受体样蛋白激酶rkn以及用其增加植物生长和产量的方法

专利名称：受体样蛋白激酶rkn以及用其增加植物生长和产量的方法
技术领域：
总的来讲，本发明涉及遗传修饰植物，更具体地讲，涉及受体样蛋白激酶和利用本发明的受体样蛋白激酶产生鉴定为生长和产量增加的遗传修饰植物的方法。
背景技术：
对于每种植物物种，由于环境条件，在植物生长方面均存在广泛的差异。在大多数条件下，没有实现植物的最大生长潜力。植物育种已经证明，可以将植物资源改变方向至各个器官，以增强生长。
植物的遗传工程需要分离和操作例如DNA或RNA的遗传物质，随后将该物质引入植物或植物细胞中，近几年来植物的遗传工程已经大大改变了植物育种和农业。作物营养价值的提高、产量增加、饲养价值的提高、生产成本降低、对虫害的抗性、逆境耐性、耐旱性、药物、化学分子和生物分子的生产以及其它有益性状，所有这些均可能通过遗传工程技术获得。
操作基因表达的能力提供了在转化植物中产生新特性的一种手段。例如，提高植物根系大小的能力将可能增加从土壤吸收养分。此外，增加叶片生长的能力将增加植物吸收太阳能的能力。显然，控制整株植物或其特定靶器官生长的能力将是非常需要的。
位于质膜中的受体在细胞信号中起显著作用。最近，有证据表明，植物细胞也携带具有蛋白激酶活性的细胞表面受体。植物受体样蛋白激酶(RLK)在结构上与哺乳动物的生长因子受体多肽相关。这些蛋白具有一个大的胞质外结构域、一个跨膜区段和一个具有蛋白激酶活性的胞质结构域。大多数哺乳动物生长因子受体蛋白激酶为酪氨酸激酶，但许多植物RLK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。根据结构相似性，已经将所述RLK分为三类(1)S-结构域蛋白，它涉及芸苔属(Brassica)的自交不亲合性基因座糖蛋白，(2)富含亮氨酸重复序列的蛋白，它含有一个在许多真核蛋白中发现的串联重复基元，和(3)含有表皮生长因子样重复序列的蛋白。已经在单子叶植物例如玉米和双子叶植物例如十字花科植物(Brassicaceae)中发现了RLK(关于综述参见Walker,J.C.,1994，“高等植物的受体样蛋白激酶的结构和功能”Plant Mol.Biol.26:1599-1609)。本发明提供一种新的RLK-称为受体样蛋白激酶(RKN)。
发明概述本发明基于这样一个发现通过提高受体样蛋白激酶(RLK)家族的一个成员受体样蛋白激酶(RKN)的水平，可以达到增加植物的生长和产量。
在一个实施方案中，提供基本纯化的RKN多肽。也提供编码RKN多肽的分离的多核苷酸，同样提供RKN表达控制序列。
在另一实施方案中，本发明提供产生与相应的野生型植物相比被鉴定为生长和产量增加的遗传修饰植物的方法，所述方法为(1)使植物细胞与有效连接表达控制序列的编码RKN多肽的核酸接触，以获得转化的植物细胞；(2)由允许表达RKN的转化植物细胞产生植株；和(3)选择表现出产量增加的植株。也提供遗传修饰植物细胞以使由所述细胞产生的植物具有调节的产量的方法。该方法包括引入编码RKN多肽的分离的多核苷酸，并在允许调节RKN多肽的条件下培育转化的植物细胞。
在再一实施方案中，提供产生与相应的野生型植物相比被鉴定为在其根中目的基因产物表达增加的遗传修饰植物的方法，所述方法包括(1)使植物细胞与包括有效连接目的基因产物编码区的RKN表达控制序列的多核苷酸接触，以获得转化的植物细胞；(2)由所述转化植物细胞产生植株；和(3)选择表现出在其根中目的基因产物表达增加的植株。
也提供一种方法，通过将包括有效连接编码赋予对病原体抗性的多肽的多核苷酸的RKN表达控制序列的核酸序列引入植物细胞基因组中，获得转化的植物细胞，产生遗传转化的抗病性植物。
本发明也提供由本发明的遗传修饰植物产生的植物、植物组织和种子。
附图简述

图1描述了用于分离受体样蛋白激酶(RKN)的克隆策略。
图2为RKN基因的多核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
图3显示RKN基因的结构和预测的蛋白结构域。
图4是RKN多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图5显示RKN蛋白中LRR重复序列的序列对比。
图6a和6b显示RKN和与RKN同源的蛋白之间的LRR区的序列对比。
图7显示了RKN的胞质激酶结构域与植物中其它受体样蛋白激酶结构域之间的同源性序列对比。
图8显示了水稻基因组DNA的HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ消化物的DNA印迹。
图9显示了产生携带RKN基因的转基因植物的策略。
图10显示了用于产生转基因植物的构成物。
图11显示了从35S∷RKN转化体幼苗中提取的RNA的RNA印迹。
图12显示了35S∷RKN转化体根生产增加的照片。显示了野生型植物中根的生产用于对比。
图13显示了从三个转化体系分离出的根中的RKN启动子∷GUS融合活性。
图14显示了RKN激酶的自磷酸化。
图15显示了三种受体样蛋白激酶RKN、Xa21和BRI1的比较。指明了信号肽、半胱氨酸对、亮氨酸拉链基元、跨膜结构域、激酶结构域和一个70个氨基酸的岛的位置。
优选实施方案的描述本发明提供一种称为RKN的新的RLK，它是一个含有富含亮氨酸重复序列的RLK类成员。多核苷酸、多肽、载体和宿主细胞本发明提供基本纯化的RKN多肽。最好是RKN具有SEQ ID NO:2中提出的氨基酸序列。本文所用的术语“基本纯化的”是指基本上不含其它蛋白、脂质、糖类或与其天然结合的其它材料的多肽。本领域技术人员可以采用蛋白纯化的标准技术来纯化RKN。所述基本纯化的多肽在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上将产生一条单一的主带。RKN多肽的纯度还可以通过氨基末端氨基酸序列分析来测定。
所谓“大致纯的多肽”是指已经与天然伴随其的组分分离的RKN多肽。通常，所述多肽当其至少60％(重量)不合与其天然结合的蛋白质和天然存在的有机分子时，该多肽为大致纯的。最好是所述制剂为至少75％、更优选至少90％、最优选至少99％(重量)RKN多肽。例如通过从天然来源(例如植物细胞)提取；表达编码RKN多肽的重组核酸；或化学合成所述蛋白，可以获得大致纯的RKN多肽。可以通过任何合适的方法，例如在柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳中描述的那些方法或通过HPLC分析，测定纯度。
当将蛋白与在天然状态下伴随其的那些污染物分离时，所述蛋白大致不含天然结合的组分。因此，化学合成的或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中产生的蛋白，将大致不含其天然结合的组分。因此，大致纯的多肽包括衍生自真核生物、但在大肠杆菌或其它原核生物中合成的那些多肽。
本发明包括功能性RKN多肽及其功能片段。本文所用的术语“功能性多肽”是指具有通过限定的功能测定鉴定的生物功能或活性、且与所述细胞中特定生物学、形态学或表型的改变相关的多肽。术语“RKN多肽的功能片段”是指保留RKN活性(例如受体蛋白激酶活性)的所有RKN片段。生物功能片段例如可以在大小方面改变，从小至能够结合抗体分子的表位的多肽片段至能够参与特征性诱导或编程细胞内表达改变的大的多肽。一个RKN功能片段的实例是包括RKN激酶结构域的多肽(参见图3和图7)。另一种RKN功能片段是包括RKN的另一胞质配体结合结构域的多肽(参见图3)。
对RKN一级氨基酸序列的小的修饰，可能产生与本文所述的未修饰的对应多肽相比具有基本等同活性的蛋白质。这类修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或可以是自发的。本文包括通过这些修饰产生的所有多肽，只要RKN的生物活性仍存在。另外，缺失一个或多个氨基酸也可能导致所得分子结构的修饰，而不显著改变其活性。缺失可以导致产生可能具有更广泛应用性的更小的活性分子。例如，应该有可能去除RKN活性所需的氨基末端或羧基末端的氨基酸。
RKN多肽包括与SEQ ID NO:2中提出的序列基本相同的氨基酸序列。术语“基本相同”是指氨基酸序列保留本文所述的RKN的活性，例如受体蛋白激酶活性。
本发明包括具有与SEQ ID NO:2中提出的氨基酸序列基本相同的多肽或其功能片段，或包括与SEQ ID NO:2基本相同的氨基酸序列。所谓“基本相同(substantially the same)”或“基本相同(substantiallyidentical)”是指表现出与参比氨基酸序列或参比核酸序列的同源性至少为60-80％、优选85％、更优选90％和最优选95％的多肽或核酸。对于多肽，对比序列的长度一般至少为16个氨基酸，优选至少20个氨基酸，更优选至少25个氨基酸，最优选35个氨基酸。对于核酸，对比序列的长度一般至少50个核苷酸、优选至少60个核苷酸，更优选至少75个核苷酸，最优选110个核苷酸。
所谓“基本相同”也是指仅因保守氨基酸取代而不同的氨基酸序列，所述保守氨基酸取代例如为一个氨基酸取代另一个同类氨基酸(例如缬氨酸取代甘氨酸，精氨酸取代赖氨酸等)，或者是指仅由于在不破坏所分析蛋白的功能(例如本文所述的)的氨基酸序列的位置上的一个或多个非保守取代、缺失或插入而不同的氨基酸序列。这种序列在氨基酸水平上与SEQ ID NO:2优选至少85％相同，更优选完全相同。
通常采用序列分析软件(例如Genetics Computer Group的序列分析软件包，University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 UniversityAvenue,Madison,WI 53705)测定同源性。这种软件通过比较各种取代、缺失、取代和其它修饰的同源性程度，对比相似的序列。
本发明的RKN多肽包括所述多肽序列的保守变异。本文所用的术语“保守变异”是指一个氨基酸残基被生物上相似的另一残基取代。保守变异的实例包括一个疏水残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)取代另一个疏水残基，或一个极性残基取代另一个极性残基，例如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺，等等。术语“保守变异”也包括用取代的氨基酸替代未取代的母体氨基酸，前提是针对所述取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽免疫反应。
本发明提供编码所述RKN蛋白的多核苷酸。这些多核苷酸包括编码RKN的DNA、cDNA和RNA序列。要理解的是，编码RKN的所有多核苷酸均包括在本文中，只要它们编码具有RKN活性的多肽。这类多核苷酸包括天然存在的、合成的、和有意操作的多核苷酸。例如，可以对RKN多核苷酸进行定点诱变。RKN的多核苷酸序列也包括反义序列和编码显性失活形式的RKN的序列。本发明的多核苷酸包括由于遗传密码简并的序列。存在20种天然的氨基酸，其中大多数由一个以上的密码子来确定。因此，所有简并的核苷酸序列均包括在本发明中，只要由所述核苷酸序列编码的RKN多肽的氨基酸序列在功能上未改变。
本文具体公开了含RKN基因的多核苷酸序列。所述RKN核苷酸序列最好是SEQ ID NO:1。术语“多核苷酸”或“核酸序列”是指多聚形式的核苷酸，其长度至少为10个碱基。所谓“分离的多核苷酸”是指与在衍生其的生物的天然存在的基因组中与其紧密相邻的两个编码序列(一个位于5’端，一个位于3’端)不紧密相邻的多核苷酸。因此，该术语包括例如加入载体中的重组DNA；加入自主复制型质粒或病毒中的重组DNA；或加入原核生物或真核生物基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其它序列的单独的分子(例如cDNA)存在的重组DNA。本发明的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或这两种核苷酸中任一种的修饰形式。该术语包括单链形式和双链形式的DNA。
编码RKN的多核苷酸包括SEQ ID NO:1、显性失活形式的RKN和与SEQ ID NO:1互补的核酸序列。互补序列可以包括反义核苷酸。当该序列为RNA时，SEQ ID NO:1中的脱氧核苷酸A、G、C和T分别由核糖核苷酸A、G、C和U取代。本发明也包括上述核酸序列的片段，所述片段的长度至少为15个碱基，足以允许所述片段选择性地杂交至在生理条件下编码SEQ ID NO:2的蛋白或一RKN的密切相关家族成员的DNA。术语“选择性地杂交”是指在排除非相关核苷酸序列的中等严格或高严格条件下的杂交。
在核酸杂交反应中，用来达到特定严格水平的条件将根据待杂交的核酸的性质而变化。例如，在选择杂交条件时，可以考虑所述核酸杂交区的长度、互补性的程度、核酸序列的组成(例如GC相对于AT的含量)和核酸类型(例如RNA相对于DNA)。另一考虑为是否将所述核酸之一固定在例如滤膜上。
渐进式较高严格条件的一个实例如下2×SSC/0.1 SDS，室温下(杂交条件)；0.2×SSC/0.1 SDS，约室温下(低严格条件)；0.2×SSC/0.1 SDS，约42℃(中等严格条件)；和0.1×SSC，约68℃(高严格条件)。可以仅采用这些条件之一进行洗涤，例如采用高严格条件，或可以使用每种所述条件，例如以上述所列的顺序，每种条件10-15分钟，重复所列步骤中的任一步骤或所有步骤。然而，如上所述，最适条件将根据所涉及的具体杂交反应而变化，可以凭经验确定。
可以通过将DNA转移到合适的宿主细胞中，在体外表达编码RKN的DNA序列。“宿主细胞”是载体可以在其中繁殖并表达载体DNA的细胞。所述细胞可以是植物细胞或原核细胞或真核细胞。该术语也包括所述宿主细胞的任何后代。要理解的是，不可能所有后代均与亲代细胞完全相同，因为在复制期间可能发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，包括这类后代。稳定转移是指外源DNA在宿主中持续保留，稳定转移的方法是本领域已知的。
在本发明中，可以将所述RKN多核苷酸插入表达载体中。术语“表达载体”是指本领域已知的、已经通过插入或加入所述RKN基因序列进行操作的质粒、病毒或其它载体。编码RKN的多核苷酸序列可以有效地连接至表达控制序列。“有效连接”是指一种并列，其中所述组分所处的关系允许它们以其计划的方式起作用。连接有效连接至编码序列的表达控制序列，以使在与所述表达控制序列相容的条件下完成所述编码序列的表达。本文所用的的术语“表达控制序列”是指调节与其有效连接的核酸序列表达的核酸序列。如果表达控制序列控制并调节核酸序列的转录以及翻译(合适时)，则表达控制序列有效地连接至所述核酸序列。因此，表达控制序列可以包括合适的启动子、增强子、转录终止子、在蛋白编码基因前作为起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、保持该基因正确读框以允许mRNA正确翻译和终止密码子。术语“控制序列”将最少包括其存在可以影响表达的组分，也可以包括其存在是有利的另外的组分，例如前导序列和融合配偶体(partner)序列。表达控制序列可以包括启动子。
所谓“启动子”是指足以指导转录的最小序列。本发明也包括足以使依赖于启动子的基因表达成为细胞类型特异性、组织特异性控制的或可由外部信号或因子诱导的那些启动子元件；这类元件可以位于该基因的5’或3’区中。
可以任选地将选择标记与所述RKN多核苷酸连接。本文所用的术语“标记”是指编码允许选择或筛选含所述标记的细胞的性状或表型的基因。所述标记基因最好是抗生素抗性基因，由此可以用合适的抗生素从未转化的细胞中选择转化的细胞。适用于植物中的选择标记的实例包括腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和氨基糖苷3’-O-磷酸转移酶Ⅱ(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。其它合适的标记是本领域技术人员已知的。
可以利用各种各样的宿主-表达载体系统来表达所述RKN编码序列。这些系统包括但不限于微生物，诸如用含所述RKN编码序列的重组噬菌体核酸、质粒核酸或粘粒核酸表达载体转化的细菌；用含所述RKN编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含所述RKN编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的、或用含所述RKN编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；用含所述RKN编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；或用含所述RKN编码序列的重组病毒表达载体(例如反转录病毒、腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞系统、或为稳定表达而进行工程改造的转化的动物细胞系统。RKN调节序列本文所用的术语“RKN表达控制序列”或“RKN调节区”是指SEQ ID NO:3的核苷酸序列、以及互补序列或表现出与SEQ ID NO:3的序列的序列同一性至少约75％、优选至少约85％、更优选至少约90％的序列。功能性RKN表达控制序列能够在合适的细胞如植物根中的细胞中启动与其有效连接的基因的表达。功能性RKN表达控制序列包括RKN启动子。RKN表达控制序列也包括诸如转录起始点(tsp)的元件，它们可以通过引物延伸分析鉴定。在RKN表达控制序列中包括本领域熟知的元件，例如TATA框、抑制基因或沉默基因和增强子、以及结合转录因子CTF/NF-1、AP-1、NF-κB和NF-ATp的元件的共有序列。
本发明的多核苷酸序列包括编码RKN表达控制序列的DNA、cDNA和RNA序列。要理解的是，编码RKN调节区所有部分或功能部分的所有多核苷酸也包括在其中。这类多核苷酸包括天然存在的、合成的和有意操作的多核苷酸。作为实例，可以对所述RKN启动子多核苷酸进行定点诱变。RKN调节区的多核苷酸序列也包括反义序列。
应该注意的是，SEQ ID NO:3包括多个活性结构域，例如示于图3的启动子结构域。
可以将RKN调节区有效连接至任何“目的核苷酸序列”。所谓“目的核苷酸序列”或“目的DNA”是指编码蛋白或需要在靶细胞中表达(例如在所述靶细胞中产生所述蛋白或其它生物分子，例如治疗性细胞产物)的其它分子的任何核苷酸序列(例如RNA或DNA序列)或DNA序列。目的核苷酸序列包括功能性RKN多肽及其片段。目的核苷酸序列可以是显性失活形式的RKN。目的核苷酸序列可以是反义分子或三链体形成因子。在整个说明书中使用术语“目的DNA”不是意在将本发明限制于脱氧核糖核酸。
可以将RKN调节区有效连接至“异源核酸序列”。本文所用的术语“异源核酸序列”是指对于受体植物宿主而言是外来的核酸，或所述宿主自身的核酸，只要该自身核酸由其原始形式进行相当大的修饰。
所谓“目的基因产物”是指多肽、RNA分子或需要在所研究对象中表达的其它基因产物。“目的基因产物”可以包括例如用作标记蛋白评价细胞转化和表达的多肽、融合蛋白、具有所需生物活性的多肽、可以互补基因缺陷的基因产物、RNA分子、转录因子和在调节和/或表达方面感兴趣的其它基因产物。“目的基因产物”包括RKN多肽、反义核酸、三链体形式因子和核酶。“目的基因产物”也包括提供所需效应或调节功能、但本身不必编码RNA分子和多肽的核苷酸序列(例如转座子、内含子、启动子、增强子、剪接信号等)。
反义核酸是与特定mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子(Weintraub,1990,Scientific American,262:40)。在所述细胞中，反义核酸杂交至相应的mRNA，形成双链分子。由于所述细胞不翻译双链的mRNA，因此反义核酸干扰所述mRNA的翻译。优选约15个核苷酸的反义寡聚物，因为它们容易合成，并且当引入产生FT的靶细胞中时，与较大的分子相比不大可能引起问题。应用反义方法在体外抑制基因的翻译是本领域众所周知的(Marcus-Sakura,1988,Anal.Biochem.,172:289)。
应用寡核苷酸拖延转录被称为三链体策略，因为所述寡聚物缠绕在双螺旋DNA周围，形成三股螺旋。因此，这些三链体化合物可以用来识别选定基因上的特有位点(Maher等，1991,Antisense Res.and Dev.,1(3):227；Helene,C.,1991,Anticancer Drug Design,6(6):569)。
核酶是具有以类似于DNA限制性内切酶的形式特异性切割其它单链RNA的能力的RNA分子。通过修饰编码这些RNA的核苷酸序列，有可能对识别RNA分子中特定核苷酸序列并切割该序列的分子进行工程改造(Cech,1988,J.Amer.Med.Assn.,260:3030)。该方法的一个主要优点是，因为它们是序列特异性的，因此仅失活具有特定序列的mRNA。
核酶有两种基本类型，即四膜虫型(Hasselhoff,1988,Nature,334:585)和“锤头”型。四膜虫型核酶识别长4个碱基的序列，而“锤头”型核酶识别长11-18个碱基的碱基序列。识别序列越长，越可能在靶mRNA种类中排他性地存在所述序列。因此，为了失活特定的mNRA种类，锤头型核酶优于四膜虫型核酶，并且18个碱基的识别序列优于较短的识别序列。
“有效连接”如上定义。所谓“有效插入”是指目的DNA序列相邻指导所引入DNA转录和翻译的DNA序列定位(即促进例如目的DNA编码的多肽的产生)。RKN抗体本发明的RKN多肽可以用来产生对RKN多肽的表位具有免疫反应性或与其结合的抗体。优选针对衍生自RKN胞外结构域的肽的抗体(例如图3所示的结构域中包含的肽)。提供基本上由具有不同表位特异性的混合单克隆抗体组成的抗体以及不同的单克隆抗体制剂。
多克隆抗体的制备是本领域技术人员众所周知的。参见例如Green等，1992，“多克隆抗血清的生产”，载于ImmunochemicalProtocols,(Manson编辑)，第1-5页(Humana Press)；和Coligan等，1992，“在兔子、大鼠、小鼠和仓鼠中产生多克隆抗体”，载于CurrentProtocls in Immunology,2.4.1部分；所述文献通过引用结合到本文中。
单克隆抗体的制备同样是常规方法。参见例如Koler和Milstein,1975,Nature 256:495；Coligan等，2.5.1-2.6.7部分；和Harlow等，1988,载于Antibodies:a Laboratory Manual，第726页(Cold Spring HarborPub.)，所述文献通过引用结合到本文中。简而言之，通过给小鼠注射包含抗原的组合物，通过取出血清样品证实存在抗体产生，取出脾以获得B淋巴细胞，将所述B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤，克隆所述杂交瘤，选择产生针对所述抗原的抗体的阳性克隆，并从杂交瘤培养物中分离所述抗体，可以获得单克隆抗体。可以通过多种非常确实的技术，从杂交瘤培养物中分离并纯化单克隆抗体。这类分离技术包括使用蛋白A Sepharose的亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析。参见例如Coligan等，2.7.1-2.7.12部分和2.9.1-2.9.3部分；Barnes等，1992，“免疫球蛋白G(IgG)的纯化”，载于Methods inMolecuar Biology，第10卷，第79-104页(Humana Press)。
体外和体内增殖单克隆抗体的方法是本领域技术人员众所周知的。可以在合适的培养基中进行体外增殖，所述培养基例如Dulbecco的改进Eagle培养基或RPMI 1640培养基，任选地补充哺乳动物血清如胎牛血清、或微量元素和生长持续补充物，如正常小鼠腹膜渗出细胞、脾细胞、胸腺细胞或骨髓巨噬细胞。体外生产提供相对纯的抗体制剂，并允许扩大规模以产生大量的所需抗体。可以在气升式反应器中通过同质悬浮培养、在连续搅拌式反应器中或在固定化或截留细胞培养中进行大规模杂交瘤培养。通过将细胞克隆注射到与亲代细胞组织相容的哺乳动物(例如同源小鼠)中，以使得产生抗体的肿瘤生长，可以进行体内增殖。任选地在注射之前，用一种烃、特别是油诸如降植烷(四甲基十五烷)激发所述动物。1-3周后，从该动物的体液中回收所需的单克隆抗体。
本文所用的术语“抗体”包括完整的分子及其能够结合表位决定簇的片段，诸如Fab、F(ab’)2和Fv。这些抗体片段保留了某些选择性地与其抗原或受体结合的能力，其定义如下(1)Fab，这是可以通过用木瓜蛋白酶消化完整的抗体、产生一条完整的轻链和一条重链的一部分所获得的含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段；(2)Fab’，这是可以通过用胃蛋白酶处理抗体、然后还原产生一条完整轻链和重链的一部分所获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab’片段；(3)(Fab’)2，这是可以通过用胃蛋白酶处理抗体、但随后不还原所获得的抗体分子的片段；F(ab’)2是两个Fab’片段通过两个二硫键保持在一起的二聚体；(4) Fv，定义为含有作为两条链表达的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；和(5)单链抗体(“SCA”)，定义为含有轻链可变区、重链可变区、通过合适的多肽接头连接的作为基因融合单链分子的基因工程分子。
制备这些片段的方法是本领域已知的。(参见例如Harlow和Lane,1988,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York，该文献通过引用结合到本文中)。在本发明所用的术语“表位”是指抗体的互补位结合的抗原上的抗原决定簇。表位决定簇通常包含诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面聚集(grouping)，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
通过蛋白水解抗体，或通过在大肠杆菌中表达编码该片段的DNA，可以制备本发明的抗体片段。可以用常规方法，通过用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整的抗体，获得抗体片段。例如，可以通过用胃蛋白酶酶切抗体产生抗体片段，提供命名为F(ab’)2的5S片段。可以用巯基还原剂进一步切割该片段，和任选地用封闭基封闭由二硫键切割产生的巯基，产生3.5S Fab’单价片段。或者，采用胃蛋白酶酶切，直接产生两个单价的Fab’片段和Fc片段。Goldenberg的美国专利第4,036,945号和第4,331,647号和其中的参考文献描述了这些方法。这些专利通过引用全文结合到本文中。也参见Nisonhoff等，1960,Arch.Biochem.Biophys.89:230；Porter,195,Biochem.J.73:1199；Edelman等，1967,Methods in Enzymology，第1卷，第422页(Academic Press)；和Coligan等，2.8.1-2.8.10部分和2.10.1-2.10.4部分。
也可以使用其它切割抗体的方法，诸如分离重链以形成单价轻链-重链片段、进一步切割片段，或其它酶技术、化学技术或基因技术，只要所述片段结合于所述完整抗体识别的抗原。
例如，Fv片段包含结合的VH和VL链。这种结合可以是非共价的，如描述于Inbar等，1972,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 69:2659。或者，可以通过分子间二硫键连接所述可变链，或用例如戊二醛的化学试剂交联所述可变链。参见例如Sandhu，见上文。Fv片段最好包含用肽接头连接的VH和VL链。通过构建包含编码通过寡核苷酸连接的VH和VL结构域的DNA序列的结构基因，制备这些单链的抗原结合蛋白(sFv)。将所述结构基因插入表达载体中，随后将该表达载体引入诸如大肠杆菌的宿主细胞中。这些重组的宿主细胞合成具有桥接所述两个V结构域的接头肽的多肽单链。例如Whitlow等，1991,Methods:aCompanion to Methods in Enzymology，第2卷，第97页；Bird等，1988,Science 242:423-426；Ladner等，美国专利第4,946,778号；Pack等，1993,Bio/Technology 11:1271-77；和Sandhu，见上文，它们描述了生产sFv的方法。
另一种形式的抗体片段是编码单一互补决定区(CDR)的肽。通过构建编码目的抗体的CDR的基因，可以获得CDR肽(“最小识别单位”)。例如通过用聚合酶链式反应，从抗体生产细胞的RNA合成可变区，制备这种基因。参见例如Larrick等，1991,Methods:a Companionto Methods in Enzymology，第2卷，第106页。
用完整的多肽或含目的小肽的片段作为免疫抗原，可以制备结合于本发明RKN多肽的抗体。用来免疫动物的多肽或肽可以衍生自翻译的cDNA或化学合成，需要时可以将其缀合于载体蛋白。这类常用的化学偶联至所述肽的载体包括匙孔蛾血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。然后用偶联的肽免疫动物(例如小鼠、大鼠或兔子)。
如果需要，可以例如将产生针对其的抗体的多肽或肽结合于基质，通过将多克隆抗体或单克隆抗体结合于所述基质并从中洗脱，进一步纯化多克隆抗体或单克隆抗体。本领域技术人员知道免疫学领域中用于纯化和/或浓缩多克隆抗体以及单克隆抗体的常用的各种技术(参见例如Coligan等，1991,Current Protocols in Immunology，第9单元，Wiley Interscience；其通过引用结合到本文中)。
也有可能使用抗独特型技术来产生模拟表位的单克隆抗体。例如，针对第一单克隆抗体制备的抗独特型单克隆抗体将在超变区中具有一个结合结构域，所述结合结构域是所述第一单克隆抗体结合的表位的“映像”。遗传修饰的植物和制备方法在另一实施方案中，本发明提供用于产生与未遗传修饰的植物(例如野生型植物)相比鉴定为产量增加的遗传修饰植物的方法。术语“产量”或“植物产量”是指作物生长的增加和/或生物量的增加。在一个优选实施方案中，产量的增加得自生长率增加和根大小增加。本发明的方法包括以下步骤将至少一种编码RKN的核酸序列引入植物细胞中，以获得转化的植物细胞，其中所述核酸序列有效连接启动子；在允许表达RKN多肽的条件下由所述转化的植物细胞产生植株；和此后选择表现出产量增加的植株。所述植物或者为单子叶植物，或者为双子叶植物。单子叶植物的实例包括但不限于石刁柏、饲料用玉蜀黍和甜玉米、大麦、小麦、稻(例如Japonica或Indica)、高粱、洋葱、珍珠粟、黑麦和燕麦。双子叶植物的实例包括但不限于番茄、烟草、棉花、油菜籽、蚕豆、大豆、马铃薯、葡萄、草莓、胡椒、莴苣、豆类作物、苜蓿、三叶草、甘蓝类蔬菜或甘蓝(Brassica oleracea)(例如卷心菜、嫩茎花椰菜、花椰菜、抱子甘蓝)、萝卜、胡萝卜、甜菜、茄子、菠菜、黄瓜、南瓜、甜瓜、网纹甜瓜、向日葵和各种观赏植物。木本物种包括杨属、松属、红杉、柏树、橡树等。
本文所用的术语“遗传修饰”是指将一种或多种异源核酸序列引入一种或多种植物细胞中，提供有性能力的有活力的植株。本文所用的术语“遗传修饰的”是指已经通过上述方法产生的植物。本发明的遗传修饰植物能够自花传粉或用相同物种的其它植株异花传粉，以使在生殖系中携带的外源基因可以插入或者育种到农业上有用的植物变种中。本文所用的术语“植物细胞”是指原生质体、产生配子的细胞和再生为全株的细胞。因此，包括多个能够再生为全株的植物细胞的种子包括在“植物细胞”的定义内。
本文所用的术语“植物”是指或者全株、植物部分、植物细胞或一组植物细胞，例如植物组织。小植株也包括在“植物”的含义中。本发明包括的植物是适合于转化技术的任何植物，包括被子植物、裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。
上面已经描述了术语“异源核酸序列”。任何目的核酸序列均可以与本发明一起使用。例如，该术语包括起源于宿主物种的核酸，其中这种序列有效连接至不同于天然或野生型启动子的启动子上。在广义的本发明方法中，至少一种编码RKN多肽的核酸序列与合适的启动子连接。可能最好是将一个以上拷贝的RKN多核苷酸引入植物中，以增强RKN表达。例如，多个拷贝的该基因可能具有增加植物中RKN多肽生产、提供更大根生长的效应。
通过将包括至少一种编码RKN的核酸序列的载体引入植物细胞中，产生本发明的遗传修饰植物。为了一次有效地引入植物细胞中，所述RKN核酸序列必须与在该植物细胞中有效的启动子有效连接，以引起RKN转录。另外，也可以使用在植物中也被识别的聚腺苷酸化序列或转录控制序列。最好是，如本文所述，带有待插入核酸序列的载体也含有一种或多种选择标记基因，以便可以从培养物中的非转化细胞选择转化细胞。
本发明中的RKN多核苷酸的表达可以由许多启动子驱动。可以利用RKN的内源或天然启动子来转录调节该基因，或可以利用作为外源调节序列的异源启动子。关于植物表达载体，合适的病毒启动子包括CaMV的35S RNA启动子和19S RNA启动子(Brisson等，1984,Nature 310:511；Odell等，1985,Nature 313:810)；玄参花叶病毒(FMV)的全长转录物启动子(Gowda等,1989,J.Cell Biochem.13D:301)和TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu等，1987,EMBO J.6:307)。或者，可以使用诸如以下的植物启动子核酮糖双磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光诱导型启动子(Coruzzi等，1984,EMBO J.3:1671；Broglie等，1984,Sicence 224:838)；甘露氨酸合酶启动子(Velten等，1984,EMBO J.3:2723)、胭脂氨酸合酶启动子(NOS)和章鱼氨酸合酶启动子(OCS)(在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导质粒上携带)或热激启动子例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等，1986,Mol.Cell.Biol.6:559；Severin等，1990,Plant Mol.Biol.,15:827)。
可用于本发明的启动子包括天然的组成型启动子和诱导型启动子以及工程启动子。CaMV启动子是组成型启动子的实例。为了最有效，诱导型启动子应该1)在缺乏所述诱导物的情况下提供低表达；2)在存在所述诱导物的情况下提供高表达；3)使用不干扰该植物正常生理的诱导方案；和4)对其它基因的表达没有影响。可用于植物中的诱导型启动子的实例包括用化学方法诱导的启动子，诸如被铜离子激活的酵母金属硫蛋白启动子(Mett等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.90:4567)；被取代的苯磺酰胺(例如除草剂安全剂)激活的In2-1和In2-2调节序列(Hershey等，1991,Plant Mol.Biol.,17:679)；和被糖皮质激素诱导的GRE调节序列(Schena等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:10421)。其它组成型和诱导型的启动子是本领域技术人员已知的。
选择的特定启动子应该能够引起充分表达，导致产生有效量的结构基因产物，例如RKN多肽，引起植物生物量的增加，因此导致植物产量提高。需要时，可以对用于本发明载体构成物中的启动子进行修饰，以影响其控制特性。
组织特异性启动子也可以用于本发明中。组织特异性启动子的一个实例是在茎分生组织(shoot meristems)中有活性的启动子(Atanassova等，1992,Plant J.2:291)。可用于转基因植物中的其它组织特异性启动子例如cdc2a启动子和cyc07启动子是本领域技术人员已知的。(参见例如Ito等，1994,Plant Mol.Biol.,24:863；Martinez等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7360；Medford等，1991,Plant Cell 3:359；Terada等，1993,Plant Journal,3:241；Wissenbach等，1993,Plant Journal 4:411)。有已知将表达限于特定植物部分或限制对特定刺激物应答而表达的启动子(例如patatin启动子或ADP葡糖焦磷酸化酶的大亚基或小亚基的启动子)。这些限制表达的启动子例如将表达导向根的启动子，可以与RKN有效连接，以指导主要在块茎中表达。本领域技术人员将知道许多可用于本发明中的这类植物部分特异性启动子。
需要时，可以对用于本发明核酸构成物中的启动子进行修饰，以影响其控制特性。例如，可以将CaMV 35S启动子连接至在无光情况下阻抑ssRUBISCO表达的ssRUBISCO基因的部分，以产生在叶中有活性而在根中无活性的启动子。可以如本文所述使用所产生的嵌合启动子。用于本说明书的短语“CaMV 35S”启动子因此包括CaMV 35S启动子的变异，例如通过与操纵基因区连接、随机诱变或控制的诱变等而衍生的启动子。此外，可以改变所述启动子，以含有多个“增强子序列”以有助于提高基因表达。
或者，可以选择所用的启动子，以赋予对诸如真菌感染的病害应答而特异性表达RKN。真菌病原体对植物的感染激活了防御相关的或病程相关的(PR)基因，所述基因编码(1)参与苯基丙酸类似物(phenylpropanoid)代谢的酶，诸如苯丙氨酸氨解酶、查耳酮合酶、4-香豆酸coA连接酶和香豆酸4-羟化酶，(2)修饰植物细胞壁的蛋白质，诸如富含羟脯氨酸的糖蛋白、富含甘氨酸的蛋白和过氧化物酶，(3)降解真菌细胞壁的酶，诸如壳多糖酶和葡聚糖酶，(4)奇异果甜蛋白样蛋白，或(5)尚不知功能的蛋白。已经从许多植物物种中分离出并鉴定了防御相关基因或PR基因。可以使用这些基因的启动子，以在转基因植物受病原体攻击，特别是受到真菌病原体(诸如Pi)攻击时，在这种植物中获得RKN的表达。选择的具体启动子应该能够引起RKN的充分表达，导致产生有效量的多肽。
可以任选地将选择标记与待插入的核酸序列连接。术语“标记”如以上定义。最好是，所述标记基因为抗生素抗性基因，由此可以用合适的抗生素从未转化的植物细胞中选择转化的植物细胞。适用于植物中的选择标记的实例包括腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和氨基糖苷3’-O-磷酸转移酶Ⅱ(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。其它合适的标记是本领域技术人员已知的。
用于本发明中以转化植物细胞的载体包括与启动子有效连接的、编码RKN多肽的核酸序列。为了实施按照本发明的转化方法，首先必需构建一种合适的载体，然后将其适当地引入所述植物细胞中。此中所用的载体的构建细节是植物基因工程领域的技术人员已知的。
可以用根癌农杆菌的Ti质粒、毛根诱导(Ri)质粒和植物病毒载体，将用于本发明的RKN核酸序列引入植物细胞中。(关于这类技术的综述，参见例如Weissbach和Weissbach,1988,Methods for PlantMolecular Biology,Ⅷ部分，第421-463页，Academic Press,NY；Grierson和Corey,1988,Plant Molecular Biology，第2版，第7-9章，Blackie,London；和Horsch等，1985,Science,227:1229；每个文献均通过引用结合到本文中)。除了衍生自农杆菌的Ti质粒或毛根诱导(Ri)质粒的植物转化载体之外，还可以利用可选择的转化方法，包括应用脂质体、电穿孔、提高游离核酸摄入的化学试剂、采用病毒或花粉的转化和应用生物弹道(biolistic)转化。
本领域技术人员能够选择用于引入相对完整状态的所述RKN多核苷酸序列的合适载体。因此，产生携带所引入核酸序列的植物的任何载体应该是足够的。可以预期甚至应用裸露的核酸片段，也可提供本发明的特性，尽管其效力低。选择的转化方法通常指导载体的选择或是否使用载体。
按照本发明的植物转化可以基本上用植物分子生物学领域的技术人员已知的各种方法中的任一种进行。(参见例如Methods ofEnzymology，第153卷，1987,Wu和Grossman编辑，Academic Press，通过引用结合到本文中)。本文所用的术语“转化”是指通过引入RKN核酸序列引起的宿主植物表型的改变。
例如，可以如上简述，利用含Ti质粒的根癌农杆菌，将RKN核酸序列引入植物细胞中。在使用根癌农杆菌培养物作为转化载体时，最好使用农杆菌的非致癌性菌株作为载体，以使转化组织可能进行正常的非致癌性分化。也优选所述农杆菌带有双元Ti质粒系统。这种双元系统包含1)第一Ti质粒，具有将转移核酸(T-DNA)引入植物所必需的毒性区，和2)嵌合质粒。后者含有邻接待转移核酸的野生型Ti质粒T-DNA区的至少一个边界区。已经表明双元Ti质粒系统有效地转化植物细胞(De Framond,1983,Biotechnology 1:262；Hoekema等，1983,Nature 303:179)。优选这种双元系统，因为它不需要整合到农杆菌的Ti质粒中，老方法需要整合。
在按照本发明的转化中涉及应用农杆菌的方法包括但不限于1)将农杆菌与培养的分离的原生质体共培养；2)用农杆菌转化植物细胞或组织；或3)用农杆菌转化种子、顶端或分生组织。
另外，可以如Bechtold等所述(1993,CR.Acad.Sci.Paris,316:1194)和本文实施例中所例举的，用农杆菌转化植物完成基因转移。这种方法基于农杆菌细胞悬浮液的真空浸润或浸渍。
将RKN多核苷酸引入植物细胞的优选方法是如上所述的用转化的根癌农杆菌感染这种植物细胞、外植体、分生组织或种子。在本领域已知的合适条件下，让转化的植物细胞生长形成苗、根，并进一步发育为植株。
或者，可以用机械或化学方法将RKN多核苷酸引入植物细胞中。例如，可以用微量移液管(micropipette)，通过微注射将所述核酸机械转移到植物细胞中。或者，可以采用聚乙二醇，聚乙二醇与被植物细胞吸收的遗传物质形成沉淀复合物，将所述核酸转移到所述细胞中。
也可以通过电穿孔将RKN多核苷酸引入植物细胞中(Fromm等，1985,Proc.Nalt.Acad.Sci.U.SA.82:5824，其通过引用结合到本文中)。在该技术中，在含有相关核酸序列的载体或核酸存在下，将植物原生质体电穿孔。高场强度的电脉冲可逆地透化膜，使得可以引入核酸。电穿孔的植物原生质体再形成细胞壁、分裂并形成植物愈伤组织。如本文所述，用表型标记完成对用转化基因转化的植物细胞的选择。
另一种将RKN多核苷酸引入植物细胞的方法是用带有待引入核酸的小粒子高速冲击穿透，所述核酸或者包含在这种粒子基质中，或者包含在其表面(Klein等，1987,Nature 327:70)。在Sanford等(1991,Techniques 3:3-16)和Klein等(1992,Bio/Techniques 10:286)中也描述了轰击转化法。尽管通常仅需要单一引入新核酸序列，但该方法尤其提供多次引入。
花椰菜花叶病毒(CaMV)也可以用作将核酸引入植物细胞的载体(美国专利第4,407,956)。将CaMV病毒核酸基因组插入亲代细菌质粒中，产生可以在细菌中繁殖的重组核酸分子。克隆后，可以再次克隆所述重组质粒，并通过引入所需核酸序列(例如RKN序列)进行进一步修饰。然后从亲代细菌质粒上切下所述重组载体的修饰的病毒部分，用来接种植物细胞或植株。
本文所用的术语“接触”是指将RKN引入植物细胞的任何方法，包括如上所述的化学方法和物理方法。接触最好是指通过用如上所述的RKN编码核酸转化的根癌农杆菌，将所述核酸或载体引入植物细胞(包括外植体、分生组织或种子)中。
通常，将转化的植物细胞再生，以获得来自转化方法的全株。转化的直接产物称为“转基因子”。本文所用的术语“生长”或“再生”是指从植物细胞、一组植物细胞、植物部分(包括种子)或植物段(plantpiece)(例如来自原生质体、愈伤组织或组织部分的植物段)培育出全株。
从原生质体再生在种间是不同的，但一般通过首先提供原生质体悬浮液开始该过程。在某些物种中，植株的形成可以从原生质体悬浮液诱导，然后成熟并萌发为天然植株。所述培养基一般含有生长和再生必需的各种氨基酸和激素。所用的激素的实例包括植物生长素和细胞因子。有时最好于培养基中加入谷氨酸和脯氨酸，尤其是对于诸如玉米和苜蓿的植物种。有效的再生将取决于培养基、基因型和培养史。如果控制这些变量，则再生可重现。
也可以从植物愈伤组织、外植体、器官或部分发生再生。可以在器官或植物部分再生背景下进行转化。(参见Methods in Enzymology,1987，第118卷，和Klee等，1987,Annual Review of Plant Physiology,38:467)。利用Horsch等，1985,Science 227:1229的叶圆盘-转化-再生法，将圆盘在选择培养基上培养，然后在约2-4周内形成苗。从愈伤组织中切下发育的苗，并移植到合适的促进生根选择培养基中。在出现根后，将发根的小植株尽可能快地移植到土壤中。如果需要，可以将小植株再进行盆栽直至达到成熟。
在无性繁殖的作物中，通过利用插条或组织培养技术，产生多个相同的植株，繁殖成熟的转基因植物。选择所需的转基因子，获得新变种，并无性繁殖用于商业应用。
在种子繁殖的作物中，使成熟的转基因植株自交产生纯合近交植株。所得的近交植株产生含新引入的外源基因的种子。种植这些种子，产生将产生所选定表型(例如增产)的植株。
从再生植株获得的部分例如花、种子、叶片、枝条、根、果实等包括在本发明内，前提是这些部分包含如上转化的细胞。所述再生植株的后代和变异体和突变体也包括在本发明范围内，前提是这些部分包含所引入的核酸序列。
可以通过目测观察，选择与野生型植株相比表现出产量或生物量增加的植株。在本发明的一个优选实施方案中，所述增产是根生产增加的结果。对于在干旱的不毛之地，例如沙漠条件下生长，或在水供应有限的地区例如在干旱条件下生长，这种根生产的增加可能特别重要。本发明包括用本发明方法产生的植物以及植物组织和种子。
在再一实施方案中，本发明提供一种方法，用于产生与野生型植株相比被鉴定为增产的遗传修饰植物。该方法包括将至少一种编码RKN多肽的核酸序列引入植物细胞中，以获得转化的植物细胞；在允许RKN多肽表达的条件下培育所述转化的植物细胞，以获得增产的植株。诸如环境条件和启动子诱导条件的条件根据物种的不同而变化，但在一个种内应该相同。
在另一实施方案中，本发明提供产生被鉴定为增产的植物的方法，即通过使感病植物与RKN启动子诱导量的诱导RKN基因表达的因子接触，其中RKN基因表达的诱导导致产生与未接触所述因子的植株相比增产的植株。
“感病植物”是指可以被诱导利用其内源RKN基因达到增产的植物。术语“启动子诱导量”是指将RKN基因表达提高至高于未接触所述因子的植物细胞中RKN表达所必需的因子的量。例如，可以用转录因子或化学试剂提高来自RKN天然启动子的基因表达。或者，RKN启动子可以是对诱导敏感的异源启动子。本发明的方法设想了接触含内源RKN启动子或重组产生的RKN启动子的细胞。
在另一实施方案中，本发明提供了一种方法，用于产生与未经遗传修饰的植物(例如野生型植物)相比被鉴定为在其根中目的基因产物表达增加的遗传修饰植物，即通过将至少一种编码目的基因产物的核酸序列引入植物细胞中，以获得转化的植物细胞，其中所述目的核酸序列与RKN表达控制序列有效地连接。在允许在所述植物的根中表达目的基因产物的条件下，由所述转化的植物细胞产生植株。
“目的基因产物”如上定义。目的基因产物包括但不限于赋予对病原体抗性的多肽。“病原体”是特定的生物致病因子。植物病原体包括细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫。赋予对病原体抗性的因子的实例是赋予对细菌抗性的抗生素、或赋予对真菌抗性的抗真菌剂。赋予对植物病原体抗性的合适的目的基因是本领域技术人员周知的。与本发明一起使用的基因的实例是MiAMP，其抑制各种各样的真菌、卵菌和细菌病原体生长(Marcus,J.P.等，1997,Eur.J.Biochem.244:743-9)；Nramp或OsNrampl，它们可以提供对细菌感染的抗性(Belouchi,A.等，1995,Plant Mol.Biol.29:1811-1196)；Pto，其赋予番茄对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的抗性(Martin,G.G.等，1993,Science262:1432-1436)；和rat2-5A合成酶，其赋予对植物病毒PVS、PVX和PVY的抗性(Truve,E.等，1994,Arch.Virol.增刊9:41-50)。也可以任选地将选择标记连接待插入的核酸序列。
上述公开内容总的描述了本发明。参考以下具体实施例可以获得更全面的理解，本文提供所述实施例仅用于说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1RKN基因的克隆1．水稻BAC文库的筛选图1图示了用来克隆所述RKN基因的克隆策略。将含有9个不完全的LRR的水稻cDNA克隆的1130bp片段用作探针，以筛选水稻BAC文库(由Tom Holsten友好地提供，Department of Plant Pathology,University of California,Davis(关于描述，参见Wang等，1995))。用于BAC筛选的杂交条件按照本文概述的提供者的方案。将通过筛孔分离的10片膜片于65℃在100ml预杂交液(7％SDS,0.5 Na2PO4,pH=7.2,1mM EDTA)中预杂交至少2小时。用随机标记制备探针，将其变性，加入该溶液中。于65℃过夜进行杂交。于室温下将杂交膜在500ml洗涤液(40mM Na2PO4,pH=7.2,0.1％SDS)中短暂地冲洗，然后于65℃洗涤10-20分钟。将膜对X胶片曝光。然后向加州戴维斯大学请求给予鉴定为阳性的菌落。2．由BAC克隆克隆RKN基因并对其测序采用本领域的常规方法(参见Manistis,1989)，由BAC克隆制备质粒。分离质粒DNA，并用几种不同的限制酶进行限制性消化。所得的产物经琼脂糖凝胶电泳分离，并与cLRR探针杂交(DNA印迹分析)。分离出与所述探针杂交的重叠带，并将其克隆到pBlurscript KS(-)载体(Strategene,La Jolla,CA)中。通过用cLRR探针进行DNA印迹分析证实亚克隆。最后从BAC克隆分离出一个3.5kb BamHⅠ片段和一个5.0kb HindⅢ片段，将其亚克隆到pBlurscript KS(-)中。或者通过产生多组嵌套式缺失(Ausubel等，1987)，或者通过合成寡核苷酸步查，对这两个片段测序，并且采用DNA序列试剂盒version 2.0(USB Corporation,Cleveland,OH)，通过双脱氧链终止法(Sanger等，1977；Del Sal等，1989)测定其衍生克隆的末端序列。用LaserGene程序(DNASTAR Inc.,Madison,WI)分析一级测序的数据。所述RKN基因(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列示于图2。推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)示于图4。用美国国立生物技术信息中心与BLAST程序(Altschul等，1990)进行数据库检索，用ALOM(Klein等，1985)分析潜在的周围区(periheralregion)和跨膜区的氨基酸序列(图3和5)。也鉴定出同源蛋白(图6和7)。结果1．RKN基因的分离和测序用含9个不完全LRR的水稻cDNA克隆的1130bp片段作为探针，筛选得自U.C.Davis的水稻BAC文库(Wang等，1995)，分离出平均DNA插入片段大小为125kb的5个阳性BAC克隆。将此探针进一步用于以EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和NotⅠ消化的这5个BAC克隆的DNA印迹分析中。分离出相应于与该探针杂交的带的几个片段，将其亚克隆并测序。DNA序列分析显示，一个4804bp HindⅢ片段编码一种新的富含亮氨酸的重复序列受体激酶样蛋白，命名为RKN基因。所述RKN基因有一个单一的2979个碱基对的大可读框(图2)，被一个243个碱基对的内含子中断，编码993个氨基酸的多肽，所述多肽的预测分子量为105.4kDa。它含有一种1196bp 5’非翻译区和一个386bp 3’非翻译区。2．RKN编码一种与植物中的各种受体蛋白激酶类似的、推定的富含亮氨酸的重复序列/受体蛋白激酶RKN基因预测的993个氨基酸的序列(图4)揭示出一个称为富含亮氨酸的重复序列(LRR)受体激酶的蛋白家族的典型结构(图3)。它具有一个23个氨基酸的疏水区段，后接一段可能参与形成同二聚体或异二聚体的43个氨基酸，所述疏水区段假定其用作信号肽，以将新合成的多肽转运到ER膜(van Heijne,1990)。氨基酸75-615构成主要的胞外结构域，该结构域含有22个不完全拷贝的24个氨基酸的富含亮氨酸的重复序列(LRR)，具有10个潜在的N-糖基化位点(N-X-T/S)，其侧翼为数对保守间隔的半胱氨酸。在RKN基因中也有一个预测的跨膜结构域(氨基酸619-636)，侧翼为两个富含带电氨基酸的终止转移序列。氨基酸660-993编码的序列含有一个推定的胞内蛋白激酶催化结构域。该区含有在几乎所有真核生物蛋白激酶中发现的所有11个亚结构域和所有不可变氨基酸残基。亚结构域Ⅵ中的HRDIKPSN序列和亚结构域Ⅷ中的GSCGYIAPE序列是功能为丝氨酸/苏氨酸激酶的强指示物，而不是功能为酪氨酸激酶的强指示物(Hanks和Quinn,1991)。3．RKN在水稻中是一种单拷贝基因分离出得自RKN、包括LRR20-22、跨膜结构域和激酶亚结构域Ⅰ-Ⅷ(氨基酸538-874)的1.15kb BamHⅠ/XbaⅠ DNA片段，将其用作探针，以检测水稻基因组中RKN基因的拷贝数。用4种不同的限制性酶(HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ)消化台北(Taipei)309水稻基因组，在高严格杂交条件下用所述探针进行DNA印迹。在每个泳道中仅检测到一条单带。该条单带恰好出现在用HindⅢ消化的泳道中4.8kb大小的位置，这与RKN基因的预测大小一致。在所述RKN基因中存在其它三种限制性酶的一个限制位点。DNA印迹结果提示，所述RKN基因在水稻基因组中以单拷贝存在。
实施例2RKN是一种功能性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶方法1．突变体的产生该实验中所用的方法基于Sambrook等(1989)描述的方案，并由Qun Zhu进行修改(1995)。简而言之，将靶片段克隆到pBlurscript(KS-)中，转化到dut-ung-大肠杆菌菌株RZl032(Quantum Biotechnologies Inc.,Quebec,Canada)中，制成单链DNA。将含有合适突变的磷酸化的寡核苷酸与所述单链DNA一起退火，用T4DNA聚合酶合成第二链DNA，用T4 DNA连接酶修补缺口。通过核苷酸序列分析证实含有突变的构成物。2．蛋白表达和纯化通过体外诱变产生编码RKN基因的全激酶结构域(无内含子)的DNA片段，并将其与S-标记和Hia-标记(Novagen,Inc.,Madison,WI)符合读框地克隆在载体pET-29a的EcoRⅤ和XhoⅠ位点之间。该载体含有融合于N末端用于快速分析的可切割S-标记序列和融合于C末端用于快速亲和纯化的His-标记序列。通过DNA测序证实称为pETK的所得融合构成物，并将其转化到细菌BL21(DE3)中，以表达S-标记-激酶-His-标记融合蛋白。将得自新鲜划线接种平板的单菌落接种到含合适抗生素的3ml LB中，振摇下于30℃培养过夜。然后将1ml过夜培养物转移到50ml含相同抗生素的LB中，并继续培养。当OD600达到0.4-1时，加入IPTG至终浓度为0.4mM，再继续培养3-4小时。通过于5000×g、4℃下离心5分钟收集细胞，将细胞再悬浮于0.2倍培养体积的含0.5mg溶菌酶/ml的冷结合缓冲液(20mM Tris-HCl,pH=7.9,0.5M NaCl,5mM咪唑)中。将细胞于冰上在结合缓冲液中孵育30分钟，然后将样品超声处理直至不再粘。将裂解液离心去除碎片，将上清液通过0.45微米膜过滤。然后采用生产商的方案(pETSystem Manual,Novagen Inc.,Madison,WI)，将可溶性蛋白上样于His-结合树脂。在洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,pH=7.9,0.5M NaCl,1M咪唑)中洗脱结合的蛋白，并以1ml等份收集。用Bio-Rad蛋白测定试剂盒或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定粗制蛋白提取物或纯化蛋白的浓度。3．蛋白质印迹分析用12％SDS-PAGE凝胶电泳分离粗制或纯化的蛋白，并采用标准蛋白质印迹方案(Sambrook,1989)将其转移到PVDF膜上。然后用对S-标记融合蛋白高度特异性的S-蛋白HRP缀合物(Novagen Inc.,产品69047-1)分析S-标记融合蛋白的表达。按照生产商的方案(Novagen,Inc.)，用SuperSignal CL-HRP底物试剂盒进行S-蛋白HRP缀合物的化学发光检测。4．自磷酸化蛋白激酶测定在每个激酶活性分析反应中使用约1-5μg蛋白，在含有10mMTris-HCl,pH=7.0、0.35mM DTT、10mM MgCl2、10μCi-ATP的30μl体积的测定混合物中，进行激酶活性分析。将混合物于30℃温育30分钟。通过加入SDS-PAGE样品缓冲液终止反应，并在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。然后将放射性凝胶进行放射自显影。结果为了确定RKN是否编码功能性蛋白激酶，将包含所述内含子的全激酶结构域克隆到pBluescript中。然后通过在剪接位置插入两个SmaⅠ位点，缺失亚结构域Ⅷ内的内含子，并且通过定点诱变将所述剪接位置再突变回原始序列CCAGAG。最后，将含有所有11个亚结构域且无内含子的激酶结构域在载体pET-29a的EcoRⅤ和XhoⅠ位点之间与S-标记和His-标记符合读框地融合，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。在12％SDS-PAGE凝胶上通过S-蛋白HRP缀合物检测所述融合蛋白，显示出具有预期的分子量41kDa。在无IPTG诱导时，所述融合蛋白以最低水平表达。如果所述培养物于室温下在0.4mMIPTG诱导下温育，则表达水平提高。亲和纯化所述融合蛋白，在考马斯蓝染色的12％SDS-PAGE中，可见到纯化的蛋白带。在体外激酶测定中将所纯化的融合蛋白与(32P)ATP一起温育，显示出在41kDa附近出现的自磷酸化带，提示该激酶能够强自磷酸化。当在激酶测定反应中用NaHPO4缓冲液，而不用Tris缓冲液时，没有自磷酸化功能。
实施例3在转基因植物中的功能分析方法1．转基因植物的产生如图9所示，用图10所示的构成物产生转基因植物。用标准方法获得转基因植物。2．GUS活性测定分别在GUS提取缓冲液(50mM NaPO4,pH=7.0,10mM β-巯基乙醇，10mM Na2EDTA,0.1％十二烷基肌氨酸钠，0.1％Triton X-100)中提取转基因幼苗植株的根、茎和叶片组织。按照Jefferson,R.A.(1987)中描述的荧光测定方案，通过从相应的β-葡糖苷酸产生4-甲基伞形酮的荧光测定，分析GUS活性。采用Bradford的方法(1976)测定蛋白浓度，GUS活性以每mg蛋白每分钟产物的pmol表示。结果1．构成物为了分析RKN基因在水稻中的功能，制备几种构成物转化台北309，以研究RKN在转基因水稻中的功能。通过用HindⅢ/XmaⅠ和HindⅢ/HincⅡ进行限制性酶消化，分别获得含有5’非翻译区和N-末端70氨基酸以及N-末端84氨基酸(-1033至+373和-1033至+415)的两个片段。将这两个片段分别融合至pBI101.3(Jefferson,R.A.,1987)的HindⅢ/SmaⅠ位点，得到符合读框的RKN启动子∷GUS基因融合体1和融合体2。通过测试GUS活性，用这两种RKN启动子∷GUS基因融合体研究该启动子在转基因水稻中的功能。为了在转基因水稻中过量表达RKN基因，将CaMV35S启动子的-90至-800增强子区插入BglⅡ位点，置于RKN基因转录位点上游-166之处，产生35S∷RKN基因融合体。2．在转基因水稻中的RKN启动子∷GUS基因融合体活性测定将水稻RKN基因的5’侧翼区(-1033至+373和-1033至+415)与连接至胭脂氨酸合酶基因终止子的GUS基因编码区融合，以便特异性地检测所述RKN基因的表达模式。采用生物弹道法(Methods ofEnzymology,1987，见上文)，将基因融合体与含潮霉素磷酸转移酶基因的质粒pMON410一起共转移到台北309水稻基因组中。将pMON410单独转化到水稻基因组中，用作对照。在这些转化中的每个转化中有几个再生的潮霉素抗性愈伤组织的独立的系。分别提取所述转基因幼苗的根、茎和叶片，并定量分析GUS活性。结果表明，在茎之间、叶片之间、对照和两个其它基因融合体转化体之间的GUS活性没有差异。然而，如图13所示，与对照系相比，基因融合体2的GUS活性高6倍，基因融合体1的GUS活性高3倍，这提示RKN基因在该植物根中有功能。3．35S∷RKN基因在水稻中的表达模式采用生物弹道法，将含有置于RKN基因转录位点上游-166之处的、CaMV 35S启动子的-90至-800增强子区以及含有全RKN编码区的35S∷RKN基因融合体与pMON410一起共转移到台北309水稻基因组中。提取来自转基因幼苗和野生型台北209幼苗的根、茎和叶片器官的RNA，通过RNA印迹测定检测RKN基因转录物的积累(参见图11)。将覆盖LRR 20-22、跨膜结构域和激酶亚结构域Ⅰ-Ⅷ(氨基酸528-874)的RKN的1.15kb BamHⅠ/XbaⅠ片段，用于DNA印迹和RNA杂交。在野生型水稻中几乎检测不到转录物，但在从35S∷RKN转基因水稻中提取的RNA中证实了全长的3.5kb RKN基因转录物。在35S∷RKN转基因水稻中，来自不同器官(叶片、茎和根)的RKN基因的RNA表达水平几乎相同。
实施例4转录和翻译起始位点方法1．引物延伸测定合成与推定的翻译起始位点ATG上游35bp的核苷酸互补的26-mer寡核苷酸RKN-PE 5’GGAGGAGTCGAAGGGAGGAGATGGCC 3’(SEQ ID NO:4)。用32P-ATP，通过T4多核苷酸激酶标记RKN-PE的5’末端(Sambrook等，1989)用于引物延伸分析。由35S:RKN基因融合体转化体的幼苗样本制备30μg总RNA，将其风干，再悬浮于7μl无菌TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH=8.3,1mM EDTA)中。然后加入1μl标记的RKN-PE引物(约7×10-3pmol)、2μl 5×退火缓冲液(10mMTris-HCl,pH=8.3,1mM EDTA,1.25M KCl)。于55℃退火30分钟后，将退火混合物短暂微量离心，再于55℃退火30分钟。在第二次退火后，则将含20mM Tris-HCl,pH=8.3、10mM MgCl2、100μg/ml放线菌素D、5mM DTT、0.33mM dNTP和10单位禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶(Life Science,Inc.,Florida)的23μl延伸溶液加入该混合物中。于37-39℃温育1小时后，用含有0.5M乙酸铵的300μl 100％EtOH沉淀引物延伸产物。于4℃微量离心15分钟后，用70％EtOH洗涤沉淀，然后真空干燥。将干燥的沉淀再充分悬浮于8μl 100％甲酰胺中，然后与2μl上样缓冲液(85％甲酰胺，10mM NaOH,0.05％溴酚蓝，0.05％二甲苯腈蓝)混合。将整个样品在8％测序凝胶上分离(Sambrook等，1989)。在此过程中，通过双脱氧链终止法，用相应的引物(OligoRKN-PE)和模板(RKN质粒)，进行序列反应，将反应物与所述引物延伸物(用作参考)同时上样至测序凝胶。用XAR胶片(Kodak)，通过放射自显影检测放射性产物。结果用分离自35S∷RKN转基因幼苗的不同器官的RNA，通过引物延伸分析测定转录起始位点。合成与第一个ATG下游残基69-42之处的反义DNA链序列相同的26-mer寡核苷酸，并用于引物延伸测定中。在所有样品(长100个核苷酸)获得了相应于直接重复序列ATGGCCATGGCC(SEQ ID NO:5)中第二个“A”位置的一种主要产物。将该位置定为+1。有两个推定的翻译起始密码子(ATG)，在其之间距离105bp。这两个密码子均在同一读框中，并且它们均在所述ATG上游-3bp位置有一个嘌呤(G)，这是适于真核生物中起始翻译的周围序列(context)(kozak,1989)。然而，疏水性作图表明，第二个ATG最可能是起始翻译的密码子，因为来自第二个ATG的NH2-末端编码为信号肽特征的23个疏水性残基(von Heijie,1990)。
实施例535S∷RKN基因融合体转基因水稻的表型在转基因植物中根生长速率提高方法如上所述获得转基因植物。将干燥的成熟种子于室温下浸入水中2-3天，然后于37℃温育过夜以进行萌发。将萌发的种子转移至膜，在28℃、水容器中于水表面生长，光周期为16小时光/8小时黑暗。每隔一天测定根长度。结果在该实验中使用粒子轰击法，以产生携带35S∷RKN基因融合体的转基因水稻。该方法的成功取决于愈伤组织的再生效率。在选择培养基上培养轰击材料，随后在预再生培养基上培养，然后将其转移至再生培养基上。一般而言，愈伤组织在2-4周内在再生培养基上再生得到苗，然后当将再生的苗转移至1/2MS培养基(Li,1993)时生根。
将35S∷RKN基因融合体构成物与pMON410一起共转化到水稻愈伤组织中，然后按正常的程序使愈伤组织进行再生。将单独用pMON转化的愈伤组织用作对照。
当将用35S∷RKN基因融合体构成物转化的愈伤组织转移至再生培养基时，与对照相比，所述愈伤组织非常快地再生(参见图12)。在1周内出现再生的苗，相比之下，对照在2-4周内产生苗。此外，含35S∷RKN基因融合体的愈伤组织快速生根，它在再生培养基中非常快且非常强的生长。将实验重复2次，在每次实验中表型是相同的。结果表明，RKN基因在水稻中过量表达，可以增强根的产生和愈伤组织再生。
尽管已经参考目前优选的实施方案描述了本发明，但应该理解，在不违背本发明精神的情况下可以进行各种修改。因此，本发明仅受以下权利要求书的限制。
序列表<110>zhong,Jingpingzhu,QunLamb,Christopher J.
<120>受体样蛋白激酶RKN和用其来增强植物生长和增产的方法<130>07251/021001<140>US 09/120,855<141>1998-07-21<160>8<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>4804<212>DNA<213>稻(Oryza sp.)<400>1aagcttgtgt atatgctcgt tccaagctac acatcatatt ctcctcggaa aagggaactt 60ataggttagt aatcctatgc acgccatcct ttctttcagt agaaacatgt gtaagatcgt 120gatgtgaaag taggtattaa atataggtgg attatctatc ttttttgctt attccggagg 180ttttttttga atttcaatgg ttggaattgg agtgtttcac atagaaattc ctttgttgca 240atgaaaatgt atctcattga attcatatat ttttaatgcc caggctgact aagctagcag 300catagcaaga aaaggtaaca gtactaatta ggagaaactt taccactctt aaagagatac 360aaaatttttc taatgtaaaa ttgggtaaag gtgccaattt ttactataca agatgtactt 420ctaatacata ggtcaaatta ctaactagtt aaactatgtt tgaaacaccg gaaaaattac 480tacttccctc cattttatat tataagttgt tttaactttt tttaagttga atttctttta 540atttgatcaa gtttataaaa aaacatatta gccaaaatat atttaatgtt agatttaagg 600aaactaattt gatgtttgag atgttactaa atttttaaac tttgataaat caaaacactt 660ataatatgaa acggagaacc cggagagata gttcctacga attttgattt tttttttgac 720aattccaaga aaacccctat gaaattcatg ggttccaaaa tctcttgaac caattgtgaa 780tagagctttt ttttttagaa ctgtcaatta acagagttaa tggcattatc agatcacaga 840gtaatatcat agtctgtgta aattcaagat cttaatccat attgatttga agtagcaaat 900gcaaggaaca aagaggagaa gaagaaaaaa aatggttggc tgctgcaata gtgggatcac 960cacccaaaac catctctttc caaagcgaag ccgaccaccg ccatcatggc cacctccacc1020tccacccatg gccatggcca tctcctccct tcgactcctc ctcctccccc ctccgacctc1080ctcatcatga catgccgcag ccacaatgta ccaccaccgc caccaccttt cccgccgcca1140ttttaccacc accccctcct cctcctcgca ccacctccac cacctccgcc accgccatgg1200ccgccgccgc cgtccatgtc ctgcttttgc tgctgcctct cgctaccatc acatccgcgt1260cgtcggcgcc gctcccgctg ctcgcgctgc tgtcgctgag gtcgtcgctg ggcgaccccg1320ccggcgcgct gcggtcgtgg acgtacgccg cggcggcgtc cgcgggcgcc accaggtcgc1380tggcgccgcc gtggtgcgcg tggcccgggg tggcgtgcga cggggcaacc ggggaggtcg1440tcggggccga cctgtcgcgg cggaacctgt ccggcaccgt gtcgcccacc gccgcgaggc1500tgctgtcccc gacgctgcg tcgctgaacc tcagcgggaa cggttcgccg gcgagctccc1560gccgcgtgct cctgctccgg cggctcgtgg cgcttgatgt tagccacaac ttcttcaact1620ccacgttccc cgacggcatc gccaagctcg gcgggttcgc cttccttgac gccttcagca1680actgcttcgt cggggagctc ccccgtggca tcggcgagct ccggaggctc gagcacctca1740acctcggtgg cagcttcttc aacgggagca tccccggcga ggtcgggcag ctgcggcggc1800tgcggtttct gcacctcgcg gggaaccgtc tctccgggcg gctgccgagg gagctcggcg1860agctcacgtc ggtcgaacac cttgagattg ggtacaatgc gtacgacggc gggataccgg1920agttcgggaa gatggcacag ctccggtacc tcgatatcgc cgccgccaac gtgtccgggc1980ccgtgccgcc ggagctcggc ggactcacgc ggcttgaatc tctgttcctg ttcaagaaca2040ggatcggccg gcgcgatccg ccgcggtggt ctcgcctccg agcgctccag gttctcgacg2100tctcggacaa ccacctcgcc ggcgcgatcc cggcgctcgg cgagcccacc aacctcacga2160cgctgaatct catgagcaac tccctctccg gcacgatccc ggcggcgatc ggcgcgctgc2220cgagcctcga ggtgctccag ctatggaaca actcgctcgc cgggaggctg ccggagtcgc2280tcggcgcgag ccggcggctt gtccggctcg acgtgtcgac gaactccctc tccggcccga2340ttcctcccgg tgtctgcgcc ggcaaccgcc tcgcccgcct catcctcttc gacaaccggt2400tcgactccgc gattccggcg agcctcgccg actgctcgtc gctgtggcgc gtccggctcg2460aggcgaaccg gctctccggc gagattccag cggggttcgg cgcgatacgg aatctgacgt2520acatggactt gagctccaac tcgctcaccg gcggcggcat tccggccgac ctggtcgctt2580ctcccagcct tgagtacttc aacgtctccg gcaacctggt cggccggccg ctgccggaca2640tggcgtggcg ggggccgaag ctgcaggtgt tcgcggcgag cagatgcggt ctggtcggcg2700agctcccggc gttcggcgcc accgggtgcg cgaacctgta ccgcctagag ttggccggga2760acgcgctggg cggcgggatc cccggcgaca ttggcagctg caagcggctg gtgagcttga2820ggctgcagca caacgagctc accggagaga taccggcggc gatcgcgctg ccgtcgatca2880ccgaggtcga cctgtctgga acgcgctcac cggcaccgtc cgccggggtt caccaactgc2940acgacgtgga gacgttcgac gtgtcgttca accacctggc gccggccgag ccgtcgtcgg3000acgccggcga acgcggcagc ccgcgcggca cacggcggcg atgtgggtgc ccgccgtggc3060ggtgcgcgtt cgccggcatg gtggtgctcg cgggcaccgc gcgctggctg cagtggcgtg3120gcggcgacga cacggccgcg gcagacgcgc gcggtcccgg cggcgcgcgc caccccgacc3180tcgtcgtcgg gccgtggcgg atgaccgcgt tccagaggct gagcttcacc gccgacgacg3240tgccgaggtg cgtcgagggg agcgacggca tcgtcggcgc cgggccgtcg gggacggtgt3300accgcgccaa gatgcccaat ggcgaggtca tcgccgtgaa gaagctgtgg caggcggcgg3360cgcagaagga ggcagccgca ccgacggagc agaaccagaa gctccggcaa gacagcgacg3420gcggcggcgg cggcaagagg acggtggccg aggtggaggt gctcggccac ctccgccacc3480gcaacatcgt ccggctgctg gggtggtgca ccaacggcga gcccacgatg ctgctctacg3540agtacatgcc caacggcagc cccgacgagc tcctccacgc ccgcgccaag gcgccgcggg3600ctgggacgcc cggtacaaga tcgccgtcgg tcgcgcaggg cgtcagctac ctccaccacg3660actgcctccc cgccatcgcg caccgcgaca tcaagcccag caacatcctc tcgacgacga3720catggaggca cgcgctcgcc gacttcggcg tcgccaaggc gctccagagc gccgccccca3780tgtccgtcgt cgccggctca tgcggctaca ttgcaccagg tgagccgcat acacatcatc3840cgccacgtgt ccatcaaaat cattactaac tccgtttcat gttataagac tttctaacat3900tgcccacata tcatatatat gttaatgaat ctagacacat gcgtatctag attgtgtcta3960gattcattaa catatatatg aatgtgggta atactagaaa gtcttataat ataaaataga4020tgaaataatt aatcatattt tttatttttg tcattttcta agagtacacg tacactctaa4080aagtgaacga gaagagcgat gtgtacagct tcggtgtggt actattggag atcctgacgg4140gacggcggtc ggtggaggcg gagtacgggg aggggaacaa catcgtggac tgggtgcggc4200ggaaggtggc cggaggcggg gtgggcgacg tgatcgacgc tgcggcgtgg gccgacaatg4260atgtcggtgg cacgcgggac gagatggcgc tggcgttagg gtggcgctgc tgtcaccagc4320cggtgccgca ggagcggccg tcgatgaggg aggtgctgtc catgctgcag gaggccaggc4380cgaaacggaa gaactcggcc aagaagcagg ttaagtaaaa tgggtgatgg ttaagtcttt4440agcagaaaga agaactaata tatatggtgt gctcttcgtg tgcagtgtgt gttgtgtatg4500tataattaac ttatttagtt actgtcatga atgggcttgc atatttcttg agcaattttc4560gtgatgttat ttaagggtga attacatttg ctatacaaat cttgttttaa actgtgtaat4620tgtattcagt tatgatgacc aatgtacacc gttataattt agatatatca cgcgattaac4680atcttgttta ttgataagtt actcggatag cagtgaaacc taaggaaaat ttcaactgtg4740caacttctgc aaaaatgatc aatgtgctga aaatactaac ggcctccaac ttaatggtaa4800gctt 4804<210>2<211>1028<212>PRT<213>稻<400>2Met Pro Gln Pro gln Cys Thr Thr Thr Ala Thr Thr Phe Pro Ala Ser1 5 10 15Ile Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg Thr Thr Ser Thr Thr Ser20 25 30Ala Thr Ala Met Ala Ala Ala Ala Val His Val Leu Leu Leu Leu Leu35 40 45Pro Leu Ala Thr Ile Thr Ser Ala Ser Ser Ala Pro Leu Pro Leu Leu50 55 60Ala Leu Leu Ser Leu Arg Ser Ser Leu Gly Asp Pro Ala Gly Ala Leu65 70 75 80Arg Ser Trp Thr Tyr Ala Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Thr Arg Ser85 90 95Leu Ala Pro Pro Trp Cys Ala Trp Pro Gly Val Ala Cys Asp Gly Ala100 105 110Thr Gly Glu Val Val Gly Val Asp Leu Ser Arg Arg Asn Leu Ser Gly115 120 125Thr Val Ser Pro Thr Ala Ala Arg Leu Leu Ser Pro Thr Leu Thr Ser130 135 140Leu Asn Leu Ser Gly Asn Gly Ser Pro Ala Ser Ser Arg Arg Val Leu145 150 155 160Leu Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Asp Val Ser His Asn Phe Phe Asn165 170 175Ser Thr Phe Pro Asp Gly Ile Ala Lys Leu Gly Gly Phe Ala Phe Leu180 185 190Asp Ala Phe Ser Asn Cys Phe Val Gly Glu Leu Pro Arg Gly Ile Gly195 200 205Glu Leu Arg Arg Leu Glu His Leu Asn Leu Gly Gly Ser Phe Phe Asn210 215 220Gly Ser Ile Pro Gly Glu Val Gly Gln Leu Arg Arg Leu Arg Phe Leu225 230 235 240His Leu Ala Gly Asn Arg Leu Ser Gly Arg Leu Pro Arg Glu Leu Gly245 250 255Glu Leu Thr Ser Val Glu His Leu Glu Ile Gly Tyr Asn Ala Tyr Asp260 265 270Gly Gly Ile Pro Glu Phe Gly Lys Met Ala Gln Leu Arg Tyr Leu Asp275 280 285Ile Ala Ala Ala Asn Val Ser Gly Pro Val Pro Pro Glu Leu Gly Gly290 295 300Leu Thr Arg Leu Glu Ser Leu Phe Leu Phe Lys Asn Arg Ile Gly Arg305 310 315 320Arg Asp Pro Pro Arg Trp Ser Arg Leu Arg Ala Leu Gln Val Leu Asp325 330 335Val Ser Asp Asn His Leu Ala Gly Ala Ile Pro Ala Leu Gly Glu Leu340 3A5 350Thr Asn Leu Thr Thr Leu Asn Leu Met Ser Asn Ser Leu Ser Gly Thr355 360 365Ile Pro Ala Ala Ile Gly Ala Leu Pro Ser Leu Glu Val Leu Gln Leu370 375 380Trp Asn Asn Ser Leu Ala Gly Arg Leu Pro Glu Ser Leu Gly Ala Ser385 390 395 400Arg Arg Leu Val Arg Leu Asp Val Ser Thr Asn Ser Leu Ser Gly Pro405 410 415Ile Pro Pro Gly Val Cys Ala Gly Asn Arg Leu Ala Arg Leu Ile Leu420 425 430Phe Asp Asn Arg Phe Asp Ser Ala Ile Pro Ala Ser Leu Ala Asp Cys435 440 445Ser Ser Leu Trp Arg Val Arg Leu Glu Ala Asn Arg Leu Ser Gly Glu
450 455 460Ile Pro Ala Gly Phe Gly Ala Ile Arg Asn Leu Thr Tyr Met Asp Leu465 470 475 480Ser Ser Asn Ser Leu Thr Gly Gly Gly Ile Pro Ala Asp Leu Val Ala485 490 495Ser Pro Ser Leu Glu Tyr Phe Asn Val Ser Gly Asn Leu Val Gly Arg500 505 510Pro Leu Pro Asp Met Ala Trp Arg Gly Pro Lys Leu Gln Val Phe Ala515 520 525Ala Ser Arg Cys Gly Leu Val Gly Glu Leu Pro Ala Phe Gly Ala Thr530 535 540Gly Cys Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Glu Leu Ala Gly Asn Ala Leu Gly545 550 555 560Gly Gly Ile Pro Gly Asp Ile Gly Ser Cys Lys Arg Leu Val Ser Leu565 570 575Arg Leu Gln His Asn Glu Leu Thr Gly Glu Ile Pro Ala Ala Ile Ala580 585 590Leu Pro Ser Ile Thr Glu Val Asp Leu Ser Gly Thr Arg Ser Pro Ala595 600 605Pro Ser Ala Gly Val His Gln Leu His Asp Val Glu Thr Phe Asp Val610 615 620Ser Phe Asn His Leu Ala Pro Ala Glu Pro Ser Ser Asp Ala Gly Glu625 630 635 640Arg Gly Ser Pro Arg Gly Thr Arg Arg Arg Cys Gly Cys Pro Pro Trp645 650 655Arg Cys Ala Phe Ala Gly Met Val Val Leu Ala Gly Thr Ala Arg Trp660 665 670Leu Gln Trp Arg Gly Gly Asp Asp Thr Ala Ala Ala Asp Ala Arg Gly675 680 685Pro Gly Gly Ala Arg His Pro Asp Leu Val Val Gly Pro Trp Arg Met690 695 700Thr Ala Phe Gln Arg Leu Ser Phe Thr Ala Asp Asp Val Pro Arg Cys705 710 715 720Val Glu Gly Ser Asp Gly Ile Val Gly Ala Gly Ser Ser Gly Thr Val725 730 735Tyr Arg Ala Lys Met Pro Asn Gly Glu Val lle Ala Val Lys Lys Leu740 745 750Trp Gln Ala Ala Ala Gln Lys Glu Ala Ala Ala Pro Thr Glu Gln Asn755 760 765Gln Lys Leu Arg Gln Asp Ser Asp Gly Gly Gly Gly Gly Lys Arg Thr770 775 780Val Ala Glu Val Glu Val Leu Gly His Leu Arg His Arg Asn Ile Val785 790 795 800Arg Leu Leu Gly Trp Cys Thr Asn Gly Glu Ser Thr Met Leu Leu Tyr805 810 815Glu Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Asp Glu Leu Leu His Ala Arg Ala820 825 830Lys Ala Pro Arg Ala Gly Thr Pro Gly Thr Arg Ser Pro Ser Val Ala835 840 845Gln Gly Val Ser Tyr Leu His His Asp Cys Leu Pro Ala Ile Ala His850 855 860Arg Asp Ile Lys Pro Ser Asn Ile Leu Ser Thr Thr Thr Trp Arg His865 870 875 880Ala Leu Ala Asp Phe Gly Val Ala Lys Ala Leu Gln Ser Ala Ala Pro885 890 895Met Ser Val Val Ala Gly Ser Cys Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Thr900 905 910Tyr Thr Leu Lys Val Asn Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val915 920 925Val Leu Leu Glu Ile Leu Thr Gly Arg Arg Ser Val Glu Ala Glu Tyr930 935 940Gly Glu Gly Asn Asn Ile Val Asp Trp Val Arg Arg Lys Val Ala Gly945 950 955 960Gly Gly Val Gly Asp Val Ile Asp Ala Ala Ala Trp Ala Asp Asn Asp965 970 975Val Gly Gly Thr Arg Asp Glu Met Ala Leu Ala Leu Gly Trp Arg Cys980 985990Cys His Gln Pro Val Pro Gln Glu Arg Pro Ser Met Arg Glu Val Leu995 10001005Ser Met Leu Gln Glu Ala Arg Pro Lys Arg Lys Asn Ser Ala Lys Lys101010151020Gln Val Lys Glx1025<210>3<211>1090<212>DNA<213>稻<400>3aagcttgtgt atatgctcgt tccaagctac acatcatatt ctcctcggaa aagggaactt60ataggttagt aatcctatgc acgccatcct ttctttcagt agaaacatgt gtaagatcgt 120gatgtgaaag taggtattaa atataggtgg attatctatc ttttttgctt attccggagg 180ttttttttga atttcaatgg ttggaattgg agtgtttcac atagaaattc ctttgttgca 240atgaaaatgt atctcattga attcatatat ttttaatgcc caggctgact aagctagcag 300catagcaaga aaaggtaaca gtactaatta ggagaaactt taccactctt aaagagatac 360aaaatttttc taatgtaaaa ttgggtaaag gtgccaattt ttactataca agatgtactt 420ctaatacata ggtcaaatta ctaactagtt aaactatgtt tgaaacaccg gaaaaattac 480tacttccctc cattttatat tataagttgt tttaactttt tttaagttga atttctttta 540atttgatcaa gtttataaaa aaacatatta gccaaaatat atttaatgtt agatttaagg 600aaactaattt gatgtttgag atgttactaa atttttaaac tttgataaat caaaacactt 660ataatatgaa acggagaacc cggagagata gttcctacga attttgattt tttttttgac 720aattccaaga aaacccctat gaaattcatg ggttccaaaa tctcttgaac caattgtgaa 780tagagctttt ttttttagaa ctgtcaatta acagagttaa tggcattatc agatcacaga 840gtaatatcat agtctgtgta aattcaagat cttaatccat attgatttga agtagcaaat 900gcaaggaaca aagaggagaa gaagaaaaaa aatggttggc tgctgcaata gtgggatcac 960cacccaaaac catctctttc caaagcgaag ccgaccaccg ccatcatggc cacctccacc 1020tccacccatg gccatggcca tctcctccct tcgactcctc ctcctccccc ctccgacctc 1080ctcatcatga 1090<210>4<211>26<212>DNA<213>稻<400>4ggaggagtcg aagggaggag atggcc 26<210>5<211>12<212>DNA<213>稻<400>5atggccatgg cc12<210>6<211>505<212>PRT<213>拟南芥属物种<400>6Pro Ser Ile Leu Cys His Leu Pro Ser Leu His Ser Leu Ser Leu Tyr1 5 10 15Asn Asn Ser Ile Asn Gly Ser Leu Ser Ala Asp Asp Phe Asp Thr Cys20 25 30His Asn Leu Ile Ser Leu Asp Leu Ser Glu Asn Leu Leu Val Gly Ser35 40 45Ile Pro Lys Ser Leu Pro Phe Asn Leu Pro Asn Leu Lys Phe Leu Glu50 55 60Ile Ser Gly Asn Asn Leu Ser Asp Thr Ile Pro Ser Ser Phe Gly Glu65 70 75 80Phe Arg Lys Leu Glu Ser Leu Asn Leu Ala Gly Asn Phe Leu Ser Gly85 90 95Thr Ile Pro Ala Ser Leu Gly Asn Val Thr Thr Leu Lys Glu Leu Lys100 105 110Leu Ala Tyr Asn Leu Phe Ser Pro Ser Gln Ile Pro Ser Gln Leu Gly115 120 125Aan Leu Thr Glu Leu Gln Val Leu Trp Leu Ala Gly Cys Asn Leu Val130 135 140Gly Pro Ile Pro Pro Ser Leu Ser Arg Leu Thr Ser Leu Val Asn Leu145 150 155 160Asp Leu Thr Phe Asn Gln Leu Thr Gly Ser Ile Pro Ser Trp Ile Thr165 170 175Gln Leu Lys Thr Val Glu Gln Ile Glu Leu Phe Asn Asn Ser Phe Ser180 185 190Gly Glu Leu Pro Glu Ser Met Gly Asn Met Thr Thr Leu Lys Arg Phe195 200 205Asp Ala Ser Met Asn Lys Leu Thr Gly Lys Ile Pro Asp Asn Leu Asn210 215 220Leu Leu Asn Leu Glu Ser Leu Asn Leu Phe Glu Asn Met Leu Glu Gly225 230 235 240Pro Leu Pro Glu Ser Ile Thr Arg Ser Lys Thr Leu Ser Glu Leu Lys245 250 255Leu Phe Asn Asn Arg Leu Thr Gly Val Leu Pro Ser Gln Leu Gly Ala260 265 270Asn Ser Pro Leu Gln Tyr Val Asp Leu Ser Tyr Asn Arg Phe Ser Gly275 280 285Glu Ile Pro Ala Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Leu Glu Tyr Leu Ile290 295 300Leu Ile Asp Asn Ser Phe Ser Gly Glu Ile Ser Asn Asn Leu Gly Lys305 310 315 320Cys Lys Ser Leu Thr Arg Val Arg Leu Ser Asn Asn Lys Leu Ser Gly325 330 335Gln Ile Pro His Gly Phe Trp Gly Leu Pro Arg Leu Ser Leu Leu Glu340 345 350Leu Ser Asp Asn Ser Phe Thr Gly Ser Ile Pro Lys Thr Ile Ile Gly355 360 365Ala Lys Asn Leu Ser Asn Leu Arg Ile Ser Lys Asn Arg Phe Ser Gly370 375 380Ser Ile Pro Asn Glu Ile Gly Ser Leu Asn Gly Ile Ile Glu Ile Ser385 390 395 400Gly Ala Glu Asn Asp Phe Ser Gly Glu Ile Pro Glu Ser Leu Val Lys405 410 415Leu Lys Gln Leu Ser Arg Leu Asp Leu Ser Lys Asn Gln Leu Ser Gly420 425 430Glu Ile Pro Arg Glu Leu Arg Gly Trp Lys Asn Leu Asn Glu Leu Asn435 440 445Leu Ala Asn Asn His Leu Ser Gly Glu Ile Pro Lys Glu Val Gly Ile450 455 460Leu Pro Val Leu Asn Tyr Leu Asp Leu Ser Ser Asn Gln Phe Ser Gly465 470 475 480Glu Ile Pro Leu Glu Leu Gln Asn Leu Lys Leu Asn Val Leu Asn Leu485 490 495Ser Tyr Asn His Leu Ser Gly Lys Ile500 505<210>7<211>466<212>PRT<213>拟南芥属物种<400>7Leu Asn Leu Ser Asp Leu Asn Leu Asp Gly Glu Ile Ser Pro Ala Ilel 5 10 15Gly Asp Leu Lys Ser Leu Leu Ser Ile Asp Leu Arg Gly Asn Arg Leu20 25 30Ser Gly Gln Ile Pro Asp Glu Ile Gly Asp Cys Ser Ser Leu Gln Asn35 40 45Leu Asp Leu Ser Phe Asn Glu Leu Ser Gly Asp Ile Pro Phe Ser Ile50 55 60Ser Lys Leu Lys Gln Leu Glu Gln Leu Ile Leu Lys Asn Asn Gln Leu65 70 75 80Ile Gly Pro Ile Pro Ser Thr Leu Ser Gln Ile Pro Asn Leu Lys Ile85 90 95Leu Asp Leu Ala Gln Asn Lys Leu Ser Gly Glu Ile Pro Arg Leu Ile100 105 110Tyr Trp Asn Glu Val Leu Gln Tyr Leu Gly Leu Arg Gly Asn Asn Leu115 120 125Val Gly Asn Ile Ser Pro Asp Leu Cys Gln Leu Thr Gly Leu Trp Tyr130 135 140Phe Asp Val Arg Asn Asn Ser Leu Thr Gly Ser Ile Pro Glu Thr Ile145 150 155 160Gly Asn Cys Thr Ala Phe Gln Val Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Gln Leu165 170 175Thr Gly Glu Ile Pro Phe Asp Ile Gly Phe Leu Gln Val Ala Thr Leu180 185 190Ser Leu Gln Gly Asn Gln Leu Ser Gly Lys Ile Pro Ser Val Ile Gly195 200 205Leu Met Gln Ala Leu Ala Val Leu Asp Leu Ser Gly Asn Leu Leu Ser210 215 220Gly Ser Ile Pro Pro Ile Leu Gly Asn Leu Thr Phe Thr Glu Lys Leu225 230 235 240Tyr Leu His Ser Asn Lys Leu Thr Gly Ser Ile Pro Pro Glu Leu Gly245 250 255Asn Met Ser Lys Leu His Tyr Leu Glu Leu Asn Asp Asn His Leu Thr
260 265 270Gly His Ile Pro Pro Glu Leu Gly Lys Leu Thr Asp Leu Phe Asp Leu275 280 285Asn Val Ala Asn Asn Asp Leu Glu Gly Pro Ile Pro Asp His Leu Ser290 295 300Ser Cys Thr Asn Leu Asn Ser Leu Asn Val His Gly Asn Lys Phe Ser305 310 315 320Gly Thr Ile Pro Arg Ala Phe Gln Lys Leu Glu Ser Met Thr Tyr Leu325 330 335Asn Leu Ser Ser Asn Asn Ile Lys Gly Pro Ile Pro Val Glu Leu Ser340 345 350Arg Ile Gly Asn Leu Asp Thr Leu Asp Leu Ser Asn Asn Lys Ile Asn355 360 365Gly Ile Ile Pro Ser Ser Leu Gly Asp Leu Glu His Leu Leu Lys Met370 375 380Asn Leu Ser Arg Asn His Ile Thr Gly Val Val Pro Gly Asp Phe Gly385 390 395 400Asn Leu Arg Ser Ile Met Glu Ile Asp Leu Ser Asn Asn Asp Ile Ser405 410 415Gly Pro Ile Pro Glu Glu Leu Asn Gln Leu Gln Asn Ile Ile Leu Leu420 425 430Arg Leu Glu Asn Asn Asn Leu Thr Gly Asn Val Gly Ser Leu Ala Asn435 440 445Cys Leu Ser Leu Thr Val Leu Asn Val Ser His Asn Asn Leu Val Gly450 455 460Asp Ile465<210>8<211>554<212>PRT<213>稻<400>8Val Val Lya Leu Leu Leu Arg Ser Ser Asn Leu Ser Gly Ile Ile Ser1 5 10 15Pro Ser Leu Gly Asn Leu Ser Phe Leu Arg Glu Leu Asp Leu Gly Asp20 25 30Asn Tyr Leu Ser Gly Glu Ile Pro Pro Glu Leu Ser Arg Leu Ser Arg35 40 45Leu Gln Leu Leu Glu Leu Ser Asp Asn Ser Ile Gln Gly Ser Ile Pro50 55 60Ala Ala Ile Gly Ala Cys Thr Lys Leu Thr Ser Leu Asp Leu Ser His65 70 75 80Asn Gln Leu Arg Gly Met Ile Pro Arg Glu Ile Gly Ala Ser Leu Lys85 90 95His Leu Ser Asn Leu Tyr Leu Tyr Lys Asn Gly Leu Ser Gly Glu Ile100 105 110Pro Ser Ala Leu Gly Asn Leu Thr Ser Leu Gln Glu Phe Asp Leu Ser115 120 125Phe Asn Arg Leu Ser Gly Ala Ile Pro Ser Ser Leu Gly Gln Leu Ser130 135 140Ser Leu Leu Thr Met Asn Leu Gly Gln Asn Asn Leu Ser Gly Met Ile145 150 155 160Pro Asn Ser Ile Trp Asn Leu Ser Ser Leu Arg Ala Phe Ser Val Arg165 170 175Glu Asn Lys Leu Gly Gly Met Ile Pro Thr Asn Ala Phe Lys Thr Leu180 185 190His Leu Leu Glu Val Ile Asp Met Gly Thr Asn Arg Phe His Gly Lys195 200 205Ile Pro Ala Ser Val Ala Asn Ala Ser His Leu Thr Val Ile Gln Ile210 215 220Tyr Gly Asn Leu Phe Ser Gly Ile Ile Thr Ser Gly Phe Gly Arg Leu225 230 235 240Arg Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Leu Trp Arg Asn Leu Phe Gln Thr Arg245 250 255Glu Gln Asp Asp Trp Gly Phe Ile Ser Asp Leu Thr Asn Cys Ser Lys260 265 270Leu Gln Thr Leu Asn Leu Gly Glu Asn Asn Leu Gly Gly Val Leu Pro275 280 285Asn Ser Phe Ser Asn Leu Ser Thr Ser Leu Ser Phe Leu Ala Leu Glu290 295 300Leu Asn Lys Ile Thr Gly Ser Ile Pro Lys Asp Ile Gly Asn Leu Ile305 310 315 320Gly Leu Gln His Leu Tyr Leu Cys Asn Asn Asn Phe Arg Gly Ser Leu325 330 335Pro Ser Ser Leu Gly Arg Leu Lys Asn Leu Gly Ile Leu Leu Ala Tyr340 345 350Glu Asn Asn Leu Ser Gly Ser Ile Pro Leu Ala Ile Gly Asn Leu Thr355 360 365Glu Leu Asn Ile Leu Leu Leu Gly Thr Asn Lys Phe Ser Gly Trp Ile370 375 380Pro Tyr Thr Leu Ser Asn Leu Thr Asn Leu Leu Ser Leu Gly Leu Ser385 390 395 400Thr Asn Asn Leu Ser Gly Pro Ile Pro Ser Glu Leu Phe Asn Ile Gln405 410 415Thr Leu Ser Ile Met Ile Asn Val Ser Lys Asn Asn Leu Glu Gly Ser420 425 430Ile Pro Gln Glu Ile Gly His Leu Lys Asn Leu Val Glu Phe His Ala435 440 445Glu Ser Asn Arg Leu Ser Gly Lys Ile Pro Asn Thr Leu Gly Asp Cys450 455 460Gln Leu Leu Arg Tyr Leu Tyr Leu Gln Asn Asn Leu Leu Ser Gly Ser465 470 475 480Ile Pro Ser Ala Leu Gly Gln Leu Lys Gly Leu Glu Thr Leu Asp Leu485 490 495Ser Ser Asn Asn Leu Ser Gly Gln Ile Pro Thr Ser Leu Ala Asp Ile500 505 510Thr Met Leu His Ser Leu Asn Leu Ser Phe Asn Ser Phe Val Gly Glu515 520 525Val Pro Thr Ile Gly Ala Phe Ala Ala Ala Ser Gly Ile Ser Ile Gln530 535 540Gly Asn Ala Lys Leu Cys Gly Gly Ile Pro545 550
权利要求
1．基本纯化的RKN受体样蛋白激酶多肽。
2．权利要求1的多肽及其保守变异体，其中所述蛋白包含在SEQID NO:2中提出的氨基酸序列。
3．其氨基酸序列与SEQ ID NO:2中提出的氨基酸序列至少60％相同的基本纯化的多肽。
4．基本纯化的多肽，其为SEQ ID NO:2的片段或类似物。
5．编码权利要求1的RKN多肽的分离的多核苷酸。
6．编码SEQ ID NO:2中提出的氨基酸序列的权利要求1的多核苷酸。
7．权利要求2的多核苷酸或其简并变异体，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1中提出的序列。
8．分离的多核苷酸，选自a) SEQ ID NO:1；b) SEQ ID NO:1，其中T也可以是U；c) 与SEQ ID NO:1互补的核酸序列；d) a)、b)或c)的至少长15个碱基的片段，所述片段将与编码SEQ ID NO:2中提出的RKN的DNA杂交。
9．权利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸有效连接至表达控制序列。
10．权利要求9的多核苷酸，其中所述表达控制序列为启动子。
11．权利要求10的多核苷酸，其中所述启动子为组织特异性启动子。
12．含有权利要求8的多核苷酸的表达载体。
13．权利要求12的表达载体，还包含一种选择标记。
14．权利要求13的表达载体，其中所述选择标记赋予抗生素抗性。
15．权利要求12的表达载体，其中所述载体为病毒载体。
16．权利要求12的表达载体，其中所述载体为质粒。
17．权利要求16的表达载体，其中所述质粒为根癌农杆菌的Ti质粒。
18．权利要求16的表达载体，其中所述质粒为根癌农杆菌的Ri质粒。
19．含有权利要求12的载体的宿主细胞。
20．结合于权利要求1的蛋白或结合于所述蛋白的抗原性片段的抗体。
21．包含功能性RKN表达控制序列的多核苷酸。
22．权利要求21的序列或其功能片段，其中所述RKN表达控制序列包含SEQ ID NO:3的序列。
23．权利要求21的序列，其中所述RKN表达控制序列包含SEQID NO:3的序列。
24．多核苷酸序列，其包含有效连接至编码异源蛋白的核酸序列的功能性RKN表达控制序列。
25．权利要求24的多核苷酸，其中所述异源蛋白为选择标记。
26．含有权利要求21的多核苷酸的表达载体。
27．权利要求26的载体，其中所述载体为质粒。
28．权利要求27的载体，其中所述质粒为根癌农杆菌的Ti质粒。
29．权利要求27的载体，其中所述质粒为根癌农杆菌的Ri质粒。
30．权利要求26的载体，其中所述载体为病毒载体。
31．含有权利要求26的载体的宿主细胞。
32．产生与相应的野生型植物相比被鉴定为生长和产量增加的遗传修饰植物的方法，所述方法包括a) 使植物细胞与编码RKN多肽的核酸接触，其中所述核酸与表达控制序列有效连接，获得转化的植物细胞；b)在允许表达RKN的条件下由所述转化的植物细胞产生植株；和c)选择表现出增产的植株。
33．权利要求32的方法，其中所述遗修饰植物表现出根生长增力。
34．权利要求32的方法，其中所述表达控制序列是启动子。
35．权利要求32的方法，其中所述接触通过物理方法进行。
36．权利要求32的方法，其中所述接触通过化学方法进行。
37．权利要求32的方法，其中所述植物细胞选自原生质体、产生配子的细胞和再生为全株的细胞。
38．权利要求32的方法，其中所述核酸包含于T-DNA衍生载体中。
39．通过权利要求32的方法产生的植物。
40．得自用权利要求32的方法产生的植物的植物组织。
41．得自用权利要求32的方法产生的植物的种子。
42．产生遗传修饰植物细胞的方法，使得由所述细胞产生的植物与野生型植物相比被鉴定为具有调节的产量，所述方法包括a)将权利要求5的RKN多核苷酸引入植物细胞中，获得转化的植物细胞；并且b)在允许调节受体样蛋白激酶(RKN)多肽的条件下培育所述转化的植物细胞，由此产生具有调节产量的植物。
43．权利要求42的方法，其中所述调节的产量是增加的产量。
44．权利要求43的方法，其中通过增加所述植物中受体样蛋白激酶(RKN)表达，达到所述增加产量。
45．产生与野生型植物相比被鉴定为增产的植物的方法，所述方法包括使感病植物与一种因子接触，其中所述因子的量为将RKN基因表达提高至高于未接触所述因子的植物中RKN表达所必需的RKN启动子诱导量。
46．权利要求45的方法，其中所述因子为转录因子。
47．权利要求45的方法，其中所述因子为化学试剂。
48．得自用权利要求42的方法产生的植物的植物组织。
49．得自用权利要求42的方法产生的植物的种子。
50．产生与相应的野生型植物相比被鉴定为在其根中目的基因产生表达增加的遗传修饰植物的方法，所述方法包括a)使植物细胞与包括有效连接所述目的基因产物编码区的RKN表达控制序列的多核苷酸接触，以获得转化的植物细胞；b)由所述转化植物细胞产生植株；和c)选择表现出在其根中所述目的基因产物的所述表达增加的植株。
51．权利要求50的方法，其中所述RKN的表达控制序列为RKN启动子。
52．权利要求50的方法，其中所述RKN的表达控制序列包含SEQID NO:3或其功能片段。
53．权利要求50的方法，其中所述接触通过物理方法进行。
54．权利要求50的方法，其中所述接触通过化学方法进行。
55．权利要求50的方法，其中所述植物细胞选自原生质体、产生配子的细胞和再生为全株的细胞。
56．权利要求50的方法，其中所述核酸包含于T-DNA衍生载体中。
57．通过权利要求50的方法产生的植物。
58．得自用权利要求50的方法产生的植物的植物组织。
59．得自用权利要求50的方法产生的植物的种子。
60．产生遗传转化的抗病性植物的方法，所述方法包括将核酸序列引入植物细胞基因组中，以获得转化的植物细胞，其中所述核酸序列包含(1)有效连接至(2)的表达控制序列，(2)编码赋予对病原体抗性的多肽的多核苷酸。
61．权利要求60的方法，其中所述RKN的表达控制序列为SEQID NO:3或其功能片段。
62．权利要求60的方法，其中所述病原体是细菌病原体。
63．权利要求60的方法，其中所述病原体是真菌病原体。
64．通过权利要求60的方法产生的植物。
65．得自用权利要求60的方法产生的植物的植物组织。
66．得自用权利要求60的方法产生的植物的种子。
全文摘要
本发明基于这样一个发现:通过提高受体样蛋白激酶(RLK)家族的一个成员受体样蛋白激酶(RKN)的水平,可以达到增加植物的生长和产量。提供RKN多肽和编码RKN多肽的多核苷酸,也提供RKN表达控制序列。也包括产生与相应的野生型植物相比被鉴定为生长和产量增加的遗传修饰植物的方法。也提供遗传修饰植物细胞以使由所述细胞产生的植物具有调节的产量的方法。也提供产生与相应的野生型植物相比被鉴定为在其根中目的基因产物表达增加的遗传修饰植物的方法。本发明也提供由本发明的遗传修饰植物产生的植物、植物组织和种子。
文档编号C12N1/19GK1318974SQ99811101
公开日2001年10月24日 申请日期1999年7月21日 优先权日1998年7月21日
发明者J·钟, Q·朱, C·J·拉姆 申请人:索尔克生物学研究院