145thr val ile pro lys ala ala pro gly ala tyr lys ser val asp val30 35 40aaa gga gac ggt gga gct gga acc gtc aga att atc acc ctt ccc gaa193lys gly asp gly gly ala gly thr val arg ile ile thr leu pro glu45 50 55 60ggt agc cca atc acc tca atg acg gtt agg act gat gca gtg aac aag241gly ser pro ile thr ser met thr val arg thr asp ala val asn lys65 70 75gag gcc ttg aca tac gat tcc aca gtc att gat gga gac atc ctt cta289glu ala leu thr tyr asp ser thr val ile asp gly asp ile 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1．包含下面的DNA(a)或(b)、特征为能够在植物细胞中发挥功能的启动子(a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA，或(b)包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入，并且与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:7所示核苷酸序列中由250个或更多碱基组成的任何区域核苷酸序列同一性超过90％的核苷酸序列的DNA，该DNA的生物学功能与上述DNA(a)等效。
2．包含下面的DNA(a)或(b)、特征为能够在植物细胞中发挥功能的终止子(a)包含SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA，或(b)包含在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入，并且与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中由250个或更多碱基组成的任何区域核苷酸序列同一性超过90％的核苷酸序列的DNA，该DNA的生物学功能与上述DNA(a)等效。
3．特征为包含以能够发挥功能的形式彼此连接的权利要求1的启动子和目的基因的嵌合基因。
4．特征为包含以能够发挥功能的形式彼此连接的权利要求1的启动子、目的基因、和权利要求2的终止子的嵌合基因。
5．特征为包含权利要求1的启动子的载体。
6．特征为包含权利要求1的启动子和目的基因的载体。
7．特征为包含权利要求1的启动子、目的基因、和权利要求2的终止子的载体。
8．产生转化体的方法，其特征为包含将权利要求1的启动子、权利要求3或4的嵌合基因、和权利要求5、6、或7的载体中的任何一种导入宿主细胞的步骤。
9．特征为携带已导入宿主细胞中的权利要求1的启动子、权利要求3或4的嵌合基因、和权利要求5、6、或7的载体中的任何一种的转化体。
10．权利要求9的转化体，其特征为宿主细胞是微生物细胞或植物细胞。
11．表达基因的方法，其特征为包含将权利要求1的启动子和位于该启动子下游的目的基因导入宿主细胞的步骤，和在宿主细胞中在所述启动子的控制下表达该目的基因的步骤。
12．表达基因的方法，其特征为包含将权利要求2的终止子和位于该终止子上游的目的基因导入宿主细胞的步骤，和在宿主细胞中在所述终止子的控制下表达该目的基因的步骤。
全文摘要
本发明涉及:(1)包含下面的DNA(a)或(b)、特征为能够在植物细胞中发挥功能的启动子:(a)包含SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶7所示核苷酸序列的DNA,或(b)包含在SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶7所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入,并且与SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶7所示核苷酸序列中由250个或更多碱基组成的任何区域核苷酸序列同一性超过90%的核苷酸序列的DNA,该DNA的生物学功能与上述DNA(a)等效;(2)包含下面的DNA(a)或(b)、特征为能够在植物细胞中发挥功能的终止子:(a)包含SEQ ID NO∶2所示核苷酸序列的DNA,或(b)包含在SEQ ID NO∶2所示核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代、或加入,并且与SEQ ID NO∶2所示核苷酸序列中由250个或更多碱基组成的任何区域核苷酸序列同一性超过90%的核苷酸序列的DNA,该DNA的生物学功能与上述DNA(a)等效。根据本发明,提供了能够在植物中有效表达基因的启动子和终止子。
文档编号C12N15/82GK1321198SQ99811630
公开日2001年11月7日 申请日期1999年9月28日 优先权日1998年10月2日
发明者西川聪美, 大江田宪治 申请人:住友化学工业株式会社