作为制备抗癌药物的反义miRNA-210的用途的制作方法

专利名称：作为制备抗癌药物的反义miRNA-210的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种RNA小分子的用途，尤其是涉及作为制备抗癌药物的反义 miRNA-210的用途，属于生物医学材料技术领域。
背景技术：
近几年来，从植物、线虫到人的细胞中广泛存在一种非编码的单链RNA小分子 (microRNA, miRNA)，它们能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3’非翻译端特定区域相互作用，抑制蛋白质的合成。1993年Lee等采用经典克隆方法在线虫中首次克隆了 lin_4基因，通过点突变的方法证实小分子RNA的存在。2000年Reinhart等在人和果蝇中发现了 let-7基因的存在，于是推测这类小分子可能是 类进化上保守，在生命过程中起重要作用的调节分子。随后人们在植物、线虫、果蝇和哺乳动物中已发现了一千多个miRNA基因。小 RNA的研究给我们带来重要的启迪是基因组非组蛋白编码区蕴含着重要的生命功能活动信息。现有研究表明生命的一些重要活动如幼虫的生长发育、细胞的发生和分化、神经系统的分化等都被一些非蛋白编码小RNA的调控；而除miRNA、siRNA以外的小RNA我们更是知之甚少。长期以来，有关基因的研究重点都在蛋白编码基因上，而小RNA的发现和研究对揭示基因的表达调控机制，让我们更为深入的了解生命之奥秘无疑具有重大的科学价值。
据统计，miRNA在人类基因组中约占1%的数量，在不同的时空发育阶段表达量存在显著差异。Bartel 等(Ambros V, Bartel B, Bartel DP，Burge CB, Carrington JC，Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall Μ, Matzke Μ, Ruvkun G, Tuschl Τ.)提出，由于miRNA与靶mRNA互补程度不同，起着切割或微弱抑制作用。由于其作用靶点的多寡，miRNA表达量亦不同，通过基因芯片技术，可以同时检测所有miRNA时空表达的状况。在此基础上，寻找miRNA靶基因，揭示其作用机制是目前研究的重点，也是后基因组时代需要解决的问题之一。全部miRNA基因功能的揭示可能会给人们对生命现象的理解带来一场深刻的革命。
近几年有关miRNA在机体生长发育和肿瘤发生发展过程中的作用研究已积累了大量的资料。研究表明，miRNA在细胞生长和调亡，血细胞分化，神经元的极性，胰岛素分泌， 大脑形态形成，心脏发生，胚胎后期发育等过程中发挥重大作用，而miRNA突变或者异位表达又与多种人类癌症相关，具有肿瘤抑制基因或者癌基因的作用。一个起肿瘤抑制基因作用的miRNA表达下降或者缺失会导致肿瘤形成。成熟miRNA水平下降导致不适当的靶蛋白的表达可能导致细胞过度增殖、侵入、凋亡的减少、不能正常分化或去分化，引起肿瘤的形成。具有癌基因功能的miRNA的过表达也将导致肿瘤的形成，如miRNA-21在胶质母细胞瘤中表达增加表达量比正常组织高5-100倍，miRNA-155前体，miRNA_15，miRNA-16在恶性淋巴瘤中亦异常表达。
脑胶质瘤源自神经上皮，也称胶质细胞瘤，占颅脑肿瘤的40-50%，是最常见的颅内恶性肿瘤。胶质瘤最主要的生物学特性是脑组织的终位性增殖和不断增殖，根据病理又可分为星形细胞瘤、髓母细胞瘤、多形胶母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶母细胞瘤等。目前，脑肿瘤的流行病学和病因学尚不完全清楚，但有证据表明胶质瘤的形成可能与一定的内环境改变和基因变异有关，是一个多因素、多步骤的多种癌基因和/或抑癌基因参与的协同积累过程。发病男性多于女性，大多在20-50岁发病，以30-40岁多见，10岁左右儿童为另一高发期。胶质细胞癌的生长特点为浸润性生长，与正常脑组织无明显界限，多数不限于一个脑叶，向脑组织外呈指状深入破坏脑组织，偏良性者生长缓慢，病程较长，自出现症状至就诊时间平均两年，恶性者瘤体生长快，病程短，自出现症状到就诊时多数在3个月之内， 70-80% 多在半年之内。Chan 等(Chan JA, Krichevsky AM and Kosik KS. MicroRNA-21 Is an Antiapoptotic Factor in Human Glioblastoma Cells. Cancer Res 2005； 65: 6029-6033)的研究显示，胶质母细胞瘤强烈表达miRNA_21。与非肿瘤胚胎、成人脑组织以及培养的非肿瘤细胞相比，miRNA-21在人类胶质母细胞瘤组织以及六个胶质细胞瘤细胞系(A172, U87, U373, LN229, LN428以及LN308)的表达显著升高。研究表明miRNA-21在培养的胶质母细胞瘤细胞系的抑制性表达导致了 caspases的激活，进而凋亡性细胞死亡增加。这些结果显示，通过抑制关键的与凋亡相关的基因表达，异常表达的miRNA-21可能与导致恶性月中瘤表型有关。Ciafre (Ciafre SA, Galardi etal, Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma, BBRC, 2005，1351—1358)等采用miRNA芯片(含245个人和鼠miRNA探针)对9例胶质母细胞瘤和10种胶质母细胞瘤细胞株进行分析表明miRNA-221在胶质母细胞瘤中显著上调，而一组脑中富有的miRNAs，如miRNA_128， miRNA-181a, miRNA-181b, miRNA-181c则在胶质母细胞瘤中表达量显著下调。
由于miRNA序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程，如发育过程中的细胞增殖、细胞死亡、应激反应和脂肪代谢等。肿瘤是一种遗传物质改变导致的恶性疾病，它严重地威胁人类的健康。为了研究参与肿瘤的miRNA分子，首先就要确定miRNA究竟在那些肿瘤细胞或组织中表达及其表达水平。 在此基础上进一步揭示异常表达的miRNA在肿瘤细胞中所起的生物学功能。但是到目前为止还没有文献报导关于反义miRNA-210作为制备治疗人脑胶质瘤细胞株侵袭的药物的用途。发明内容
本发明的目的在于通过miRNA芯片技术提供反义miRNA-210的新用途。
本发明提供反义miRNA-210作为制备治疗人脑胶质瘤细胞株侵袭的药物的用途。
虽然miRNA在胶质母细胞瘤中的表达研究已有报道，但本发明所采用的miRNA芯片整合了 476个人和鼠的miRNA探针，远比2005年Ciafre等采用的2M个miRNA芯片数量多。本发明采用同样的方法对大量恒河猴脑组织及人神经干细胞进行对照研究，有助于探寻年龄相关表达miRNA基因在脑肿瘤发生发展过程中的特点与规律，为蛋白组学研究提供更为深层次的研究资料。本发明采用miRNA芯片研究了三例脑胶质瘤miRNA表达情况， 并用Northern和q-PCR等方法对芯片结果对9例脑胶质瘤样品和四株脑胶质瘤细胞进行验证。本发明还从Ambion公司购买有人正常脑RNA (成人脑总RNA混合样品)作为对照。本发明研究结果表明，miRNA-210不仅在脑胶质瘤中高表达，也在人神经干细胞中高表达。为了验证芯片检测结果，本发明采用Northern和q_PCR方法对上述结果进行了验证。本发明在Northern分析的基础上，采用q_PCR方法进一步确证miRNA-210在人脑胶质瘤组织细胞中呈高表达。其次探讨了是否miRNA-210像miRNA-21 -样具有促进人脑胶质瘤细胞凋亡的作用，遗憾的是该项研究结果显示，反义miRNA-210在这方面的作用不显著。再次，本发明采用Evasion Assay kit (细胞侵袭检测试剂盒)对U251和TJ905两种细胞系进行试验，结果发现反义miRNA-210能显著降低人脑胶质瘤细胞株的侵袭能力。转染后各组细胞的miRNA定量PCR和Northern验证。在此基础上，本发明采用传统的wound assay，进一步验证了反义miRNA-210具有显著降低人脑胶质瘤细胞侵袭的作用。


图1. miRNA芯片杂交2. miRNA芯片分析聚类结果。A显示miRNA聚类总体情况。B显示在脑胶质瘤中显著高表达的miRNA。C显示在脑胶质瘤中显著下调的miRNA。
图3.采用Northern和miRNA定量PCR方法检测miR-210在脑胶质瘤中的表达情况。定量PCR发现miR-210的拷贝数在脑胶质瘤中(glioma样品1_3)较正常对照组(NHBH)显著增高(A)。与癌旁组织的平均值比较，miR-210在脑胶质瘤中的拷贝数增高2. 00士0. 10倍，表达显著上调(B)。对更多的glioma样品及癌旁组织进行Northern 分析结果进一步确认芯片结果的可靠性(C)。
图4.细胞侵袭实验表明反义nuRNA-210能显著降低人脑胶质瘤细胞株的侵袭能力。与正常对照组(U251NC和TJ905NC)及碱基错配序列组(U251SC和TJ905SC)比较， 反义miRNA-210能显著抑制脑胶质瘤细胞的侵袭作用(A)。定量PCR和Northern检定细胞转染合成的miRNA核苷酸结果。
具体实施方式
1. RNA抽提每WOmg组织加入1 ml Trizol，用液氮研磨充分研碎组织块。加入约 1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混勻1分钟左右，室温下静置5分钟。4°C，12, OOOrpm离心 15分钟后小心转移上清液入新的1. 5 ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混勻，室温静置10分钟。4°C，12000 rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70%乙醇，4°C，12000 rpm离心洗涤沉淀5分钟。
去上清，将沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解，测定0D260和0拟80 值。采用无RNA酶的DNA酶I处理，QIAGEN RNeasyi试剂盒纯化总RNA，详细操作原理和方法见试剂盒说明书。琼脂糖胶电泳评价总RNA质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S: 18S>2可以初步判定总RNA质量较好。
2. MicroRNA 芯片的制备首先从 miRNA 信息登录网站 http //microrna. sanger. ac. uk ( 2005. 09)上获取制备miRNA探针的序列，其中包括313条人的及34条小鼠的miRNA 序列对应的探针序列。同时，我们也将XIE发表在2005年Nature上的文章(Xie X，Lu J, Kulbokas EJ, et al. Systematic discovery of regulatory motifs in humanpromoters and 3 UTRs by comparison of several mammals[J]. Nature, 2005, 434(7031):338)中所提及的122条预测中的miRNA对应的探针也整合到其中，最终在我们的miRNA芯片上集中了 469种不同的miRNA对应的探针。为了实现对芯片实验过程的质量控制，本发明在芯片上设置了阴性及阳性对照。阴性对照我们设计了两种，一种是空白点样液体；另外一种就是没有掺入Y2对应的RNA，因此Y2就是 个最合适的阴性对照。阴性对照预期的杂交信号是很弱的，它们的信号值不足以进入到后续的数据分析当中。阳性对照分为三种(1)固定化阳性对照5，-GTCACATGCGATGGATCGAGCTCCTTTATCATC-3，。
在芯片实验最后检测杂交结果时，此序列应该在cy3的激发波长下有较强的荧光信号，扫描信号值在8000以上，表明芯片上的核酸固定是没有问题的。
(2)杂交的阳性对照我们选择了组织内源的，RNA碱基长度在WOnt 左右的U6和tRNA作为miRNA芯片的内源阳性对照；U6对应的探针序列是 5，-ATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3， ； tRNA 对应的探针序列是 5，-GGGTTA TGGGCCCAGCACGCTTCCGCTGCGCCACTCTGCT-3 ’ ；它们的杂交信号也应该是比较高的，一般都超过5000信号值。
(3)芯片系统的阳性对照为了避免受到实验RNA样品的干扰，在芯片上还点有与实验样品没有关系的核酸序列，以检查芯片系统的有效性。本发明把这种对照称为外标(exogenous controls)。在miRNA芯片上，本发明设计了 8条与所有的RNA序列不具同源性的寡核苷酸序列作为外标，名字和序列见下表。经过blast比较，这8个核酸序列和人的全部基因序列没有同源性。本发明用Ambion公司的miRNA Probe Construction kit (Cat#. 1550)合成了此8条探针对应的长度类似miRNA的RNA序列Q0-30nt)，然后在反应的时候掺入到实际检测的RNA样品中去，一同进行芯片反应实验。根据掺入RNA量的不同，这些外标点可以呈现不同的杂交信号；除了 Y2以外，一般信号值都在5000以上。芯片系统的阳性对照见表1。
3. miRNA芯片检测用于miRNA芯片检测的RNA样品制备先使用Trizol抽提方法得到总 RNA，再使用 Ambion 公司的 mirVana miRNA isolation kit (catalog#1560)试剂盒对样品进行纯化，去除占总RNA主要成分的较大片段，留下包括miRNA在内的小片段部分。 具体纯化步骤详见试剂盒使用手册。miRNA芯片检测按常规方法进行。
4.生物信息学分析由于microRNA也是通过基因芯片的手段进行研究，所以将两者并列说明。首先，采用的芯片是Affymetrix U133 Plus 2. Oarray，这种芯片是目前同类产品中覆盖基因数目最多的一种在一张芯片上，覆盖了 47，000个转录本，代表38，500 个明晰的人类基因，来自下列公共数据库GenBank，dbEST，and RefSeq.其中的6，500个更新的基因来自最新的数据库Build 159 Of the UniGene database (2003年1月25日)。 U133主要适用于研究基因的表达情况并了解基因发挥功能的网络。包括1)基因表达的组织特异性和细胞特异性；2)诱导基因表达谱研究；3)基因表达分化和4)肿瘤表达谱研究。 在基因芯片的结果中，采用T-Test的方法来检验数据间的显著性差异以求得其可信度，而用不同年龄阶段的数据两两相比的方法来求得某些蛋白质的表达是否具有年龄特异性，使用clusterf. 0程序来进行聚类分析。
5. Northern blotting分析使用Trizol抽提培养细胞或组织的总RNA，定量并质检。取30-50ug总RNA进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为15%。电泳结束后进行电转膜，将样品转至带正电荷的尼龙膜上。将所要检测的miRNA对应的探针用同位素进行末端标记，并在适宜条件下与膜进行杂交。杂交完成后进行压片扫描。再以TO基因的探针与膜进行杂交，得到U6的杂交信号，并以此作为上样量的衡量标准。最后使用成像系统读出杂交信号的强度，比较各组不同的样品间的差异。
6. qPCR检测方法miRNA的qPCR检测使用invitrogen的Trizol抽提总RNA，定量并质检。取50-100ng总RNA为模板，使用针对特定miRNA的逆转录引物及invitrogen的SuperScript ⑩ ni First-Strand Synthesis System 试剂盒合成 cDNA ο 以 cDNA 为模板，使用针对目标miRNA的PCR引物及Takara的SYBR(R) Premix Ex TaqTM荧光定量PCR体系， 在stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩增，并测得样品的Ct值。将所得Ct值通过代入测定标准曲线得出的公式，采用绝对定量的计算方法得出样品中的目标miRNA的含量。U6 基因作为内照对miRNA qPCR检测结果进行标准化校正。对于预测中的目标基因的qPCR检测使用invitrogen的Trizol抽提总RNA，定量并质检。取3ug总RNA为模板，以随机寡核苷酸为弓I物，使用 invitrogen 的 SuperScript ⑩ III First-Strand Synthesis System试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，使用针对目标基因的特异引物及Takara的STOR(R) Premix Ex TaqTM荧光定量PCR体系，在stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩增，并测得样品的 Ct值。同时测定待测样品中的看家基因(如:B-actin, GAPDH)的Ct值，以此来校正各组样品之间上样量差别，将所得数据标准化后进行比较各组之间目的基因的变化(即相对定量法)。
7.细胞培养恶性胶质瘤细胞TJ905 (由天津医科大学总医院神经外科馈赠)培养在含10%FBS (兰州民海)的高糖DMEM培养基中，人胶质母细胞瘤U251MG (购自上海中科院细胞库)培养在含10%FBS (兰州民海)的RPMI1640培养基中，置37°C培养箱、5%C02，2 天传代一次。人胶质母细胞瘤SHG-44 (购自上海中科院细胞库)培养在含10%FBS (兰州民海)的RPMI1640培养基中，置37°C培养箱、5%C02，2天传代一次。人神经母细胞瘤SH-SY5Y (ATCC号购自上海中科院细胞库)培养在含15%FBS (兰州民海)的MEM-F12培养基中，置 37°C培养箱、5%C02，3-4天传代一次。
8.细胞转染甲氧基寡核苷酸由上海吉玛公司化学合成，microRNA前体购自美国 Ambion 公司(Ambion Pre_mir. rM miRNA precursor CaU No. 17100)，转染共设正常对照组，miRNA前体组，miRNA反义链组(anti sense), nuRNA碱基错配序列组(scramble)和 miRNA通用阴性对照组(EGFP)。细胞于铺板18_24h后至70%_80%融合开始转染，所用试剂为Lipofectamine 2000 Gnvitrogen)。转染按本室常规方法并参照说明书进行。寡核苷酸的工作浓度均为50nmol/L。DDRl siRNA组和siRNA通用阴性对照组(Negative)。细胞于铺板18-24h后至70%-80%融合开始转染，所用试剂为Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 具体转染方法参照说明书进行，寡核苷酸及siRNA的工作浓度均为50nmol/L。细胞转染所用的核苷酸序列见表2。
表2.细胞转染所用核苷酸序列表mi RXAS* ti sxlg s oi 3Antisense hss-mir210iCAGCCGCITtlCACACGCACAGScrambled hsa~mir2i0A GAA C GC GCL Al C t CG CACGCCtbrr antisenseACGGMGClGACCClGMGI79.细胞迁移实验取无菌12孔板，恶性胶质瘤细胞TJ905培养在含10%FBS的高糖DMEM 培养基中，人胶质母细胞瘤U251MG培养在含10%FBS的RPMI1640培养基中，置37°C培养箱、 5%C02，2天传代一次。转染miRNA 24h后，用200ul吸头划出两条十字交叉细胞刮除带。转染miRNA 48h后开始观察记录实验结果。
10.细胞侵袭实验实验所用试剂盒为QCMTM Collagen Cell Invasion Assay kit (Chemicon Cat. #ECM551 )。转染前一天接种细胞于6孔板培养至80%汇合，转染后将细胞在无血清培养基中饥饿18- 小时。用0. 25%胰酶消化细胞并用含5% BSA的DMEM终止反应。细胞离心后重悬于含5%BSA的DMEM中(0.5 χ 106 cells/mL)。将250ul细胞悬液加入Boyden小室的上室中，下室加入500ul含10%FBS的DMEM，37°C培养箱5%C02培养。 48h后将小室浸入400ul细胞染液中染色20min并漂洗，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，之后将膜剪下于200倍显微镜下成像。将聚碳酸酯微孔滤膜浸入染料提取液中反应lOmin， IOOul细胞染液转入酶标板在560nm处读取吸光值。
11. Caspase-3/7酶活性检测将细胞接种于96孔板中.培养，进行转染实验，培养 48 小时。采用 Apo-ONETM Homogeneous Caspase-3/7 kit (Promega Cat No. G7790) 试剂盒，按说明书操作。将caspase底物和Apo-ONETM caspase3/7 buffer混合，配成 Apo-ONETM试剂。按Apo-ONETM试剂和培养基体积比为1 1的比例加入Apo-ONETM试剂， 300rpm-500rpm摇至少30秒，使Ap0-ONETM试剂和培养基充分混勻。使用荧光分光光度计在激发波长485 士 20nm和发射波长530 士 25nm条件下读取OD值。CaSpaSe3酶活性检测也可利用化学发光法(CalbiochenuCat No. 235400)的活性。细胞计数，收集培养细胞，PBS 洗两遍。加适量裂解缓冲液，液氮/37°C反复冻融三次，每次5分钟。10，000xg，4°C离心 10分钟。吸取上清备用。准备caspase3底物溶液QmM，Calbiochem, Cat No. 235400)), caspase3抑制剂溶液(500nM)，按照如下表格的量向96孔板中加入样品，按说明书操作。、 37°C预热酶标板，加入细胞裂解液和caSpaSe3抑制剂，置于37°C孵育10分钟。加入IOul caspase3底物开始反应，0. 5-2小时后在405nm下测OD值。
12.蛋白质印迹分析在样品中加入裂解液，置于液氮中反复冻融数次后，再超声彻底破碎样品，离心分离出蛋白质，对取得的蛋白样品进行定量。在蛋白样品中加入上样缓冲液，煮沸3-5分钟后，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒流20mA。待前沿指示剂恰好跑出凝胶后，停止电泳，进行转膜。将样品转至膜上后，再与所要研究的蛋白的单抗共同孵育，最终进行显色，得到印迹信号。同时以beta-actin为参照，对信号进行标准化校正，之后在成像系统中读出信号密度，进行进一步的分析。
本发明发现miRNA-210的过度表达显著。在芯片分析的基础上，采用Northern， q-PCR方法进一步确证miRNA-210在人脑胶质瘤组织细胞中呈高表达。本发明采用 Invasion Assay kit (细胞侵袭检测试剂盒)对U251和TJ905两种细胞系进行试验，结果发现反义miRNA-210能显著降低人脑胶质瘤细胞株的侵袭能力。采用woimdassay，进一步验证了反义miRNA-210具有显著降低人脑胶质瘤细胞侵袭的作用。侵袭性和转移性是癌细胞最主要的生物学特性，也是恶性肿瘤的重要标志。上述实验结果证明miRNA-210可作为一种癌基因促进人脑胶质瘤细胞的侵袭作用。
权利要求
1.作为制备抗癌药物的反义miRNA-210的用途，其特征在于作为制备治疗人脑胶质瘤细胞株侵袭的药物的用途。
2.根据权利要求1说述的作为制备抗癌药物的反义miRNA-210的用途，其特征在于 本发明所采用的miRNA芯片整合了 476个人和鼠的miRNA探针。
全文摘要
发明涉及作为制备抗癌药物的反义miRNA-210的用途，尤其是涉及反义miRNA-210的应用，属于生物医学材料技术领域。 本发明采用miRNA芯片研究了三例脑胶质瘤miRNA表达情况，并用Northern和q-PCR等方法对芯片结果对9例脑胶质瘤样品和四株脑胶质瘤细胞进行验证，结果发现反义miRNA-210能显著降低人脑胶质瘤细胞株的侵袭能力。
文档编号A61P25/00GK102475892SQ20101055343
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者王爽 申请人:大连创达技术交易市场有限公司