专利名称：制造插入突变的方法
没有适用的可交叉参考的相关申请。
没有适用的联合提出的研究或开发文献。
背景技术：
将外源核酸有效地插入到细胞的染色体中和染色体外核酸中，是分子生物学领域所期望的技术，以鉴定参与表达肽和蛋白质或调节它们表达的染色体区域。它同样也可有利地用于开发新型治疗剂和药剂。
一种常用的方法是依靠体内Tn5诱变，来将感兴趣的多核苷酸插入到细胞DNA中，并构建在随机或准随机位置含插入的多核苷酸的细胞文库。体内的Tn5诱变方法需要靶细胞能编码转座酶，无论其是天然的或是从引入的表达构建物中产生的。另外，可能需要构建适合于各种靶细胞类型的表达系统。这非常耗时而且需要对各种靶细胞类型有非常广泛的了解。
在许多情况中，编码转座酶的基因是由活性转座子编码的，在初始所需的诱变步骤后，它可在靶细胞中连续转座。这种不需要的多余转座作用是不理想的，它使插入突变文库的分析复杂化。
另外，许多体内Tn5诱变方法依赖复杂的生物机理将外源DNA引入到靶细胞，如λ噬菌体转导噬菌体或接合质粒。期望能够避免如此复杂生物系统的需要。
Shoji-Tanaka,A.,等人，B.B.R.C.203:1756-1764(1994)描述了用纯化的逆转录病毒整合酶介导基因转移入小鼠细胞。
Kuspa,A.和W.F.Loomis,P.N.A.S.U.S.A89:8803-8807(1992)和其它文献已描述了通过电穿孔酶切核酸连同将切割酶引入靶细胞，将用限制性内切酶线性化的质粒特异性整合到基因组限制位点。
发明概述本发明涉及将可转座的多核苷酸有效地插入到靶细胞染色体中或染色体外核酸的随机或准随机位置的方法，包括在靶细胞中将细胞核酸与突触复合物接合的步骤，所述的突触复合物包含(a)Tn5转座酶蛋白质，其复合有(b)多核苷酸，该多核苷酸包括一对适合于与Tn5转座酶可操纵性相互作用的核苷酸序列，和这对核苷酸序列间的可转座核苷酸序列(在介导转座入细胞DNA的条件下)。在此方法中，在不利于或阻止突触复合物(其已准备好从实际进行的生产性转座中转座)的条件下，可在体外形成突触复合物。可用超活性转座酶或可转座多核苷酸(存在Tn5转座酶时，其含有的序列特别适合有效转座作用)或这两种方法，来提高可转座核苷酸序列生产性转座入靶核酸的频率。
本发明还涉及形成细胞文库的方法，由插入性突变组成，包括在许多靶细胞中将细胞核酸与上述突触复合物联合的步骤，并筛选含插入突变的细胞。
另一方面，本发明还涉及细胞文库，其含有按上述方法形成的插入突变。可筛选这种在基因组中含随机和独立突变插入物的细胞群，以选择出那些包含插入突变的细胞，其能诱导相对于未经受插入性诱变的细胞的表型或基因型变化。
本发明的优点是用于形成突触复合物的这种可转座多核苷酸可无任何侧翼序列的转座子DNA构成。这有利于降低分子内转座的可能性并增加靶基因组中转座的可能性。另外，去除多核苷酸的供体主链(DBB)序列简化了可用于本方法的转座子序列的制备。
本发明的另一优点是可在不利于非生产性分子内转座发生的条件下，形成突触复合物。这有利于在与细胞DNA结合时，几乎所有突触复合物能进行转座。如果有的话，只有极少突触复合物中的核酸是无活性的。
本发明的另一特征是启动转座的条件只是在突触复合物存在于靶细胞的靶核酸中后才具备。
本发明的其它目的、优点和特性在以下详述中将会明了。
附图简述
图1．显示了将突触复合物转移到靶细胞中，然后选择插入突变。
图2．用于本方法的优选转座酶。
图3．显示了可用于本发明转座多核苷酸序列的转座子末端序列。
图4．显示了带嵌合末端的和其间的转座核酸序列的转座子或可转座多核苷酸序列。
发明详述国际申请No.PCT/US97/15941(国际
发明者W·S·列兹尼科夫, I·Y·戈雷申 申请人:威斯康星校友研究基金会