黑皮质素－4受体基因及其作为动物脂肪含量、体重增加和/或饲料消耗的遗传标记的用途的制作方法

专利名称：黑皮质素－4受体基因及其作为动物脂肪含量、体重增加和/或饲料消耗的遗传标记的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及遗传评价动物的方法，该方法是测定至少一个预示脂肪含量、生长速度和饲料消耗等一种或多种特征的遗传标记的存在。具体地说，该方法是分析预示这些特征的黑皮质素-4受体(MC4R)基因的差异。更具体地说，该方法分析的是MC4R基因的多态性。
背景技术：
消费者对低脂肪含量肉制品的需求正在增加。科学文献中积累的证据更刺激了这一需求，因为这些证据表明，大量消耗动物脂肪(尤其是高比例的饱和脂肪酸)会有明显的健康危害，包括患心血管疾病的危险。与高脂肪肉类有关的其它健康问题包括其胆固醇含量较高，且加入了较高量的盐(加入盐是为了改善结合特性，因为盐有助于从肉中萃取出天然的水结合性组分肌球蛋白)。而且，大量消费者发现肉制品含有诸如磷酸盐、乳化性添加剂以及抗氧化剂等不太能接受的化学添加剂。
面对寻求更健康的肉制品的消费者，肉制品生产商不断被迫要提供更廉价和健康的肉制品。
更廉价的制品当然来自降低生产成本。生产商对提高动物生长速度和饲料消耗很感兴趣。降低生产成本来源于在更短时间内到达市场以及喂养动物的成本更低。这能提高牲畜业的边际利润，和/或导致给消费者的价格降低。
通过选出具有上述特征的动物，生产商能饲养出具有这些所需特征的动物。选择所需特征的传统方法是采用育种技术。
个别产肉动物和动物群中存在遗传差异，育种技术可利用该差异来获得具有所需特征的动物。例如，已知中国品种具有较早到达青春期以及幼崽体格大的特点，而美国品种具有生长速度较高和瘦的特点。因此，希望将这两种品种的最佳特征组合起来，以改进猪肉的生产。
然而，所需特征的遗传率通常很低。例如，幼崽体格的遗传率约为10-15％。标准的育种方法是根据表型差异来选择个体的，该技术没有充分考虑到存在的遗传差异或复杂的基因相互作用。因此，需要有一种方法在细胞或DNA水平上选择瘦肉、生长速度和饲料消耗的特征。该方法将提供一种从基因上评价动物的方法，从而使饲养者能更准确地选出不仅在表型上表现出所需特征、而且表现出有利的潜在基因标准的那些动物。目前，这在很大程度上是通过标记辅助性选择来实现的。
几个研究小组已经用限制性片段长度多态性(RFLP)分析研究了猪DNA。Jung等人(Theor.Appl.Genet，77271-274(1989)，纳入本文作为参考)公开了用RFLP技术来表明两种品种的猪之间的基因差异。证实这些品种中猪白细胞抗原(SLA)I类基因有多态性。Hoganson等人(Abstract for Annual Meeting of Midwestem Section of theAmerican Society of Animal Science，1990年3月26-28日，纳入本文作为参考)报道了关于中国猪主要组织相容性复合体(MHC)基因的多态性，这也得到RFLP分析的证实。Jung等人(Animal Genetics，2679-91(1989)，纳入本文作为参考)报道了关于某些公猪中SLA I类基因的RFLP分析。该文作者声称，这些结果表明猪SLA/MHC I类基因与生产和行为表现特征之间有关联。他们还声称，将来可用SLAI类限制性片段作为基因标记来改善猪生长的行为。
跟踪具体的有利的等位基因的能力涉及一种耗时很长的新方法，该方法是鉴定主要效应基因DNA的分子标记。标记可与具有主要效应的单个基因连锁或与具有加性效应的多个基因连锁。DNA标记具有几个优点基因分离容易测定而且是明确的，DNA标记是共显性的，即可以区别地鉴定出杂合的和纯合的动物。一旦建立了标记系统，就能非常容易地作出选择决定，因为DNA标记可在收集得到单个动物幼儿的组织或血样后随时测定。
受体基因的基因差异已被用作一种有价值的用于选择的标记系统。例如，美国专利5,550,024和5,374,526(授予Rothschild等人)公开了在猪雌激素受体基因中的多态性(其与较大的幼崽体格相关)，该文内容纳入本文作为参考。美国专利申请08/812,208公开了在猪促乳素受体基因中的多态性标记，它们与较大的幼崽体格以及整体繁殖效率有关。
从前述内容可以看出，需要一种选出具有改善的代谢特征(如脂肪含量、生长速度和饲料消耗)的动物的方法。
发明概述本发明的一个目的是提供一种基于MC4R基因或在MC4R基因内的基因标记，该MC4R基因预示脂肪含量、生长速度和/或饲料消耗。
本发明的另一个目的是提供一种确定该基因标记存在的测定方法。
本发明还有一个目的是提供一种评价动物的方法，该方法提高了选择和育种方法针对所需特征的准确性。
本发明还有一个目的是提供一种PCR扩增试验，该试验将大大加速标记存在的测定。
本发明还有一个目的是提供一个用来评价动物DNA样品中待鉴定的基因标记的试剂盒。
在阅读了本发明下面的描述和权利要求后，这些和其它目的、特征和优点将是显而易见的。
本发明涉及一个发现，即，黑皮质素(melanocortin)4受体(MC4R)基因中存在与动物脂肪含量、生长速度和饲料消耗特征相关的多态性。根据本发明，MC4R多态性与特征的联系使得特定的品种或遗传系的基因标记能被鉴定。用鉴定该多态性的TaqI限制图谱来测定与所需代谢特征相关的标记是否存在。品种依赖型标记基因型(即在一些品种中是标记，在其它品种中不是标记)由MC4R内的多态性组成，PCR产物678位的鸟嘌呤变为腺嘌呤(MC4R蛋白的298位氨基酸发生从天冬氨酸密码子(GAU)到天冬酰胺密码子(AAU)的错义突变)。本发明包括检测标记以及多态性的序列特征的试验，还包括MC4R基因中可设计用于该试验的扩增引物的新序列。另外，本发明还包括一种在育种程序中用该试验选择动物的方法以及进行该试验的试剂盒。
定义本文所用的术语“低脂肪含量”或“瘦的”指体内脂肪相对于给定群体的平均值而言在生物学上明显减少。
附图简述

图1是猪中MC4R的序列表(SEQ ID NO1)。“X”代表多态性位点。
图2表示人(SEQ ID NO2)和猪(SEQ ID NO3)MC4R基因之间的DNA序列比较。
图3表示人(SEQ ID NO4)和猪(SEQ ID NO5)MC4R基因之间的氨基酸序列比较。
图4a，4b和4c是CRI-MAP的MC4R的连连锁报道。
图5显示了猪MC4R基因的部分核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO12)。氨基酸翻译显示出密码子298位有氨基酸置换。
图6是PCR产物的TaqI消化的电泳凝胶。每个泳道顶部指出了分子标记(M)和MC4R基因型。
图7显示了猪MC4R的推定的第7个跨膜结构域与其它MCR和GPCR的多重序列对比。“*”代表猪MC4R的预计的序列位置。其它氨基酸序列从GenBank数据库获得(登录号为P32245，P70596，P41983，P56451，P34974，P41968，P33033，Q01718，Q01726，Q28031，AF011466，P21554，P18089，P30680，P47211)。猪MC4R中氨基酸N被D置换的错义变化位置用箭头标出。Asp(D)残基在MCR中是高度保守的，Asn(N)残基在其它大多数GPCR中是高度保守的。
较佳实施方案详述肥胖是影响能量平衡的疾病。能量代谢的控制很简单将过多的能量储藏为脂肪以及控制能量以免过多的能量储藏，即肥胖。尽管几个基因和信号转导系统涉及肥胖，但是对于能量稳态机理和基因多态性的相互联系还知之甚少。现已表明，黑皮质素-4受体(MC4R)是长期体重稳态的重要调节者。MC4R拮抗剂在长期给予期间能增加摄食量和体重。Skuladottir，G.V，等人“新的黑皮质素4受体选择性拮抗剂的长期增食欲效应”，British J.of Pharm.126(1)27-34(1999)。
Lu等人(1994)通过研究黑皮质素受体对刺豚鼠肥胖综合征的拮抗性，指出它参与控制饲料摄入和能量平衡。Huszar等人(1997)发现黑皮质素-4受体基因(MC4R)的失活导致小鼠产生成熟期发病的肥胖综合征，并证实MC4R蛋白在调节与刺豚鼠肥胖综合征有关的能量平衡中起主要作用。另外，MC4R蛋白调节还传递瘦小蛋白(leptin)的作用(能量稳态中的一种重要的信号转导分子)(Seeley等人，1997)。
本发明已经确定了MC4R基因中的变化或多态性的位置，该遗传(基因)差异与脂肪含量、生长速度和/或饲料消耗等代谢特征的表型差别有关。
在本发明的一个实施方案中，提供了一个试验来检测所需基因型的存在。该试验包括利用引物以及标准技术(如聚合酶链反应(PCR))来扩增从血液、组织、精液或遗传物质的其它常规来源纯化的基因组DNA，然后用限制性酶(如TaqI)消化该DNA，从而产生长度不同的基因片段，将至少一些片段与其它片段分离(例如用电泳)。
还可这样来检测片段，使含有所有或至少部分MC4R基因cDNA序列的核苷酸探针(例如放射性标记的cDNA探针)与分离的片段杂交，然后将杂交结果与已知具有标记的基因序列或已知不具有标记的基因序列的试验结果比较。根据已知的和已公开的MC4R序列来选择和使用检测MC4R序列的探针是本领域技术人员通常所知道的。探针可以是任何与分离的消化产物杂交并能被检测的序列。
本发明的另一个实施方案提供了一种用来测定MC4R基因序列中基因标记存在的试剂盒。该标记能预示脂肪含量、生长速度和/或饲料消耗等可遗传的特征。在一个较佳的实施方案中，该试剂盒还包括新的PCR引物，该引物具有在多态性(位点)任一侧的4-30个毗连的碱基，从而提供了一个扩增系统，该系统可通过PCR以及PCR产物的TaqI消化来检测TaqI多态性。较佳的引物是SEQID NO8和SEQ ID NO9。
另一个实施方案包括一种育种方法，该方法是对待选的不同动物或动物胚胎的多个基因序列进行上述类型的试验，并根据结果将某些动物选出或排除在育种程序外。
本发明公开了可用TaqI限制图谱来鉴定的MC4R基因中的多态性。如本领域中所知道的，限制图谱并不能确切地决定片段大小，它只是近似的。对于纯合基因型(等位基因1)，多态性可通过PCR产物TaqI消化获得的三个条带(466、225和76碱基对(bp))来鉴定；对于另一纯合基因型(等位基因2)，可通过两个条带(542和225碱基对)来鉴定；对于杂合基因型，可通过四个条带(542、466、225和76碱基对)来鉴定。瘦肉型和摄食量较少的标记可通过466/225/76碱基对来鉴定，但中国猪除外，其瘦肉型的标记为542/225条带。体重增加较快的标记可通过542/225条带来鉴定。
另外，已经在核苷酸水平上鉴定了与图谱有关的多态性。对多态序列TaqI位点以及整个周围区域进行了测序。见SEQ ID NO1。多态性周围的序列有助于开发PCR试验，从紧靠多态性的序列中取出大约4-30个毗连碱基作为用于聚合酶链反应的引物，以便在TaqI限制酶处理前大量扩增该区域。引物无需完全互补；基本上等价的序列是可接受的。
从序列数据观察到，在等位基因2中，PCR产物678位的鸟嘌呤被腺嘌呤置换，或MC4R蛋白的298位氨基酸从天冬氨酸密码子(GAU)变为天冬酰胺密码子(AAU)。多态性的PCR试验采用正向引物5′-TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3′(SEQ IDNO6)和反向引物5′-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3′(SEQ ID NO7)。所用的猪特异性引物是正向引物5′-TTA AGT GGA GGA AGA AGG-3′(SEQ ID NO8)和反向引物5′CAT TAT GAC AGT TAA GCG G-3′(SEQ ID NO9)。得到的扩增产物约有750碱基对，当用TaqI消化后，得到466、225和76碱基对(等位基因1)的等位基因片段，或542和225碱基对(等位基因2)的等位基因片段。
标记可用任何本领域普通技术人员已知的鉴定标记存在与否的方法来鉴定，这些方法例如包括单链构象多态性分析(SSCP)、RFLP分析、异源双链分析、变性梯度凝胶电泳、和温度梯度电泳、连接酶链反应或甚至是直接对MC4R基因进行测序，并检查TaqIRFLP识别图谱。
还可采用一种或多种附加的限制酶和/或探针和/或引物。附加的酶、构建的探针和引物可由本领域普通技术人员通过常规实验来确定。
其它可能采用的技术包括非凝胶系统，如TaqManTM(Perkin Elmer)。在该系统中，设计出侧接感兴趣突变并能PCR扩增该区域的寡核苷酸PCR引物。然后，设计第三个寡核苷酸探针与一区域杂交，该区域含有不同等位基因发生变化的碱基。该探针的5′和3′端用荧光染料标记。选择这样的染料，当它们彼此接近时，其中之一的荧光被另一个淬灭而不能被检测到。用Taq DNA聚合酶从模板上5′端的PCR引物相对于探针进行延伸，结果导致与退火探针5′端相连的染料通过Taq DNA聚合酶的5′核酸酶活性而断裂。这除去了淬灭效应，使得探针3′端的染料荧光能被检测。通过以下事实可区分不同的DNA序列如果探针与模板分子的杂交不完全，即有某种形式的错配，则染料不会发生断裂。因此，只有当寡核苷酸探针的核苷酸序列与待与其结合的模板分子完全互补时，淬灭效应才会除去。反应混合物可含有两种不同的探针序列，每一序列针对不同的可能存在的等位基因进行设计，从而使得两种等位基因能在一个反应中被检测到。
尽管采用RFLP是检测多态性的一种方法，但是也可用本领域普通技术人员已知的其它方法。这些方法包括通过检测形成的基因产物的差别来分析多态性基因产物并检测多态性的方法。
尽管分离限制性片段的较佳方法是凝胶电泳，但是也可采用本领域技术人员已知的其它方法来分离并测定限制性片段的大小。
可用其它DNA标记来间接地选择多态性。可在其它DNA标记的特异性等位基因与已知和上述表明与特定特征有关的MC4R基因相关的DNA标记的等位基因之间建立连锁关系。与MC4R基因连锁的已公开的PiGMaP染色体图上的标记例子包括S0331，BHT0433和S0313。
可将适合采用本发明方法的试剂包装成合适的试剂盒。该试剂盒提供了所需的材料，这些材料包装在合适的容器内。该试剂盒最少含有鉴定与感兴趣的特征(脂肪含量、生长速度和饲料消耗)有关的MC4R基因中多态性的试剂。较佳的，鉴定多态性的试剂是与MC4R基因或其片段杂交的PCR系列(一套引物、DNA聚合酶和四种三磷酸核苷)。较佳的，试剂盒中包括PCR系列以及在至少一处切割MC4R基因的限制酶。较佳的，该试剂盒还包含其它手段，例如用来检测或测定可检出物或提供对照的试剂。如果需要，还可包括用于杂交、预杂交、DNA萃取、显色和相似目的的其它试剂。
本发明的基因标记、方法和试剂盒可用于育种程序来改善动物品种、品系或群体中的脂肪含量、生长速度和饲料消耗等特征。对与特定特征相关的所需多态性至少呈杂合(较佳的是纯合的)的动物进行连续选择和育种，将会产生具有所需特征的品种、品系或群体。因此该标记是选择工具。
提供下列实施例的目的是为了描述，而非限制本发明。
实施例1黑皮质素4受体PCR-RFLP测试-MC4R基因的TaqI多态性和基因连锁图谱引物用来自人和大鼠MC4R序列的同源区(GenBank登录号分别为s77415和u67863)设计引物。用这些引物来扩增猪MC4R基因的750bp序列。
MC4R15′-TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3′(SEQ ID NO6)MC4R45′-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3′(SEQ ID NO7)PCR条件混合物1 10X Promega缓冲液 1.0微升25mM MgCl20.6微升dNTP混合物(各为2.5mM) 0.5微升25皮摩尔/微升MC4R1 0.1微升25皮摩尔/微升MC4R4 0.1微升dd无菌水7.5微升Taq聚合酶(5U/微升) 0.07微升基因组DNA(12.5毫微克/微升) 1.0微升将10微升混合物1与DNA混合在反应试管中，然后覆盖上矿物油。进行下列PCR程序94℃2分钟；35轮的94℃30秒，58℃1分钟，和72℃1分30秒；最后在72℃下延伸15分钟。
在标准的1％琼脂糖凝胶上检查5微升PCR反应产物，以确认扩增成功，并清除负对照。产物大小约为750碱基对。用下列程序进行消化。
TaqI消化反应10微升反应物PCR产物 5.0微升10XTaqINE缓冲液 1.0微升BSA(10毫克/毫升)0.1微升TaqI酶(20U/微升)0.5微升dd无菌水3.4微升制得缓冲液、酶、BSA和水的混合物。在每个含有DNA的反应管中加入5微升。然后65℃培育混合物至少4小时至过夜。将加载染料与消化反应物混合，将全部体积上样于3％琼脂糖凝胶上。等位基因1的主要条带约为466、225和76bp。等位基因2基因型的条带为542和225bp。杂合基因型具有等位基因1和2。
结果扩增的PCR产物约为750bp。PCR产物的序列确PCR产物是MC4R基因，在氨基酸和DNA水平上与对应的人序列分别有97.6％和92.2％的相同性(见图2和3)。
PCR产物的TaqI消化产生了466、225和76bp的等位基因片段(等位基因1)，或542和225bp的片段(等位基因2)。杂合的基因组具有两种等位基因。在用来通过连锁分析描绘该基因图谱的三种三代国际参照家族中观察到孟德尔遗传。
PCR产物678位的G到A的转换所导致的等位基因1和等位基因2之间的多态性解释了MC4R蛋白298位氨基酸从天冬氨酸密码子(GAU)到天冬酰胺(AAU)的错义突变(见图1，SEQ ID NO1)。
通过少数不同品种的动物的DNA样品的基因型，确定等位基因频率(表1)。发现等位基因1在Meishan中的频率为1，而在Hampshire和Yorkshire中没有或频率很低。等位基因1在Landrace和Chester White中的频率分别为0.5。
图2和图3描述了人和猪MC4R基因的DNA和氨基酸序列之间的差别(SEQ IDNO2-5)。
表1不同猪品种中等位基因1的频率
连锁分析对国际参照家族的基因型进行两点和多点连锁分析。见图4a-4c。用CRI-MAP程序分析数据。MC4R明显与猪染色体(SSC)1上的几个标记连锁。通过两点连锁分析，连锁最接近的标记(重组分数，括号内是LOD评分)是S0331(0.02，21.97)、BHT0433(0.02，21.32)和S0313(0.00，17.76)。多点连锁分析产生了标记和MC4R的最佳图谱次序(距离为Kosambi cM)KGF-5.8-CAPN3-2.5-MEF2A-6.1-MC4R-5.6-S0313。
用一组猪和啮齿类动物的体细胞杂交体为MC4R分配一个细胞遗传学区域。猪特异性引物的PCR产物在克隆7、8、16、18和19中进行扩增。MC4R的位置在SSClq22-27。
实施例2用猪特异性引物和猪MC4R基因的基因连锁图谱进行MC4R受体PCR-RFLP测试猪特异性引物序列正向引物5′-TTA AGT GGA GGA AGA AGG-3′(SEQ ID NO8)反向引物5′-CAT TAT GAC AGT TAA GCGG-3′(SEQ ID NO9)消化方法用在10微升最终体积中的下列物质进行PCR反应。
猪基因组DNA12.5ng
lxPCR缓冲液MgCl21.5mMdNTP0.125mM正向引物0.3μM反向引物0.3μMTaq DNA聚合酶(Promega) 0.35UPCR过程包括，在Robocycler(Statagene，La Jolla，CA)中，94℃2分钟；35轮的94℃30秒，56℃1分钟，72℃1分30秒；以及72℃15分钟。在10微升总体积中用10U的TaqI65℃培育过夜，消化一份5.0微升PCR产物。在3％琼脂糖凝胶上对消化产物进行电泳。
多态性的描述PCR产物的Taq I消化产生了466、225和76bp的片段(在等位基因1中)，以及542和225bp的片段(在等位基因2中)。杂合的基因型具有等位基因1和2的片段。
遗传方式在三种三代欧洲PiGMaP家族中发现孟德尔遗传的常染色体分离(Archibald等人，1995)。
等位基因频率通过欧洲PiGMaP家族的祖代动物与ISU参照家族的不相关的动物的的基因型，确定等位基因频率。发现等位基因1具有下列频率。
表2不同猪品种中等位基因1的频率
染色体位置用CRI-MAP程序(Green等人，1990)对三个PiGMaP家族的基因型进行两点和多点连锁分析。MC4R明显与猪染色体1(SSC1)上的几个标记连锁。通过两点连锁分析，连锁最接近的标记(重组分数，括号内是LOD评分)是S0331(0.02，21.97)、BHT0433(0.02，21.32)和S0313(0.00，17.76)。多点连锁分析产生的MC4R相对于其它连锁标记的最佳图谱次序如下(距离为Kosambi cM)KGF-5.8-CAPN3-2.5-MEF2A-6.1-MC4R-5.6-S0313。
评价黑皮质素4-受体是表达在脑中的与G-蛋白偶联的7个跨膜的受体。Huszar等人(1997)发现MC4R基因的失活导致小鼠中的成熟期发病的肥胖综合征，并证实MC4R蛋白在调节能量平衡中起主要作用。经图谱确定，MC4R基因位于人染色体18q21.3(Gantz等人，1993)。MC4R基因位于SSC1的位置与以前染色体染色数据相符，表明该染色体与HSA18和15之间的同线性(Goureau等人，1996)。然而，以前从HSA18和15到SSC1测得的数个基因(包括CAPN3、KGF和MEF2A)的基因次序对MC4R并不保守。因此，MC4R在SSC1中的图谱位置可能鉴定了HSA18和15相对于SSC1之间的进化断点。
实施例3标记与增强的代谢特征相关在确定哪个等位基因与哪个特征相关且在哪个品种中的初步研究中，将几个动物品系的基因型与长至110千克的天数、背部脂肪测定、每日体重增加和平均每日摄食量关联起来。用于该研究的猪来自Pig Improvement Company(PIC)的品系。
用上述PCR测试累积MC4R基因的等位基因1和2的数据。收集的数据归纳在下表3-8中。
根据结果，等位基因1在所有品系中明显为瘦肉型等位基因(见P2背部脂肪测定)，除在中国猪中是脂肪型等位基因。在测试的商用品系中，等位基因2与明显较快的增重速度(测试日增重)相关。整体等位基因1与较低的摄食量相关。
表3观察数
总共721MC4R基因型11＝纯合等位基因112＝杂合22＝纯合等位基因2表4观察数(雄性/雌性)
表5至110kg的天数
表6P2背部脂肪(毫米)
表7测试日增重(克/天)
表8平均每天摄食量(千克/天)，仅仅公猪，除仅仅是小母猪的L95外
实施例4猪黑皮质素-4受体(MC4R)基因的错义变体与脂肪、生长和摄食量特征有关为了确定该MC4R多态性是否与表型差异有关，测试了几个不同猪品系的大量动物个体中的突变。生长和行为测试记录的分析表明，MC4R基因型与许多品系的背部脂肪、生长速度和摄食量显著相关。MC4R突变的不同氨基酸残基可能使MC4R功能显著变化。这些结果证实了猪MC4R错义突变的功能意义，并提示模型物种的基因组对比应用于农场动物与人体医学同样重要。
对在leptin和leptin受体中突变的鉴定已经提供了涉及能量平衡调节的一些遗传成分的信息(Zhang等人，1994；Tartaglia等人，1995)。用动物模型进行基因研究有助于鉴定肥胖的主要遗传原因(Andersson1996；Pomp1997；Giridharan，1998)。另外，已经鉴定出其它几个参与能量稳态神经信号转导途径的基因(Flier和Maratos-Flier1998；Schwartz等人，1999)。在参与能量稳态调节的候选信号分子中，最感兴趣的是黑皮质素-4受体(MC4R)。MC4R对于leptin信号的应答是摄食量与体重之间的关联(Seeley，等人，1997；Marsh等人，1999)。中枢神经系统中的神经肽Y(NPY)信号也由MC4R蛋白介导(Kask等人，1998)。MC4R中的数个突变(包括移码和无意义突变)与人显性遗传的肥胖有关(Vaisse等人，1998；Yeo，等人，1998)。人的其它一些MC4R错义突变也已鉴定出来(Gotoda等人，1997；Hinney等人，1999)，但是这些突变的功能意义还未确定。
根据生长特征来选择对于养猪工业非常重要，因为成本与饲养有关，且消费者偏好瘦肉。这些数量性状的有效的基因改进可通过使用标记辅助选择(MAS)并用高密度基因图谱来增强(Dekkers和van Arendonk1998；Rothschild和Plastow1999)。在该方法中，重要的工具是用熟悉的人和小鼠基因图谱来进行比较作图，它能帮助鉴定猪中对应的控制生长和行为特征的基因组区域或主要基因。人或动物模型中复杂特征的生物学知识为牲畜中有经济价值的特征的基因鉴定提供了其它方法。对于脂肪和生长特征，已经成功进行了几个用表型趋异的品种和候选基因分析的数量性状基因座(QTL)连锁扫描(Yu等人，1995；Casas-Carrillo等人，1997；Knorr等人，1997；Knott等人，1998；Rohrer等人，1998；Wang等人，1998；Paszek等人，1999)，但对商用动物群还没有确定对生长和行为特征有主要作用的单个基因。MC4R在摄食量和肥胖中的作用提示，它可能是猪中生长有关的性状的重要基因标记。
材料和方法动物。猪在正常生产条件下由美国和欧洲的nucleus农场中的PIC雇员喂养长大。约70天大时，对猪进行行为测试，13周后停止测试。在试验的最后，用超声波实时(B模式)在第10跟肋骨距中线2厘米处测定背部脂肪。将增加的重量除以测试天数，计算出测试期内平均的日增重(生长)。用标准程序估计长至110千克市场重量的天数，每一个用电子测定设备测定摄食量。
PCR扩增猪MC4R基因片段。从人和大鼠MC4R序列(GenBank登录号分别为s77415和u67863的同源区)设计引物。引物是正向引物5′-TGG CAA TAG CCA AGAACA AG-3′(SEQ ID NO6)和反向引物5′-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3′(SEQID NO7)。用12.5ng猪基因组DNA、1xPCR缓冲液、1.5mM MgCl2、0.125mM dNTP0.3mM各引物、和0.35U Taq DNA聚合酶(Promega)在10微升的最终体积内进行PCI反应。PCR的条件如下在Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)中，94℃2分钟，35轮的94℃30秒，56℃1分钟，92℃1分30秒，最后72℃延伸15分钟。
测序和突变检测。对不同品种的几头猪进行PCR产物测序，并比较序列以检测任何的核苷酸变化。测序在ABI测序仪377(Applied Biosystems)上进行。猪MC4R序列已经提交给GenBank，登录号为AF087937。序列分析揭示一个核苷酸置换位于TaqI限制酶识别位点内(Kim等人，1999)。然后设计一系列引物，以产生较小的MC4R基因片段，该片段只含有一个有信息的TaqI限制性位点，以指定多态性位点并有助于PCR-RFLP测试。这些引物是正向引物5′-TAC CCT GAC CAT CTT GAT TG3′(SEQ ID NO10)和反向引物5′-ATA GCA ACA GAT GAT CTC TTT G-3′(SEQ IDNO11)。
统计学分析。方差分析的程序采用说明农场、测试期、动物性别、MC4R基因型和部位(随机)的固定影响的混合模型。集合所有美国/欧洲品系(品系A-D)的动物用于整个分析，在该分析中，包括原始品系。估计每个基因型的平均效应，结果列于表9-15中。用总体F检验来测定显著性水平。
结果猪MC4R基因中错义突变的鉴定。MC4R基因由包含在一个外显子中的大约1kb的编码序列组成。PCR产生了猪MC4R基因片段的大约750碱基对(Kim等人，1999)。PCR产物的序列确证PCR产物是MC4R基因，它在核苷酸和氨基酸水平上与人MC4R序列分别有92.2％和97.6％的相同性。几个品种的单个动物的序列多重对比鉴定出有一个核苷酸置换(G→A；图5)。多态性揭示有一个错义突变，在与人MC4R蛋白的氨基酸298位相同的位置处，天冬氨酸(GAU)被天冬酰胺(AAU)代替。为了确认这一碱基改变，我们设计侧接多态性位点的猪特异性引物，用TaqIPCR-RFLP凝胶分析多态性(图6)。图6显示了用琼脂糖凝胶电泳分析得到的PCR产物的TaqI消化结果。等位基因1产生了156和70bp的片段作为PCR-RFLP，等位基因2产生了226bp的片段作为PCR-RFLP。杂合体具有等位基因1和2片段。分子标记(M)和MC4R基因型标在每一泳道的顶部。
MC4R错义突变在黑皮质素受体(MCR)中高度保守的区域内。MCR是偶联G蛋白受体(GPCR)的亚族，它含有大多数其它GPCR所共有的某些保守的结构元件，但是MCR和其它GPCR之间的整体氨基酸相同性很低(Tatro 1996)。将猪MC4R蛋白的预期的氨基酸序列与其它动物种类、其它MCR蛋白或典型的GPCR作多重序列对比，结果显示第7个跨膜结构域298位的天冬氨酸在MCR蛋白中高度保守(图7)。然而，感兴趣地注意到，大多数其它GPCR中该位置为天冬酰胺。MCR蛋白彼此间显示出有40-80％的氨基酸相同性(Tatro 1996)，但是第二个胞质内环和第7个跨膜结构域在MCR蛋白中是高度保守的(Gantz等人，1993)。通过在人和小鼠中的天然和实验突变的研究(Robbins等人，1993；Valverde，等人，1995；Frandberg，等人，1998)，已经发现MCR结构与功能之间的一些关系。这些研究表明，在高度保守区域内的一些突变导致结构变化并改变受体的功能。Asp298Asn置换突变对受体的功能有影响。然而，这需要进一步测试，但是已知在MC1R中的同源残基变化(Asp294His)与人的白色皮肤以及红色头发有关(Valverde，等人，1995)。
MC4R错义突变与肥胖相关特征有关。为了研究错义突变的影响，在PIC(一家国际养猪公司)的几个商业猪品系总共1800头猪中，分析MC4R基因型和对生长速度、背部脂肪和饲料消耗差异的影响的关系。动物来自封闭的欧洲/美国品种的商业品系(品系A-D)，还有来自欧洲和中国品种杂交的品系(品系E)。在品系A-D中，发现所有行为特征均与MC4R基因型明显相关。等位基因1纯合的动物平均的背部脂肪(P＜.001)、日增重(P＜.001)和摄食量(P＜.01)明显少于纯合的22基因型动物(表11、13和15)。总之，具有11基因型的猪的背部脂肪比22基因型猪少大约9％(表11)，而22基因型的猪明显比11基因型的猪生长得快(37克/天)(表13)。这些结果看来与食欲有关，因为22基因型动物消耗的比食入的多得多(表15)。在欧洲/美国品种中，清楚地确立了MC4R基因的错义突变与相关的行为特征之间的联系。虽然测试动物的数量小得多，但是在相当肥胖的中国杂交系(品系E)中没有发现这些结果。令人感兴趣的是，品系E显示出背部脂肪的趋势方向与其它品系所观察到的相反(表11)。
讨论本研究清楚地证实，猪MC4R错义突变与猪的几个行为特征明显相关。表现为Asp298(在其它MCR亚型和其它动物种类的MC4R中高度保守的氨基酸)的等位基因1与较小的背部脂肪厚度、较慢的生长速度和较少的摄食量相关联，表现为Asn298的等位基因2则与较肥的、摄食量较高且生长较快的动物相关。由于黑皮质素受体蛋白中的高度保守的残基对于配体结合或胞内信号传递起重要的作用(Tatro 1996)，MC4R变体可能在调节食物摄入和体重中发挥功能上不同的能力。进一步验证该假设将会为MCR功能的结构基础以及治疗人肥胖症的分子靶标提供重要的信息。
等位基因1与品系E中最胖的动物有关，该动物是Chinese Large White品种与Meishan品系杂交获得的。如果突变引起高度保守区域中发生显著的氨基酸变化，那么这令人惊奇。结果可能是由取样引起的。然而，如果我们假设当更多的结果加入时，该结果是显著的，这可能有几种解释。一个可能性或许是背景基因效应(上位性)的不同。由于生长和肥胖是复杂的多基因特征，因此很有可能中国品种具有数百年分离衍生的某些不同的等位基因相互作用，而这些推定的相互作用可能在与相差很大的品系之间的杂交中使多基因特征产生变化(Frankel和Schork 1996)。已经用趋异的品系对肥胖和生长特征进行了几个QTL分析(Cases-Carrillo等人，1997；Knott等人，1998；Rohrer等人，1998；Wang等人，1998；Paszek等人，1999)，但是没有报道说QTL靠近C4R基因座(其图谱位置在染色体1上距离连锁图谱约80cm(数据未显示))。它可能意味着，品系E提示的MC4R等位基因的上位效应使得难以在大多数涉及中国品系和欧洲/美洲品系间杂交的QTL实验中观察到MC4R基因座。有可能某些等位基因的效应会在不同的背景下变化，并且难以在涉及基因趋异品种的QTL实验中检测到。
MC4R变体的效应可通过对该突变在其它猪品种和品系中引起的生物学效应的进一步研究来解释。然而，如果MC4R变体与瘦肉、生长和摄食量有密切的关系，则该突变可被立即用于标记辅助选择(Meuwissen和Goddard 1996)，以开发出满足特定消费者需求的猪品系。例如，在产小猪后食欲通常减退的母猪品系中，MC4R等位基因2的选择能帮助提高摄食量。另外，在一些认为太肥的品系中，可以利用等位基因1的选择，在认为生长太慢的品系中可以利用等位基因2的选择。因此，在猪育种品系中选择MC4R突变的基因型将提高选择与摄食有关的生产特征(包括生长和瘦肉)的效率。候选基因方法也被用来调查猪leptin基因的作用(Jiang和Gibson 1999)。然而，就leptin而言，尽管在商用品种与未改进品系之间杂交的品种中存在leptin多态性与背部脂肪厚度相关的证据，但是在测试的不同的商用品系中却没有清楚的关联(Jiang和Gibson 1999)。因此，不应认为由于找到了一个基因，就可以假定存在一种关系。相反，对于MC4R，我们已经确定，在该候选基因中的变化能够解释猪商用品系中背部脂肪、生长速度和摄食量的明显差异。MC4R的这些结果描述了在牲畜基因组中采用候选基因的对比性基因分析的潜在价值。
MC4R基因型对猪几个生产特征的影响表9长至110kg的天数以及背部脂肪的观察数(雄性/雌性/总数)
表10长至110kg的天数
表11第10根肋骨的背部脂肪(毫米)
表12测试日增重的观察数(雄性/雌性/总数)
表13测试日增重(克/天)
表14平均日摄食量的观察数(雄性/雌性/总数)
表15平均日摄食量(千克/天)，仅仅是公猪，除品系E仅为小母猪外
在参照特定组成、效果理论等描述了本发明后，本领域技术人员显然能明了，本发明并不局限于这些描述性的实施方案或机理，可不脱离所附权利要求所定义的本发明范围或精神进行改动。预计所有这些明显的改动和变化均包括在所附权利要求的本发明范围内。权利要求意味着覆盖了所要求的组分以及能有效满足其目的的任何次序的步骤，除非本文有相反的具体内容。
下列引用文献均全部纳入本文作为参考Andersson LB(1996)“基因和肥胖”，Ann.Med.，285-7.
Arden KC(1990).“促乳素和生长激素受体位于人染色体5的相同区域内”，Cytogenet.Cell Genet.53161-165.
Barinaga M(1996).“研究者明确leptin受体”，Science271913.
Bray GA(1978).Physiol.Rev.59，719-809.
Casas-Carillo E(1997)“对与猪生长速度有关的基因组区域作图谱”，J.Anim Sci752047-2053Chajlani V，“新的人黑皮质素受体的分子克隆”，Biochem.Biophys.Res.Commun.，195，866-873。
Chen H(1995)“糖尿病基因编码leptin受体的证据db/db小鼠中leptin受体基因的突变的鉴定”，Cell 84，491-495。
Chevalet C(1996).CABIOS.正在出版.
Chua SC(1996).Science 271，994-996.
Chung WK(1996).Genome Res，6，431-438.
Cioffi JA(1996).Nature Med.2，585-589。
Cybulsky MI(1991).“人VCAM1基因的基因结构、染色体位置和mRNA可变剪接”Proc.Natl.Acad.Sci.887859-7863。
Dekkers JCM(1998)“用杂交繁殖的群体中鉴定的基因座信息优化定量性状的选择”，Genet Res 71257-275.
Flier JS(1998)，“肥胖和下丘脑新途径的新肽”，Cell 92437-440.
Frandberg P(1997)“人黑皮质素5受体中的谷氨酰胺235和精氨酸272确定了其对MSH的低亲和性”，Biochem Biophys Res Commun236489-492.
Frankel WN(1996)“谁害怕上位性？”Nat Genet14371-373.
GantzI(1993a)“新的黑皮质素受体的分子克隆”，J.Biol.Chem.268，8246-8250.
Gantz(1993)“第四种黑皮质素受体的基因位置的分子克隆、表达”，J.Biol.Chem.268，15174-15179.
Gantz(1994)“第五种黑皮质素受体的分子克隆表达和鉴定”Biochem BiophysRes Commun.，200，1214-1220.
Giridharan NV(1998)“肥胖的动物模型及其在肥胖症分子方法中的应用”，IndianJ Med res 108225-242.
Gotoda T(1997)“人黑皮质素-4受体基因的分子筛选错义变体的鉴定显示出与肥胖、血糖或胰岛素无关”Diabetologia 40976-979.
Goureau A(1996).Genomics.正在出版.
Griffon N(1994)“大鼠第五个黑皮质素受体的分子克隆和鉴定”，BiochemBiophys Res Comm.，200，1007-1014.
Helm J(1994)“快讯具有猪血管细胞粘着分子1(VCAM1)cDNA片段的SacI限制性片段长度多态性”，J.Anim.Science722764.
Hinney A(1999)“黑皮质素-4受体基因中的几个突变，包括与人显性遗传肥胖有关的无意义和移码突变”J Clin Endocrinol Metab 841438-1486.
Huszar(1997)“黑皮质素-4受体的定向破坏导致小鼠肥胖”，Cell 88131-141.
Kask A(1998)“黑皮质素4受体拮抗剂HS014的开胃作用由神经肽Y介导的证据”，Biochem Biophys Res Commun 248245-249.
Kim KS(1999)“快讯猪黑皮质素-4受体(MC4R)基因的连锁和物理图谱”J AnimSci(提交).
Knorr C(1997)“GH基因变体与欧洲野猪、Pietrain和Meishan猪F2代的行为特征的关联”Anim Genet28124-128.
Knott SA(1998)“杂交繁殖野猪与大白猪杂交后代中数量性状基因座的多标记图谱”，Genetics1491069-1680.
Labbe O(1994)“在外周组织中广泛表达的小鼠黑皮质素-5受体基因的分子克隆”Biochemistry，33，4543-4549.
Lee GH(1996).Nature379，632-635.
Ju Dongsi“刺豚鼠蛋白是黑素细胞刺激激素受体的拮抗剂”Letters to Nature.
Marsh DJ(1999)“黑皮质素-4受体缺陷型小鼠对厌食性和开胃性肽的应答”NatGenet21119-122.
Messer L.，(1996a)“法国大白猪崽大小的候选基因的图谱和调查”ISAGProcedings(已提交).
Messer L(1996b)“视黄酸受体γ(RARG)基因经连锁图谱测定位于猪染色体5”.Anim.Genet(正在出版).
Messer L(1996c)“视黄醇结合蛋白4(RBP4)基因经连锁图谱测定位于猪染色体14”.Mammal.Genome(正在出版).
Meuwissen THE(1996)“单倍体标记在动物育种方案中的用途”Genet Sel Evol28161-176.
Montjoy KG(1992)“编码黑皮质素受体的基因家族的克隆”，Science 257，1248-1251.
Montjoy KG(1994)“黑皮质素-4受体(MC4-R)在脑中自主控制回路中神经内分泌中的位置”Mol.Endocrinol，8，1298-1308.
Paszek A(1996)“对猪数量性状基因座的基因组扫描”，Proceed.Midwest.ASASMeeting，24页.
Paszek AA(1999)“趋异猪杂交中的生长间距图谱”Mamm Genome 10117-122.
Phillips M(1996)“肥胖的Zucker大鼠中leptin受体错义突变”，Nature Genetics1318-19.
Pomp D(1997)“多基因动物模型中肥胖的基因解剖分析”Behav Genet 27285-306.
Robbins LS(1993)“改变MSH受体功能的点突变产生变体延伸基因座等位基因的色素沉着表型”Cell72827-834.
Robic A(1996).Mamm.Genome 7，438-445.
Rohrer GA(1998)“影响猪尸体组成的数量性状基因座的鉴定I.脂肪沉积特征”J Anim Sci762247-2254.
Rothschild MF (1996).“雌激素受体基因座与猪幼崽大小的主要基因有关”.PNAS93201-205.
Rothschild MF(1999)“猪基因组以及工业应用的进展”AgBiotechNet 11-8.
Schwartz MW(1999)“中枢神经系统调节能量平衡和肥胖症的模型”Am J ClinNutr69584-96.
SeeleyRJ(1997)“leptin效应中的黑皮质素受体”，Nature390349.
Tartaglia LA(1995)“leptin受体的鉴定和表达克隆”Cell 831263-1271.
Tatro JB(1996)“神经免疫调节肽家族黑皮质素的受体生物学”，Neuroimmunomodulation3259-284.
Truett GE(1995).Mamm.Genome6，25-30.
Vaisse C (1998)“人MC4R中的移码突变与肥胖的显性形式有关”Nat Genet20113-114.
Valverde P(1995)“黑皮质素刺激激素受体基因的变体与人红色毛发以及百色皮肤有关”Nat Genet 11328-330.
Wang L(1998)“直接搜寻猪染色体4和7上的数量性状基因座”J Anim Sci762560-2567.
Warner CM(1991).“猪主要组织相容性复合物(SLA)”，《MHC的免疫遗传学》，VCH出版，NY，NY，368-397页。
Winick JD(1996).Genomics36，221-222.
Xy Y(1994)“在分子水平鉴定Ped基因Q9 MHC I类转基因将Ped缓慢表型转变为Ped迅速表型”Biol.Reprod.51695-699.
Yeo GS(1998)“与显性遗传的人肥胖有关的MC4R中移码突变”Nat Genet20111-112.
Yerle M(1996).Cytogenet.Cell Genet 73，194-202.
Youngs CR(1993)“控制猪幼崽大小的研究I.Meishan和Yorkshire植入前胚胎的体外发育的对比研究”J.Anim.Sci.，1561-1565.
Yu TP(1995)“PIT1多态性与猪生长和尸体特征的关系”J Anim Sci731282-1288.
Zhang Y(1994)“小鼠肥胖基因的定位克隆及其人同系物”，Nature 372425-432.
Ziang ZH(1999)“leptin基因中的基因多态性及其与四种猪肥胖的关系”MammGenome 12191-193.
序列表<110>衣阿华州立大学研究基金会股份有限公司<120>黑皮质素-4受体基因及其作为动物脂肪含量、体重增加和/或饲料消耗的遗传标记的用途<130>rothshcild mc4r2<140>PCT/US99/16862<141>1999-07-26<150>60/094，287<151>1998-07-27<150>60/116，196<151>1999-01-15<160>26<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>745<212>DNA<213>猪<220><221>差异<222>(678)<223>G/A<400>1acaagaatct gcattcaccc atgtactttt tcatctgtag cctggctgtg gctgatatgc 60tggtgagcgt ttccaatggg tcagaaacca ttgtcatcac cctattaaac agcacggaca 120cggacgcaca gagtttcaca gtgaatattg ataatgtcat tgactcagtg atctgtagct 180ccttactcgc ctcaatttgc agcctgcttt cgattgcagt ggacaggtat tttactatct 240tttatgctct ccagtaccat aacattatga cagttaagcg ggttggaatc atcatcagtt 300gtatctgggc agtctgcacg gtgtcgggtg ttttgttcat catttactca gatagcagtg 360ctgttattat ctgcctcata accgtgttct tcaccatgct ggctctcatg gcttctctct 420atgtccacat gttcctcatg gccagactcc acattaagag gatcgccgtc ctcccaggca 480ctggcaccat ccgccaaggt gccaacatga agggggcaat taccctgacc atcttgattg 540gggtctttgt ggtctgctgg gcccccttct tcctccactt aatattctat atctcctgcc 600cccagaatcc atactgtgtg tgcttcatgt ctcactttaa tttgtatctc atcctgatca 660tgtgtaattc catcatcgat cccctgattt atgcactccg gagccaagaa ctgaggaaaa 720ccttcaaaga gatcatctgt tgctat 746<210>2<211>840<212>DNA<213>智人<400>2atatcttagt gattgtggca atagccaaga acaagaatct gcattcaccc atgtactttt 60tcatctgcag cttggctgtg gctgatatgc tggtgagcgt ttcaaatgga tcagaaacca 120ttatcatcac cctattaaac agtacagata cggatgcaca gagtttcaca gtgaatattg 180ataatgtcat tgactcggtg atctgtagct ccttgcttgc atccatttgc agcctgcttt 240caattgcagt ggacaggtac tttactatct tctatgctct ccagtaccat aacattatga 300cagttaagcg ggttgggatc agcataagtt gtatctgggc agcttgcacg gtttcaggca 360ttttgttcat catttactca gatagtagtg ctgtcatcat ctgcctcatc accatgttct 420tcaccatgct ggctctcatg gcttctctct atgtccacat gttcctgatg gccaggcttc 480acattaagag gattgctgtc ctccccggca ctggtgccat ccgccaaggt gccaatatga 540agggagcgat taccttgacc atcctgattg gcgtctttgt tgtctgctgg gccccattct 600tcctccactt aatattctac atctcttgtc ctcagaatcc atattgtgtg tgcttcatgt 660ctcactttaa cttgtatctc atactgatca tgtgtaattc aatcatcgat cctctgattt 720atgcactccg gagtcaagaa ctgaggaaaa ccttcaaaga gatcatctgt tgctatcccc 780tgggaggcct ttgtgacttg tctagcagat attaaatggg gacagagcac gcaatatagg 840<210>3<211>311<212>蛋白质<213>智人<400>3Gln Leu Phe Val Ser Pro Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Val Ile Ser1 5 10 15Leu Leu Glu Asn Ile Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Lys Asn Lys Asn20 25 30Leu His Ser Pro Met Tyr Phe Phe Ile Cys Ser Leu Ala Val Ala Asp35 40 45Met Leu Val Ser Val Ser Asn Gly Ser Glu Thr Ile Ile Ile Thr Leu50 55 60Leu Asn Ser Thr Asp Thr Asp Ala Gln Ser Phe Thr Val Asn Ile Asp65 70 75 80Asn Val Ile Asp Ser Val Ile Cys Ser Ser Leu Leu Ala Ser Ile Cys85 90 95Ser Leu Leu Ser Ile Ala Val Asp Arg Tyr Phe Thr Ile Phe Tyr Ala100 105 110Leu Gln Tyr His Asn Ile Met Thr Val Lys Arg Val Gly Ile Ser Ile115 120 125Ser Cys Ile Trp Ala Ala Cys Thr Val Ser Gly Ile Leu Phe Ile Ile130 135 140Tyr Ser Asp Ser Ser Ala Val Ile Ile Cys Leu Ile Thr Met Phe Phe145 150 155 160Thr Met Leu Ala Leu Met Ala Ser Leu Tyr Val His Met Phe Leu Met165 170 175Ala Arg Leu His Ile Lys Arg Ile Ala Val Leu Pro Gly Thr Gly Ala180 185 190Ile Arg Gln Gly Ala Asn Met Lys Gly Ala Ile Thr Leu Thr Ile Leu195 200 205Ile Gly Val Phe Val ValCys Trp Ala Pro Phe Phe Leu His Leu Ile210215 220Phe Tyr Ile Ser Cys Pro Gln Asn Pro Tyr Cys Val Cys Phe Met Ser225 230 235 240His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile Ile Asp245 250 255Pro Leu Ile Tyr Ala Leu Arg Ser Gln Glu Leu Arg Lys Thr Phe Lys260 265 270Glu Ile Ile Cys Cys Tyr Pro Leu Gly Gly Leu Cys Asp Leu Ser Ser275 280 285Arg Tyr Ala Pro Pro Glu Asn Asp Ile Xaa Val Ile Cys Asn Phe Ile290 295 300Asp Glu Asn Thr Ile Ala Leu305 310<210>4<211>248<212>蛋白质<213>猪<400>4Lys Asn Leu His Ser Pro Met Tyr Phe Phe Ile Cys Ser Leu Ala Val1 5 10 15Ala Asp Met Leu Val Ser Val Ser Asn Gly Ser Glu Thr Ile Val Ile20 25 30Thr Leu Leu Asn Ser Thr Asp Thr Asp Ala Gln Ser Phe Thr Val Asn35 40 45Ile Asp Asn Val Ile Asp Ser Val Ile Cys Ser Ser Leu Leu Ala Ser50 55 60Ile Cys Ser Leu Leu Ser Ile Ala Val Asp Arg Tyr Phe Thr Ile Phe65 70 75 80Tyr Ala Leu Gln Tyr His Asn Ile Met Thr Val Lys Arg Val Gly Ile85 90 95Ile Ile Ser Cys Ile Trp Ala Val Cys Thr Val Ser Gly Val Leu Phe100 105 110Ile Ile Tyr Ser Asp Ser Ser Ala Val Ile Ile Cys Leu Ile Thr Val115 120 125Phe Phe Thr Met Leu Ala Leu Met Ala Ser Leu Tyr Val His Met Phe130 135 140Leu Met Ala Arg Leu His Ile Lys Arg Ile Ala Val Leu Pro Gly Thr145 150 155160Gly Thr Ile Arg Gln 6ly Ala Asn Met Lys 6ly Ala Ile Thr Leu Thr165 170 175Ile Leu Ile Gly Val Phe Val Val Cys Trp Ala Pro Phe Phe Leu His180 185 190Leu Ile Phe Tyr Ile Ser Cys Pro Gln Asn Pro Tyr Cys Val Cys Phe195 200 205Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile210 215 220Ile Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Leu Arg Ser Gln Glu Leu Arg Lys Thr225 230 235 240Phe Lys Glu Ile Ile Cys Cys Tyr245<210>5<211>20<212>DNA<213>猪<400>5tggcaatagc caagaacaag 20<210>6<211>20<212>DNA<213>猪<400>6caggggatag caacagatga 20<210>7<211>18<212>DNA<213>猪<400>7ttaagtggag gaagaagg 18<210>8<211>19<212>DNA<213>猪<400>8cattatgaca gttaagcgg19<210>9<211>20<212>DNA<213>猪<400>9taccctgacc atcttgattg 20<210>10<211>22<212>DNA<213>猪<400>10atagcaacag atgatctctt tg 22<210>11<211>24<212>蛋白质<213>猪<400>1lMet Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile1 5 10 15Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu20<210>12<211>24<212>蛋白质<213>智人<400>12Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile1 5 10 15Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu20<210>13<211>24<212>蛋白质<213>大鼠<400>13Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ala Val1 5 10 15Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu20<210>14<211>23<212>蛋白质<213>智人<400>14Met Ser His Phe Asn Met Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Val1 5 10 15Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala20<210>15<211>23<212>蛋白质<213>哺乳动物<400>15Met Ser His Phe Asn Met Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Val1 5 10 15Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala20<210>16<211>24<212>蛋白质<213>智人<400>16Met Ser Leu Phe Gln Val Asn Gly Val Leu Ile Met Cys Asn Ala Ile1 5 10 15Ile Asp Pro Phe Ile Tyr Ala Leu20<210>17<211>22<212>蛋白质<213>牛腺病毒1类<400>17Ala His Phe Asn Thr Tyr Leu Val Leu Ile Met Cys Asn Ser Val Ile1 5 10 15Asp Pro Leu Ile Tyr Ala20<210>18<211>22<212>蛋白质<213>智人<400>18Ala His Phe Asn Thr Tyr Leu Val Leu Ile Met Cys Asn Ser Val Ile1 5 10 15Asp Pro Leu Ile Tyr Ala20<210>19<211>23<212>蛋白质<213>智人<400>19Met Ser His Phe Asn Met Tyr Leu Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Val1 5 10 15Met Asp Pro Leu Ile Tyr Ala20<210>20<211>22<212>蛋白质<213>智人<400>20Ser Tyr Phe Asn Leu Phe Leu Ile Leu Ile Ile Cys Asn Ser Val Val1 5 10 15Asp Pro Leu Ile Tyr Ala20<210>21<211>25<212>蛋白质<213>牛腺病毒1类<400>21Leu Ala Tyr Glu Lys Phe Phe Leu Leu Leu Ala Glu Phe Asn Ser Ala1 5 10 15Met Asn Pro Ile Ile Tyr Ser Tyr Arg20 25<210>22<211>19<212>蛋白质<213>智人<400>22Phe Leu Leu Leu Ala Glu Ala Asn Ser Leu Val Asn Ala Ala Val Tyr1 5 10 15Ser Cys Arg<210>23<211>22<212>蛋白质<213>智人<400>23Val Phe Ala Phe Cys Ser Met Leu Cys Leu Leu Asn Ser Thr Val Asn1 5 10 15Pro Leu Ile Tyr Ala Leu20<210>24<211>21<212>蛋白质<213>智人<400>24Phe Gln Phe Phe Phe Trp Ile Gly Tyr Cys Asn Ser Ser Leu Asn Pro1 51015Val Ile Tyr Thr Ile20<210>25<211>22<212>蛋白质<213>大鼠<400>25Phe Asp Phe Val Val Ile Leu Thr Tyr Ala Asn Ser Cys Ala Asn Pro1 5 10 15Ile Leu Tyr Ala Phe Leu20<210>26<211>16<212>蛋白质<213>智人<400>26Leu Ala Tyr Ser Asn Ser Ser Val Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Leu1 5 10 1权利要求
1.一种鉴定具有预示脂肪含量、生长速度和饲料消耗的代谢特征的基因型的动物的方法，该方法包括a)获得该动物的核酸样品，和b)鉴定样品MC4R基因中的多态性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中多态性的特征在于MC4R基因PCR产物的核苷酸678位。
3.根据权利要求1所述的方法，其中动物是猪。
4.根据权利要求2所述的方法，其中核苷酸678位的多态性与脂肪含量有关。
5.根据权利要求2所述的方法，其中核苷酸678位的鸟嘌呤与较低的摄食量有关。
6.根据权利要求2所述的方法，其中核苷酸678位的腺嘌呤与较快的体重增加速度有关。
7.根据权利要求1所述的方法，其中鉴定多态性的步骤是采用等位基因特异性寡核苷酸的方法。
8.根据权利要求1所述的方法，其中鉴定多态性的步骤选自限制性片段长度多态性RFLP分析、异源双链体分析、单链构象多态性SSCP分析、变性梯度凝胶电泳DGGE、温度梯度凝胶电泳TGGE以及采用连锁的基因标记。
9.根据权利要求8所述的方法，其中鉴定多态性的步骤包括RFLP分析。
10.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括扩增MC4R基因序列的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，它还包括用限制性内切核酸酶TaqI消化扩增的区域的步骤。
12.根据权利要求10所述的扩增的基因序列，其中用于扩增的引物选自SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO11。
13.一种用于检测MC4R基因PCR产物核苷酸678的单链寡核苷酸引物，该引物由具有SEQ ID NO1的4-30个毗连碱基的核苷酸序列组成。
14.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸具有SEQ ID NO6代表的核苷酸序列。
15.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸具有SEQ ID NO7代表的核苷酸序列。
16.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸具有SEQ ID NO8代表的核苷酸序列。
17.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸具有SEQ ID NO9代表的核苷酸序列。
18.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸具有SEQ ID NO10代表的核苷酸序列。
19.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸具有SEQ ID NO11代表的核苷酸序列。
20.一种鉴定动物的方法，该动物具有预示脂肪含量、生长速度和饲料消耗的代谢特征的所需基因型，该方法包括a)获得基因组DNA样品，b)鉴用TaqI消化该样品，获得片段，c)分离消化所获得的片段，和d)鉴定MC4R基因PCR产物的碱基678位是否存在TaqI位点。
21.根据权利要求20所述的方法，该方法还包括选择具有所需基因型的动物用于育种的步骤。
22.根据权利要求20所述的方法，其中当使用切割与TaqI有相同的识别位点的限制性酶时，当碱基678有鸟嘌呤时，位点可通过466、225和76碱基对的片段来鉴定，当存在腺嘌呤时，位点可通过542和225碱基对的片段来鉴定。
23.根据权利要求20所述的方法，其中鉴定步骤包括通过扩增来检测TaqI位点。
24.一种评价动物DNA样品的试剂盒，该试剂盒包含在容器内的鉴定MC4R基因中多态性的试剂。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中试剂是扩增MC4R基因或其片段的引物。
26.根据权利要求24所述的试剂盒，它还包含切割MC4R基因的DNA聚合酶、正向引物和反向引物，其中引物能扩增含有多态性位点的MC4R基因区域。
27.一种用来测定MC4R基因中多态性TaqI位点的存在的引物，其中引物包含选自SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ IDNO11的序列。
28.一种选择具有较低脂肪含量、较快生长速度、或较低饲料消耗的所需特征的动物的方法，该方法包括下列步骤a)获得动物的核酸样品，b)鉴定特征在于MC4R基因PCR产物的678位核苷酸的多态性，和c)选出678位具有与所需特征相关的核苷酸的动物。
29.一种间接选择MC4R中多态性的方法，其中用其它DNA标记的特异性等位基因来进行间接选择，其中其它DNA标记是靠近MC4R的连锁标记。
30.根据权利要求29所述的方法，其中连锁的标记选自S0331、BHT0433和S0313。
31.一种鉴定动物的方法，该动物具有预示脂肪含量、生长速度和饲料消耗的代谢特征的所需基因型，该方法包括a)通过获得感兴趣的动物品系或品种的样品，确定MC4R基因型和感兴趣特征之间的关联性，b)制备样品中每种动物的基因组DNA，c)测定MC4R基因的基因型，和d)计算MC4R基因型和该特征之间的关联性。
32.一种选择动物的方法，该动物具有预示脂肪含量、生长速度和饲料消耗的代谢特征的所需MC4R基因型，该方法包括a)获得动物的核酸样品，b)鉴定动物MC4R基因的基因型，和c)选出具有与所需特征相关的基因型的那些动物。
全文摘要
本发明公开了猪黑皮质素－4受体(MC4R)基因中与脂肪含量、生长速度和饲料消耗相关的遗传标记。另外,公开了可用于PCR测试以筛选标记存在的该基因若干区域新的序列数据。该遗传标记可用来筛选具有脂肪含量、生长速度和饲料消耗等所需特征的动物用于育种的目的。本发明还公开了利用PCR测试的试剂盒。
文档编号C12N15/00GK1328602SQ99811113
公开日2001年12月26日 申请日期1999年7月26日 优先权日1998年7月27日
发明者M·F·罗思柴尔德, N·J·拉森, K·S·金 申请人:衣阿华州立大学研究基金会股份有限公司