检测遗传突变的方法

专利名称：：检测遗传突变的方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测遗传性变型的方法，包括与抗药性、癌、遗传功能障碍性疾病相关的遗传性变型的方法。
背景技术：
：结合药物治疗或高活性抗逆转录病毒治疗(HAART)是治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染个体的主要方法。由于HAART可以将患者血液中的病毒复制抑制至检测不到的水平，因此己显著降低了HIV感染患者的发病率和死亡率(Eggeretal,BMJ315:1194-9(1997)，Palellaetal，NEnglJMed338:853-60(1998))。然而，对于HAART的反应经常是易变的。有些患者反应良好，可以成功抑制病毒的复制，而其它患者在HAART之后不久就治疗失败了。来自HAART治疗失败患者的蛋白酶和反转录酶(RT)基因序列分析显示对多种药物的4元'〖生(Condraetal,JVirol70:8270-6(1996),LarderandKemp,Science246:1155-8(1989)，Johnsonetal，Top.HIVMed.13:125-131(2005))。这些突变林的生物功能已经通过体外分析而证实，即将这些突变抹导入感染的分子克隆中并测定这些克隆对药物的易感性(KellamandLarder,JVirol69:669-74(1995))。这些数据显示遗传改变是产生多种抗药性(MDR)的基础。HIV-1基因组是高度变化的，并且每个感染的个体包含大量在遗传上相似但又不同的病毒变体(准种)。当治疗患者体内发生抗药性时，己显示至少某些病毒基因组不包含抗药性突变。在含有抗性突变的病毒中，每个基因组中这些突变的数目是不同的。因此，抗药性突变和治疗效果之间的相互关系只能通过测定来自感染个体的大量的病毒群体中每个病毒基因组中的抗药性突变的同一性、性质和数目来充分了解。对于抗药性机制的理解将推进更有效地开发抗逆转录病毒药物、更好的治疗方案以及更准确的疗效预测。目前，两种方法可用于一企测抗药性突变的存在并预测对于新的HAART方案产生抗性的可能性(Petropoulosetal,AntimicrobAgentsChemother44:920-8(2000)，VanLaethemetal,JAcquirImmuneDeficSyndr22:107-18(1999))。然而，这两种测试方法对检测较小的抗药性病毒群体的灵敏度很低，并且不能可靠的检测野生型病毒中抗药性病毒所占的百分比。此外，由于抗药性突变是基于病毒群体进行检测，因此这两种测试方法都不适于连锁分析，而该连锁分析可以揭示对于理解抗药性机制和预测治疗效果所需的关键性信息。最近，开发了多种检测较小的抗药性群体的实时PCR方法(Charpentieretal，JVirol78:4234-47(2004),Hanceetal,JVirol75:6410-7(2001)，Metzneretal，JInfectDis188:1433-43(2003)，Metzneretal,Aids19:1819-25(2005)，Moheyetal,JClinVirol34:257-67(2005),Thelwelletal，NucleicAcidsRes28:3752-61(2000)，Whitcombeetal，NatBiotechnol17:804-7(1999))。但是这些测试方法每次仅能检测一种抗药性突变，这使得它们对于全部的抗药性突变的分析的实用性较低。并且，对于HIV-1基因组中的高度遗传变异性，很难设计能够用来检测大多数遗传性变型的全部抗药性突变。克隆测序方法己用于研究较小的抗药性病毒群体、每个病毒基因组上抗药性突变分布和大量病毒克隆的连锁分析。虽然可以获得全部扩增子的序列，但是该方法耗力、费时。该测试方法的灵敏度受分析过程中可用克隆的数量所限制，并且该方法受PCR扩增过程中不同病毒基因组或病毒基因组扩增子间的重组和相同分子的重复取样影响。有限稀释PCR或单基因组扩增法(SGA)能显著地减少以上所涉及问题的可能性，但是其高成本阻碍了它在抗药性突变的常规检测中的应用(Palmeretal,JClinMicrobial43:406-13(2005))。己经开发了高通量测序方法并有可能用于检测抗药性突变。皮升规模和多重聚合酶克隆测序方法(picoliter-scaleandmultiplexpolonysequencingmethod)能够用于以成本效益好的方式测序病毒基因组(Marguliesetal,Natur6437:376-80(2005)，Shendureetal，Science309:1728-32(2005))。病毒基因组是由短的DNA片段(分别为200bp和20bp)装配而成。因此，不能从单个病毒基因组获得全部的抗性突变，并且连锁分析不能使用通过两种方法中任一方法所获得的序列来进行。由于高水平的遗传变异性，很难设计引物集来覆盖可以包含全部抗药性突变的Jw/基因。在这两种方法中，从患者血浆中制备小量RNA分子的样本很复杂(Rogersetal，Nature437:326-7(2005))。鉴于上述观点，亟需开发能够用于检测较小的抗药性群体(^0.01%)、同时分析几万个病毒基因组、使用有限的样本在单分子水平鉴定所有主要突变、确定一个病毒基因组中存在的不同抗药性突变的百分比和进行连锁分析的方法。本发明涉及一种可以满足以上所有要求的新型平行等位基因特异性序列测定方法(PASS)。它可用于研究多重抗药性的机制，并且可以提供用来预测治疗效果的方法。
发明内容本发明涉及一种检测遗传性变型的方法，包括与抗药性、癌和遗传功能障碍性疾病相关的遗传性变型的方法。在一个特别的实施方案中，本发明涉及一种可用于检测较小的抗药性群体的测试方法，如病毒群体。本发明的目的和优势将从以下描述清晰体现。图1A和1B。平行等位基因特异性序列测定方法(PASS)的图示。(图1A)将未修饰的5'端引物、Acrydite化的3'端引物、DNA模板和PCR试剂包埋于6%的丙烯酰胺凝胶中。由于在聚合反应过程中，Acrydite化的引物和聚丙烯酰胺凝胶共价偶联而被固定，所以扩增的PCR产物积聚在DNA模板周围并在扩增位点形成各自的点(聚合酶克隆(polony))。双链DNA变性后，洗脱游离的DNA链，而从Acrydite化引物延伸的DNA链保留在凝胶中。然后将测序引物退火到单链模板上并用荧光标记的野生型或抗性碱基进行延伸。然后将凝胶用微阵列扫描仪扫描获得图像。(图1B)将引物的3'端与抗药性突变位点并置。在用荧光标记的核苷酸延伸引物后，通过掺入的荧光团能够确定突变位点处的碱基身份。模板序列在底部显示，M184V引物序列用下划线标示。引物序列在上部显示。加入的野生型(WT)碱基用Cy3标记并用绿色表示。掺入的突变碱基用Cy5标记并用红色表示。图2A-2C。通过PASS检测小比率抗药性基因突变位点(minordrug-resistancemutation)。按照标准的PASS测序方法，将野生型(WT)和突变型克隆混合。将这些聚合酶克隆用M184V引物进行序列测定，对于野生型碱基用Cy3-dATP标记、对于突变型碱基用Cy5-dCTP标记。首先获得Cy3野生型通道图像(图2A),然后为Cy5突变通道(图2B)。最后，将两个图像相互叠加从而在同一图像中显示突变型和野生型病毒的群体(图2C)。图3A-3C。通过PASS检测小比率抗药性群体。(图3A)将E44D突变克隆(WEAU-E44D)和野生型克隆(WEAU-wt)按1:10连续稀释进行混合。PCR扩增后，将这些聚合酶克隆用E44D引物进行测序，对于野生型碱基用Cy3-dATP标记(绿色)，对于突变石成基用Cy5-dCTP标记(红色)。如图3B显示，比例为1:1000的突变型/野生型混合物的分子数增加了10倍，以便在更大的野生型病毒群体中更好地检测稀少的抗性突变。PCR扩增后，将这些聚合酶克隆用E44D引物进行测序，对于野生型碱基用Cy3-dATP标记(绿色)，对于突变用Cy5-dCTP标记(红色)。检测小比率抗药性群体的PASS分析的灵敏度(图3C)。将在图3A中显示的对于每种野生型突变型比例的相同实验重复进行6次。进行线性回归分析并绘图。误差条代表平均值士SD。图4A-4C。不同分子上多个抗药性突变的检测。将三个抗药性突变(L90M、E44D和M184V)引入野生型WEAU;o/基因中。在PASS测定中，将野生型克隆(WEAU-wt)和三种抗药性克隆(WEAU-E44D、WEAU-L90M和WEAU-M184V)按1:1:1:1进行混合。将这些聚合酶克隆使用E44D(图4A)、M18々V(图4B)和L90M(图4C)引物进行连续性测序。如下延伸突变位点'E4斗D位点使用Cy5_dCTP(突变型)和Cy3-dATP(野生型)来延伸，M1MV位点使用Cy5-dGTP(突变型)和Cy3-dATP(野生型)来延伸，并且L卯M位点使用Cy^dATP(突变型)和Cy^dUTP(野生型)来延伸。为更好观察，显示出每个图像中的小区域。用编号箭头指示每个克隆中的代表性聚合酶克隆。在三个图像中E44D、M184M、L90M和野生型克隆的颜色模式分别为红色-绿色-红色(l)、绿色-红色-红色(2)和绿色-绿色-绿色(3)，以及绿色-绿色-红色(4)。图5A刁C。通过序列PASS分析(sequentialPASSassay)测定相同的病毒基因组中的主要抗药性。在PASS测定中以WEAU-wt克隆为冲莫板并用Cy3或Cy5标记的dNTP对聚合酶克隆进行测序。对于同一种聚合酶克隆，使用对于22个主要抗药性突变位点的不同测序引物进行连续探测。在同一聚合酶克隆中，当一个新的引物退火结合到该模板上之前，于45。C在曱酰胺中变性去除每个测序引物。根据药物种类对结果进行分组。图像上部的数目显示PASS测序的序列。图像的底部显示每个突变位点。图6A-6G。不同HIV-1亚型和重组体中单碱基突变的检测。通过PASS分析27个HIV-1亚型或重组体分子克隆。它们为2个A亚型、8个B亚型、5个亚C型、3个D亚型、1个F亚型、2个G亚型、1个H亚型、2个CRF01—AE、1个CRF04一cpx和2个其他的重组体。将这些聚合酶克隆用Cy3-dCTP的E44D引物进行测序。图7A和7B。通过连续稀释目标分子确定PASS分析的敏感度。将WEAU-wt分子(lOO,OOO、10,000、l，OOO、100和IO)包埋于每片凝胶中(图7A)。PASS检测的实际基因组的数目在括号中显示。PCR扩增后，将这些聚合酶克隆使用Cy5-dATP的E44D引物进行序列测定。当使用的分子数为10,000或更多时，许多点有彼此融合的趋势并难以计数；而当使用的分子数小于10,000时，点易于准确计数。当测试中使用1个拷贝或没有拷贝加入时，未检测出聚合酶克隆(数据未显示)。箭头指示出在IO个分子的图像中检测到的2种聚合酶克隆。本试验重复进行6次。进行线性回归分析并绘图(图7B)。误差吝代表平均值土SD。当分析100,000或更多分子时，难以准确计数点的数量。因此，未将他们包括在对分析法灵敏度的估计中。由于Acrydite修饰的引物固定于丙烯酰胺凝胶中，并且PCR在丙烯酰胺凝胶中于固相状态下进行，因此在PASS分析中未将每个预期的分子检出并不令人惊讶。图8A和8B。患者血浆样本中多重抗药性突变的检测。(图8A)PASS分析的患者血浆样本包括之前从未治疗过的患者(未治疗组(naive))、曾经治疗过但目前未进行任何治疗的患者(治疗经历组)或者目前治疗方案失败的患者(失败组)。从140(il血浆中提取RNA,取等同于14pi血浆的cDNA用于每个PASS测定。用Cy5-dGTP(野生型，红色)和Cy3-dATP(突变型，绿色)测定该M184V突变位点。箭头指示小比率抗药性病毒或者野生型病毒。(图8B)用PASS分析来自治疗失散患者200372的血浆样本的12个抗药性突变位点。同一种聚合酶克隆使用12个不同的测序引物进行连续性检测。当新的引物退火结合到相同的模板上之前，于45。C在曱酰胺中将每个测序引物通过变性去除。在4个PI(蛋白酶抑制剂)突变位点(M461、G48V、D30N和184V)、3个与核苷抗性有关的RT位点(V1181、E44D和K65R)和2个与NNRTI(非核苷类逆转录酶抑制剂)有关的RT位点(V106A和K103N)未检测出抗药性突变。然而，在2个PI抗性突变位点(L90M和V82A)和RT中的M184V位点检测到抗性。所有突变位点中未发现野生型病毒。该患者曾经接受过其它治疗方案，包括蛋白酶抑制剂方案，这有可能解释了PI突变的存在。结果根据药物种类进行分组。每个突变位点在图像底部显示。图9A-9D。通过PASS检测患者血浆样本中抗药性突变。从140血浆中提取RNA,取等同于14pl血浆的cDNA用于每个PASS测定。用PASS分析来自治疗失败患者200369的血浆样本的12个抗药性突变位点。对同一片凝胶使用12个不同的测序引物进行连续性检测。显示的图像包括抗性突变(LIOOI、K103N和M184V)和一个具有代表性的K65R位点野生型图像。图像的上部显示小比率抗性突变群体所占的百分比。每个突变位点在图像底部显示。图10。突变的分布。发明详述本发明涉及用于检测个体基因组(如，病毒或癌细胞基因组)中的突变(如，'MDR突变或癌相关突变)的平行等位基因特异性测序方法(PASS)。该方法包4舌聚合酶克隆牙支术的应用(Mitraetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:5926-5931(2003);Zhuetal，Science301:836-838(2003))。该方法的灵敏度适于在突变基因组数很低(如仅存在像6个这么少的突变基因组拷贝时)或者在样本中突变基因组仅占全部基因组拷贝总数的极少比例(例如，像大约0.01%这么低)时检测突变。例如，依据本发明可以同时分析几十万的病毒基因组并可通过相同分子的多个突变位点的连续探询(sequentialinterrogation)而确定个体分子中的主要突变位点。在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种在大量核酸模板中(如，单链或双链DNA)(如，来自抗药性病原体或者突变的癌基因组)检测出突变或者核苦酸修饰的方法，该方法包括i)在使修饰的扩增引物固定于(例如，共价附着于)半固体支持物中的条件下，将多个核酸模板和修饰的3'扩增引物或修饰的5'扩增引物包埋于(如，灌制(casting)于)该半固体支持物中；ii)将由步骤(i)得到的半固体支持物与PCR成份(如，聚合酶、dNTPs、未修饰的5'或者3'扩增引物和缓沖液)接触(如，用其覆盖)；iii)在使修饰和/或未修饰的扩增引物杂交至核酸模板以形成与引物结合的模板(primedtemplate)的条件下，处理来自步骤(ii)的组合物并在半固体支持物里进行预处理模板的PCR扩增，其中该扩增的双链扩产物集聚于模板周围；iv)将双链扩增产物变性并去除(如，洗脱)未固定到半固体支持物中的单链；.v)将测序引物杂交到步骤(iv)所得的己固定的单链上，并在至少2种带有不同可探测标记物的核苷酸存在下，进行杂交测序引物的延伸，其中之一的核苷酸在固定化单链含有突变或核苷酸修饰时结合到延伸产物中，且其它核苷酸在固定化单链不含突变或修饰核苷酸时结合到延伸产物中(如，其中之一的标记核苷酸与突变或修饰的核苦酸互补，而其它标记核苷酸与存在于野生型中的核苷酸互补)；以及vi)检测步骤(v)所得的测序引物的延伸产物，从而能够确定包含突变或者修饰核苷酸的测序引物的延伸产物的百分比(和模板的百分比)。根据本方法，可以使用例如标准操作程序从取自患者的含病毒生物样本(组织或者体液(如血浆、唾液或者血细胞样本))来提取病毒RNA或DNA。可将提取的RNA反转录并分离所得的cDNA，例如，使用标准操作程序。然后可将该cDNA或者直接提取的DNA按以下描述进行PASS测定。将未修饰的5'引物、修饰的3'引物、DNA模板和扩增试剂(如PCR试剂)包埋于半固体支持物中(如，丙烯酰胺凝胶)-(或者，可以使用修饰的5'引物和未修饰的3'引物)。由于在聚合反应过程中，修饰的引物(如Acrydite化的引物)能够结合到支持物中而固定，该扩增产物(如PCR产物)会积聚在cDNA模板的周围，并在该扩增的位点形成单独的点(聚合酶克隆)。扩增后，将双链DNA变性(例如，按照标准的流程，如70%的曱酰胺)并且将游离的DNA链去除(如洗脱)。仅锚定的DNA链保持仍与支持物相连接。随后可将测序引物退火结合到单链模板上，并使用标记的(如荧光标记的)野生型或抗性碱基进行延伸。然后可扫描支持物而获得图像。例如，当使用荧光标记的核苷酸延伸引物时，突变位点碱基的鉴别可以通过嵌入的核苷酸和最终形成的荧光团(或其他标记)来测定。尽管在以下实施例中由于所使用的仪器，仅使用了两种焚光染料测定野生型和突变型碱基，但是蓝色激光的添加允许检测出用不同的荧光染料标记全部四种可能的碱基(Shendureetal,Science309:1728-1732(2005))。如以下实施例中所描述，在变性之后可以去除前一个测序引物，然后可连续使用不同的测序引物直到测定出所有的预期突变。本发明的测序方法比常规的基因型和表型分析的敏感度可以高例如200-2,000倍(根据对小比率抗性病毒群体的检测)(如，0.1%0.01%比20%)。因此，它能更准确的预测治疗效果。由于使用PASS测定法确定病毒基因组的实际数量，在每次测定中的聚合酶克隆总数也可以用于评估病毒的载量，因此使得医生能够评估药物治疗的效力和预后。在该方法中，可将病毒cDNA或病毒DNA分子直接导入支持物中(如，半固体如丙烯酰胺凝胶)，并在单链分子水平上进行扩增。因此可以完全消除PCR反应过程中通过重组或重复取样而产生的人为序列(artifactsequence)。在测定了每个单独的病毒基因组上所有的抗药性突变之后，可知每个病毒基因组中存在的抗性突变、每个病毒基因组包含的突变的数量和含抗性突变的病毒基因组(在每次测序中的数以十万的病毒基因组中)所占的百分比。由于在单链分子上获得了所有的抗性突变，可使用获得的数据进行连锁分析(图4和IO)来确定MDR机制，并通过分析患者的连续性样本而确定在抗药性中'单一或简单MDR病毒间重组的作用。HIV感染的患者体内的平均病毒载量大约为每毫升1()S个RNA拷贝。例如，如果使用140pl当量的血浆(280iil血浆用于RNA提取，其中一半用于PASS测定)，在每次测定中存在大约14,000个RNA拷贝。由于PASS测定的检测率为16%(图5)，每次分析可以;险测到2，520个聚合酶克隆。因此，PASS测定方法良好地适合于大多数患者的血浆样本的分析。甚至当病毒载量高达每毫升106个RNA拷贝时，一次分析可以进行25，200个病毒拷贝中的抗药性突变的检测，因为该分析可以在50,000个分子中检出l-10个分子(图7)。当病毒载量太低时，可对病毒样品进行浓缩，如从用于PASS测定的大量血浆来浓缩(如，通过超速离心)。测定法也可用于检测生物样本中传染剂的存在(如，病毒或细菌传染剂)和/或牙企测HBV、HCV或其他的传染剂(如结核分枝4干菌0^cok"en'Mmft^e/rw/ow;)(TB))中的抗药性突变。而且，PASS测定法可以用于检测CTL(细胞毒性T淋巴纟田胞)和中和抗体逃逸突变(neutralizingantibodyescapemutation)。除以上所述，本发明也可应用于检测来自癌症患者的样本中的突变或曱基化的核苷。基因表达序型分析(gene-expressionprofiling)可用于肿瘤分级和测定癌症患者的预后(Hoheisel，Nat.Rev.Genet.7:200-210(2006);Schenaetal,Science270:467-470(1995);Endohetal,J.Clin.Oncol.22:811-819(2004);Lossosetal,N.Engl,J.Med.350:1828-1837(2004);Chenetal,N.Engl.J.MeA356:11-20(2007))。宿主基因中某些突变可以导致癌症的产生。迄今为止，已经将许多突变与能够导致肿瘤形成的不受控细胞生长相关联(如己报道了与乳腺癌相关联的突变)。也已经报道了对某些基因或启动子的曱基化能显著的影响癌症的发展。携带癌症相关的突变或曱基化的核苷的肿瘤细胞仅占活检组织中总细胞数的一部分；癌细胞的高百分比说明了更高的侵袭性或不良的预后。因此，关键是能够检测异源癌样本中低百分比的突变或曱基化的核苷。'最近，使用大规模的并行皮升反应器序列测定技术，在非小细胞肺癌里的表皮生长因子受体基因(EGFR)中检出了0.2。/。的突变(Thomasetal,Nat.Med.12:852-855(2006))。该方法有利于为复发患者选^^首期的治疗方法和靶向性抑制剂。此处所述PASS测定法，对稀少突变抹的检测敏感度为0.01%，它能更有效地检测异源癌样本中较低频率的突变或甲基化核苷。来自个体的活检组织、血液或排出物(如尿液、粪便或粘液或浆液分泌物(唾液)等)可用于基因组DNA的提取。然后可将这些DNA消化成较小片段用于检测癌症相关的突变或通过亚硫酸氢钠处理来修饰用于检测曱基化核苷(Fisheretal，LungCancerEpubaheadofprintDecember28，2006;Tomiietal,Int.J.Cancer120:566-573(2007))。如本文所述，对于标准PASS测定，可将处理过的DNA包埋于聚丙烯酰胺凝胶中，并进行PASS分析来检测稀少的癌症相关性突^或曱基化核苷。该方法可用于癌症的诊断和预后，以及为更好的看护患者而选择首期治疗方法。可参见USPs6,432,360、6,485,944和6,511,803，和美国专利申请Nos.20030207265、20030124594、20020127552、20060014167、20020120127、20030215856和20020120126中对聚合酶克隆扩增的详细描述)。(也可参见Butzetal，BMCBiotechnology3:11(2003);MitraandChurch,NucleicAcidsResearch27(24):e34(1999);USP5,958,698、USP5,616,478;Samatovetal，NucleicAcidsResearch33(17):el45(2005);Samatovetal，AnalyticalBiochemistry356:300-302(2006);Chetverinaetal,BioTechniques33:150-156(2002);Chetverinaetal,AnalyticalBiochemistry334:376-381(2004)。)实施例实-险细节我秀担^f^/^的賴务。将包含最多抗药性突变位点的部分戶/基因从几乎全长HIV-1克隆WEAU.A1扩增。通过重叠PCR方法，将E44D、M90L和M184V突变引入。然后将该野生型(WEAU.wt)和突变型PCR产物(WEAU.E44D、WEAU.M90L和WEAU.M184M)直接克隆入pSTBBlue载体(Novagen，Madison,WI)中。通过序列测定确iUl些抗药性突变。对于示踪实验，突变型和野生型克隆以不同的比例(高于104)进行混合。通过NanoDrop分光光度计测定质粒DNA的浓度，基于DNA浓度和质粒长度(bp)计算每个DNA样本中分子的数目。戎,处理。将聚四氟乙烯涂覆的玻璃载片(Eriescientific,Portsmouth,NH)暴露于PCR通风橱(PCRhood)中的紫外光15分钟，接着使用结合溶液(0.02%冰醋酸和0.40/o结合盐水(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ))处理1小时。然后将载片用水冲洗3次，乙醇冲洗2次，并在PCR通风橱里干燥40分钟。将处理过的载片储存于真空干燥器中。'凝魔渗斜。将载片和盖片暴露于PCR通风橱中的紫外光15分钟。在载片上的椭圆形空间里填充20!il凝胶混合物，该混合物于6%聚丙烯酰胺凝胶中含有1fiM的Acrydite修饰的反向引物、模板(1-18)i1)、0.3%二烯丙基酒石酰胺、5%Rhinohide、0.1%APS、0.1%TEMED、0.2%BSA(牛血清白蛋白))。使该凝胶混合物聚合30分钟。其后用刀片去除盖片。使用0.05。/。的吐温-2d溶液沖洗载片15分钟，然后完全干燥。凝屋力PC7{增。PCR试剂的扩散混合物中含有1正向引物、0.1%吐温20、0.2%牛血清白蛋白、lxPCR緩沖液、250)LiMdNTP混合物、3.3个单位的JumpstartTaqDNA聚合酶(Sigma,St.Louis,MO)和水(补足20pl)。一旦将混合物加到凝胶的中央，立即用盖片覆盖凝胶，并在室温放置10分钟。将凝胶与盖片用SecurSeal槽(GraceBio-Labs，Bend,OR)密封。每个槽用640^的矿物油填充。将含有蛋白酶和部分RT基因的大约1.1kb的po/基因片段用引物PAF15'-CTTTGGCAACGACCCCTCGTCACA-3'(2265-2288，HXB2)和PAR25'-CCTGCATAAATCTGACTTGCCCAATTCAA-3'(3367陽3339)来扩增。该PCR产物包含对于核香类逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)和蛋白酶抑制剂(PI)的所有主要抗性突变。用PTC-200热循环仪(PTC-200ThermalCycler;MJResearch,Hercules,CA)，按照下列反应条件进行聚合酶克隆PCR:94。C反应3分钟；94。C反应30秒、56。C反应45秒和72°C反应3分钟的循环共65个；72。C反应6分钟。卓^M差延/^^巧。PCR扩增以后，将载片于科普林缸(Coplinjar)中用。烷浸泡15分钟，并用洗液IE(10mMTris-HCIpH7.5、50mMKCl、2mMEDTApH8.0和0.01%TritonX-100)冲洗4次。接着将载片在曱酰胺变性溶液中(70%的曱酰胺和lxSSC)变性15分钟。用水冲洗1次，洗液1E沖洗2次后，向每张载片施用FrameSeal槽(Bio-Rad，Hercules,CA),并且向每张载片添加125pi的退火混合物(6xSSPE,0.01%TritonX-100和75pi的100|iM的测序引物)。-在PTC-200热循环仪里，按照下列反应条件进行测序引物的杂交94。C反应6分钟和53。C反应20分钟。当引物退火结合到模板上后，将载片用洗液1E冲洗2次，再用Klenow緩沖液(50mMTris-HCIpH7.4,5mMMgCl2和0.01%TritonX-100)于室温平衡3分钟。将45微升延伸混合物(在Klenow缓沖液中的0.5|iMCy5标记的脱氧核苷酸{野生型或突变型}、0.5|iMCy3标记的不同的脱氧核苷酸{突变型或野生型}、1%单链DNA结合蛋白(USBcorporation,Cleveland,OH)和10个单位的Klenow酶)力口到每片凝胶上。将载片在室温醉育3分钟，用洗液IE洗涤2次，并用ScanArrayExpress(PerkinElmer,Wellesley;MA)进行扫描。^/淨jf^的戎i^^ir。为测定各个蛋白酶/RT扩增子中的主要抗药性突变，将聚合酶克隆载片用曱酰胺变性溶液于45。C处理15分钟，接着用水冲'洗，用洗液1E冲洗2次。扫描载片以确保完全去除来自先前SBE(单碱基的延伸)的测序引物，然后将它们用不同的测序引物进行退火。重复SBE步骤直至测定出所有期望的突变(参见表1和图5)。表1:PASS测序中使用的引物引物_引物序列_PCR扩增引物_PAF1CTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAPAF2CCAAAAATTGCAGGGCCCCTAGGAAPAR1-AcrCCCACTAACTTCTGTATGTCATTGACAGTCCAPAR2陽AcrCCTGCATAAATCTGACTTGCCCAATTCAA蛋白酶基因中的测序引物D30NgaGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATM46IgaAATTTGCCAGGAAGATGGAAACCAAAAATG48VgtCCAGGAAGATGGAAACCAAAAATGATAG150VagTGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAV82AtcGGTACAGTATTAGTAGGACCTACACCTG184VagCAGTATTAGTAGGACCTACACCTGTCAACL90MtaACCTGTCAACATAATTGGAAGAAATCTG逆转录酶基因中的测序引物M41La-t/cAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAE44DacGTAGAAATTTGTACAGAAATGGAAAAGGAK65RagCAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAD67NgaACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAT69Dac.gaGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTK70RagTTGCCATAAAGTAAAAAGACAGTACTAL74VtgAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAAL100ItaGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGGK103NacACATCCCGCAGGGTTAAAAAAGAAV106AtcGCAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGV108IgaAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGTAACAV118IgaGGATGTGGGTGATGCATATTTTTCAQ151Mca.atATTAGATATCAGTACAATGTGCTTCCAY181CagAGAAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTM184VagCAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACY188CLHta.t/c.g/aATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGG190AgcTCTATCAATACATGGATGATTTGTATGTAGL210WtgAAAAATAGAGGAGCTGAGACAACCATCTGTT215Y/Fac.tt/aCAACATCTGTTGAGGTGGGGATTTK219EagTTGAGGTGGGGACTTACCACACCAGACP225HcaCCAGACAAAAAACATCAGAAAGAAC4毒iM4提承和逆挣z秀。使用QIAamp病毒RNA小量提取试剂盒(QIAampViralRNAMiniKit,QiagenInc.,Valencia,CA)从来自HIV-l感染个体的280^1血浆样本中提取病毒RNA(vRNA)。将vRNA洗提入60plAVE緩沖液中，并且将17pi的vRNA用于cDNA合成，所述合成在40(il的反应体积中使用SuperscriptIII(InvitrogenCorp,Carlsbad,CA)和引物RTunil5'-CCAATCCCCCCTTTTCTTTTAAAATTGTG-3'。将约一半cDNA(18pl)用于一次PASS测定。结果卓个戎秀担^f的乎/f^h^。近来，己经开发了聚合酶克隆(polymerasecolony;polony)技术以在固相中检测单分子水平的单碱基突变(Mitraetal,ProcNatlAcadSciUSA100:5926-31(2003),Mitraetal,AnalBiochem320:55-65(2003))。该方法己用于描述组合选4奪性前体-mRNA的剪接(combinatorialalternativepre-mRNAsplicing)和平4亍序歹'J观'J定(Shendureetal,Science309:1728-32(2005)，Zhuetal,Science301:836-8(2003》。为检测小比率抗性病毒群体，通过应用聚合酶克隆技术在一次测定中同时分析数十万种病毒基因组，已经开发出了平行等位基因特异性序列测定(PASS)方法。扩增了含有蛋白酶和部分逆转录酶(RT)基因的1.1kb的po/基因片段。该扩增子包含针对逆转录酶和蛋白酶的所有主要的抗性突变。在丙烯酰胺凝胶中进行聚合酶克隆的扩增反应。由于在聚合反应过程中，Acrydite修饰的引物通过共价结合进聚丙烯酰胺凝胶里而固定，PCR产物积聚在DNA模板的周围并在扩增的部位形成各自的点(聚合酶克隆)(图1A)。扩增之后，负性的DNA链和互补的测序引物杂交，引物3'端与抗性突变并置。当引物通过单碱基延伸(SBE)进行延伸后，突变位点碱基的身份通过嵌入的用不同荧光团标记的核苷酸^！测定(图1B)。通过微阵列扫描仪获得图像，该图像用于野生型和突变型群体的分析。为了测定PASS分析的灵敏度，将野生型分子(WEAU-wt)和突变型分子(WEAU-E44D)依据不同的比例进行混合(l:1、1:10、1:100和1:1,000)。然后用E44D引物检测该混合物。以0.1%或更高值存在的突变易于检测(图3A)。在以相同的1:1,000的突变型和野生型比率下，将病毒基因组的输入量增至10,000时，尽管部分野生型分子彼此融合在一起而不能准确地进行计数，仍可以很容易的检测出抗性突变(图3B)。因此，用于检测小比率的抗性突变的方法的灵敏度可以高达大约0.01%。线性回归分析揭示了在检测出的和预期的突变型/野生型比例之间存在很好的线性关系(R^0.9945)(图3C)。通过多重单碱基延伸(SBE),在单独的分子上检测出了22个主要突变，这说明当进行更多的测序循环时，PASS测定法可用于检测对于连锁式分析的大多数主要突变和潜在的其它次要突变(图5)。还测定了来自许多亚型和重组体形式(2个A亚型、8个B亚型、5个C亚型、3个D亚型、1个F亚型、2个G亚型、1个H亚型、2个CRF01—AE重组型、1个CRF04一cpx重组型和2个其他的重组体)的27个病毒基因组。所有己测试的亚型和重组体都得到了同等扩增，这说明PASS测定法能够用于大多数的遗传亚型和重组体(图6)。该测定法对于野生型和突变型群体检测的灵敏度约为6个病毒基因组拷贝。线性回归分析显示在10到10,000个病毒基因组拷贝之间存在很好的线性检测相关性(112=0.9958)(图7)。当分析大于200,000的野生型分子时，未检测出i突变的碱基，这表明在目前的实验条件下，通过Taq聚合酶引入的突变率低于5xl06。因此，通过PASS检测出的低频率突变将不太可能是PCR错误。为检测存在于病毒种群中的每个分子内的不同抗性突变，制备了3个单独的抗药性克隆(WEAU-E44D、WEAU-L90M和WEAU-M184V)，并将它们与野生型克隆(WEAU-wt)按1:1:1:1的比例混合。然后将这些聚合酶克隆用E44D、M184V和L90M引物进行顺序性测序。正如预期，在每个反应中，大约25%的聚合酶克隆含有抗性突变，并且其它75%的聚合物克隆为野生型(图4A-4C)。当从所有3个图像分析聚合酶克隆时，野生型克隆显示为绿色-绿色-红色的模式，而E44D克隆显示为红色-绿色-红色的模式，M184V克隆显示为绿色-红色-红色的模式，而L90M显示为绿色-绿色-绿色的模式。这些结果证明了当大量的病毒基因组进行平行分析时，PASS测定法可以准确地测定用于连锁分析的每种病毒基因组中不同的抗性突变的存在。为了利用PASS测定法测定来自HIV感染患者的样本中的抗性群体，分析了来自3个不同患者组的13个血浆样本未治疗过的患者(未治疗组)、曾经治疗过但目前未进行抗逆转录病毒治疗的患者(治疗经历组)以及目前治疗方案失败的患者(失败组)。首先测定M184V突变，并且在未治疗过的患者中未测到该突变；在6个先前治疗过的患者中，2个患者体内^^测到小比率抗性群体(<2%);而在治疗失败的患者中，检测到高比率(major)抗性群体(36%-100%)(图8和表2)。表2.M184V密码子中A^G的抗药性突变的4企测<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>为检测所研究的病毒种群中是否存在其它的抗性突变，对来自三个组的7个患者样本进行了12个可能的抗性突变位点分析(表3)。在l个治疗经历组患者和所有3个治疗失败组的患者中^r测出其它的抗性突变。在200372号患者中检测出L90M和V82A突变，200371号患者中检测出K70R和T215Y突变(表3和图7)。在这两个患者中均没有检测到野生型病毒。在其他的两个患者中，在多个抗性突变位点均检测到抗性和野生型病毒(图9)。这使进行详细的连锁分析成为可能。在治疗失败组中的200369号患者体内，90.32%的病毒中存在L100I突变，并且89.64%的病毒中存在K103N突变。利用标准的基因型测定法未能一企测出的36.26%的M184V突变病毒可以很容易地用PASS测定法检测出来(图9)。连锁分析显示多于一半的病毒(52.14%)同时携带L100I和K103N突变，并且35.10%的病毒含有3种抗性突变(LIOOI、K103M和M184V)。其它的含有单个或两个抗性突变的病毒作为小比率群体存在(LIOOI0.66%、K103N0.07%、M184V0.07%、M層I/M1184V0.07%)(表3)。以前进行过治疗的200362号患者也显示出相似的抗性突变连锁序型(profile)。尽管大多数病毒含有一种或更多抗性突变，但是两个患者仍带有少量的野生型病毒种群(1.67%和9.22%)。表3.个体病毒基因组中抗药性突变的连锁分析<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>尚未确认在逆转录病毒治疗失败的患者中作为基因型或表型测试结果的HIV治疗结果上的连续改进(Johnsonetal,Top.HIVMed.13:125-131(2005))。这种结果的部分原因可能由于在这些患者中用于检测小比率抗性群体的测定法灵敏度太低(存在〉20。/。突变病毒)(Petropoulosetal,Antimicrob.AgentsChemother.44:920-928(2000),VanLaethemetal，J.Acquir.ImmuneDefic.Syndr.22:107-118(1999))。与基因型或表型测定法相比，点突变测定法均具有显著较高的灵敏度(VanLaethemetal,Acquir.ImmuneDefic.Syndr.22:107-118(1999))。由于通过这些方法检测的抗药性突变是基于群体的，它们都不能进行连锁分析。然而，克隆序列测定法己用于研究每种病毒基因组中的小比率抗性群体和抗性突变的连锁分析(Condraetal,Nature374:569-571(1995))。虽然PASS测定法需要花费数天来分析所有主要的突变，但是与克隆序列测定法相比，它能在本质上更有效、更快速、更灵敏的检测小比率抗性群体。尽管与标准的基因型测定法相比PASS测定法需要花费较长的时间去完成，但是对于检测小比率抗性突变和对于连锁分析他都提供了优秀得多的灵敏度。虽然小比率抗性病毒种群的临床意义还没有完全确定，但是这些群体很可能会显著影响之后的治疗效果(Charpentieretal，J.Virol.78:4234-4247(2004)，'Metzneretal,J.Infect.Dis.188:1433-1443(2003),Wintersetal,J.Virol.72:5303-5306(1998))。因为对于检测小比率抗性病毒群体，PASS测定法比基因型或表型测定法(0.01%对20%)的灵敏度要高约1,000倍，它可以更准确的预测治疗效果。PASS测定法允许对多个突变的详细连锁分析，使得研究不同突变组合对于小比率和大比率病毒群体的影响成为可能(表3)。除了这些临床上的改进，PASS测定法的技术优势值得注意。例如，在PASS操作中将病毒cDNA分子直接包埋至聚丙烯酰胺凝胶中，并在单一分子水平上进行PCR扩增。因此，将常规PCR反应过程中通过重组或重复取样而产生的人为序列消除(Fangetal,J.Virol.Methods76:139-148(1998)，Liuetal,Science273:415-416(1996》。综上，以上描述的是一种具有高灵敏度、高特异性和高通量的能够在感染HIV的个体中检测小比率抗性种群的PASS测定法。该方法应用了聚合酶克隆技术，该技术己用于检测组合选择性前体mRNA的剪接，平行检测单磁<基突变和平行序列测定(Zhuetal，Science301:836-838(2003)，Merritetal,Biotechnol.Bioeng.92:519-531(2005)，Butzetal,BMCGenet.5:3(2004)，Shendureetal,Science309:1728-1732(2005))。该新技术也可以充满潜力地用于^r测在T和B细胞靶向的抗原决定簇中的HIV逃逸突变，其它的人病原体(如乙型和丙型肝炎病毒、TB等)以及与癌相关的突变或核苷修饰。以上引用的所有文件和其他信息资源于此全部并入参考。权利要求1.一种在大量的核酸模板中检测或测定突变或核苷酸修饰的频率的方法，该方法包括i)将大量核酸模板和修饰的3′扩增引物或者修饰的5′扩增引物在使所述修饰的扩增引物固定于半固体支持物中的条件下包埋于所述半固体支持物中；ii)将步骤(i)获得的所述半固体支持物与聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和未修饰的5′或者3′扩增引物接触；iii)在使所述修饰和/或未修饰的扩增引物杂交至所述核酸模板以形成与引物结合的模板的条件下处理从步骤(ii)获得的组合物；iv)在所述半固体支持物内进行所述与引物结合的模板的扩增，其中所述扩增的双链产物集中在所述与引物结合的模板的周围；v)将所述双链扩增产物变性并去除获得的未固定到所述半固体支持物中的单链；vi)将测序引物与所述步骤(v)获得的固定化的单链杂交，并在带有不同可检测标记的至少2种核苷酸存在下，对所述杂交的测序引物进行延伸以形成延伸产物，其中所述核苷酸中的一种在所述固定化单链含有所述突变或核苷酸修饰时结合到所述延伸产物中；另外的所述核苷酸在所述固定化单链不含所述突变或修饰核苷酸时结合到所述延伸产物中；以及vii)检测从步骤(vi)获得的测序引物的延伸产物，并确定包含所述突变核苷酸或修饰核苷酸的所述核酸模板的存在或频率。2.根据权利要求1的方法，其中所述方法是一种测定突变频率的方法。3.根据权利要求1的方法，其中所述大量的核酸模板包含双链DNA。4.根据权利要求1的方法，其中所述大量的核酸模板来源于病原体。5.根据权利要求4的方法，其中所述病原体为病毒病原体或细菌病原体。6.根据权利要求5的方法，其中所述病原体是人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)或结核分枝杆菌(TB)。7.根据权利要求5的方法，其中所述抗原为抗药性病原体。8.根据权利要求1的方法，其中所述大量的核酸模板来源于癌细胞的基因组。9.根据权利要求8的方法，其中所述癌细胞为人类癌细胞。10.根据权利要求1的方法，其中所述癌细胞来源于活检组织、血液或排出物。11.根据权利要求10的方法，其中所述排出物包括尿液、粪便、粘液或浆液分泌物。12.根据权利要求1的方法，其中所述修饰的扩增引物共价附接于所述半固体支持物。13.根据权利要求12的方法，其中所述半固体支持物为丙烯酰胺凝胶。14.根据权利要求1的方法，其中未修饰的5'引物和修饰的3'引物包埋于所述半固体支持物中。15.根据权利要求1的方法，其中未修饰的3'引物和修饰的5'引物包埋于所述半固体支持物中。16.根据权利要求1的方法，其中所述修饰引物为Acrydite标记的引物。17.根据权利要求1的方法，其中所述可^f企测标记为荧光标记。18.—种测定患者体内病毒载量的方法，该方法包括i)从来自所述患者的生物样本中提取病毒DNA;'扩增引物固定于半固体支持物中的条件^包埋于所述半固体支持物中；'iii)将步骤(i)获得的所述半固体支持物与聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和未修饰的5'或者3'扩增引物接触；iv)在使所述修饰和/或未修饰的扩增引物与所述DNA杂交以形成与引物结合的模板的条件下，处理从步骤(iii)获得的组合物；v)在所述半固体支持物中进行所述与引物结合的模板的扩增，其中所述扩增的双链产物集中在所述与引物结合的模板的周围；vi)将所述双链扩增产物变性并去除所得的未固定到所述半固体支持物中的单链；vii)将测序引物与所述从步骤(vi)获得的固定化的单链杂交，并在带有可伸产物；以及viii)检测从步骤(vii)获得的标记的延伸产物，并由此确定所述病毒载量。19.根据权利要求18的方法，其中在步骤(ii)之前，剪切所述DNA。20.根据权利要求19的方法，其中所述剪切后的DNA的长度为大约100个碱基至大约1000kb。21.根据权利要求20的方法，其中所述剪切后的DNA的长度为大约lkb至大约100kb。22.—种测定患者体内病毒载量的方法，该方法包括i)从来自所述患者的生物样本中提取病毒RNA;ii)反转录所述RNA以生成cDNA，并将所述cDNA和修饰的3'扩增引物或修饰的5'扩增引物在使所述修饰的扩增引物固定于半固体支持物中的条件下包埋于所述半固体支持物中；iii)将步骤(i)得到的所述半固体支持物与聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和未修饰的5'或者3'扩增引物接触；iv)在使所述修饰和/或未修饰的扩增引物与所述cDNA杂交以形成与引物结合的模板的条件下处理从步骤(iii)获得的组合物；v)在所述半固体支持物中进行所述与引物结合的模板的扩增，其中所述扩增的双链产物集中在所述与引物结合的模板的周围；vi)将所述双链扩增产物变性并去除所得的未固定到所述半固体支持物中的单链；vii)将测序引物与所述步骤(vi)获得的固定化的单链杂交，并在带有可斗全的延伸产物；以及viii)检测从步骤(vii)获得的标记的延伸产物，并由此确定所述病毒载量。23.—种测定患者体内病毒载量的方法，该方法包括i)从来自所述患者的生物样本中提取病毒DNA;的扩增引物固定于半固体支持物中的条件下包埋于所述半固体支持物中；iii)将步骤(i)得到的半固体支持物与聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和未修饰的5'或者3'扩增引物接触；iv)在使所述修饰和/或未修饰的扩增引物与所述DNA杂交以形成与引物结合的模板的条件下处理从步骤(iii)获得的组合物；v)在所述半固体支持物中进行所述与引物结合的模板的扩增，其中所述扩增的双链产物集中在所述与引物结合的模板的周围；Vi)将所述双链扩增产物变性并去除所得的未固定到所述半固体支持物中的单链；vii)将对于所述病毒具有特异性的标记的探针与所述步骤(vi)得到的固定化的单链杂交以形成标记的双链体；以及viii)检测所述标记的双链体的存在，并由此确定所述病毒载量。24.根据权利要求23的方法，其中在步骤(ii)之前，剪切所述DNA。25.—种测定患者体内病毒载量的方法，该方法包括i)从来自所述患者的生物样本中提取病毒RNA;ii)反转录所述RNA以生成cDNA,并将所述cDNA和修饰的3'扩增引物或者修饰的5'扩增引物在使所述修饰的扩增引物固定于半固体支持物中的条件下包埋于所述半固体支持物中；iii)将步骤(i)得到的所述半固体支持物与聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和未修饰的5'或者3'扩增引物接触；iv)在使所述修饰和/或未修饰的扩增引物与所述cDNA杂交以形成与引物结合的模板的条件下处理从步骤(iii)获得的组合物；v)在所述半固体支持物中进行所述与引物结合的模板的扩增，其中所述扩增的双链产物集中在所述与引物结合的模板的周围；vi)将所述双链扩增产物变性并去除所得的未固定到所述半固体支持物中的单链；vii)将对于所述病毒具有特异性的标记的探针与所述步骤(vi)得到的固定化的单链杂交以形成标记的双链体；以及viii)检测所述标记的双链体的存在，并由此确定所述病毒载量。26.—种在源自从生物样本中分离的DNA的大量核酸模板中检测突变或核苷酸修饰的方法，该方法包括i)将所述大量核酸模板和修饰的3'扩增引物或者修饰的5'扩增引物在使所述修饰的扩增引物固定于半固体支持物中的条件下包埋于所述半固体支持物中；ii)将步骤(i)获得的所述半固体支持物与聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和未修饰的5'或者3'扩增引物接触；iii)在使所述修饰和/或未修饰的扩增引物杂交至所述核酸模板以形成与引物结合的模板的条件下处理从步骤(ii)获得的组合物；iv)在所述半固体支持物内进行所述与引物结合的模板的扩增，其中所述扩增的双链产物集中在所述与引物结合的模板的周围；v)将所述双链扩增产物变性并去除获得的未固定到所述半固体支持物中的单链；vi)将测序引物与所述从步骤(v)获得的固定化的单链杂交，并在带有可检测标记的核芬酸存在下，对所述杂交的测序引物进行延伸，其中带有所述可检测标记的所述核香酸在所述固定化单链含有所述突变或核苦酸修饰时结合到所述延伸产物中，从而形成标记的延伸产物；以及viii)检测从步骤(vii)获得的标记的延伸产物，并由此确定所述突变或核苷酸修饰的存在。27.根据权利要求26的方法，其中所述生物样本包含来自癌细胞的DNA。全文摘要本发明涉及到一种检测遗传变体的方法，所述遗传变体包括与抗药性、癌症和遗传功能障碍性疾病相关的遗传变体。文档编号C12Q1/68GK101421418SQ200780013086公开日2009年4月29日申请日期2007年4月10日优先权日2006年4月10日发明者军朱,峰高申请人:杜克大学