专利名称：脂质体包裹重组人睫状神经营养因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)脂质体的制备方法，脂质体配方和用途。
背景技术：
睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic Factor, CNTF)最初从鸡胚的眼组织睫状节中提取出来，因对睫状神经元有营养作用并可维持鸡副交感神经节的存活而得名。 经研究发现，CNTF具有多种功能，在神经系统，肌肉系统，肥胖症及其相关疾病的治疗中具有重要意义，有广阔的临床开发前景。但由于血脑屏障的阻隔，CNTF到达中枢神经系统受限，妨碍了 CNTF用于帕金森氏症、老年痴呆症等疾病的治疗，通过脂质体复合制剂可以帮助药物分子穿越血脑屏障，为CNTF在中枢神经系统中用药提供了可行的途径。因天然序列的CNTF蛋白毒副作用较大，其临床应用受到影响。为寻找安全有效的CNTF，人们已研究出多种CNTF的突变体。Regeneron制药公司发表了用于治疗肥胖症的CNTF的人工合成类似物Axokine(AXM)。AX15是人CNTF的一个三重突变体17位的Cys被Ala替换，63位的 Gln被Arg替换，并缺失了 C末端的15个氨基酸。与天然人CNTF相比，AX15具有更高的生物学活性，更好的稳定性和可溶性。中国药品生物制品检定所发明了一种重组睫状神经营养因子突变体(中国专利，200510097985. 5，
公开日2006年4月19日)，突变体的第17位 Cys突变为Ser,并去掉C端的16个氨基酸，该突变体在治疗肥胖症或与肥胖症相关的疾病及神经损伤相关疾病方面有较好效果。兰州生物制品研究所发明了一种重组睫状神经营养因子突变体(中国专利，200710112387. X，
公开日2008年3月19日)，将天然人CNTF基因的17位Cys突变为Ala，63位Gln突变为Arg，在治疗普通肥胖症或糖尿病型肥胖症方面有较好效果。已知CNTF能微量进入血脑屏障，作用于下丘脑食欲调节中枢，激活度素样通路， 起到降低体重的作用。另外，有研究表明，玻璃体腔内直接注射CNTF能促进损伤的视网膜神经节细胞(retinal ganglinecells，RGC) RGC存活和视神经再生。Weise (Neurobiol Dis, 2000，7 =212-223)等利用基因治疗的手段，用腺病毒(adenoviral vector, Ad)作为CNTF 基因载体注入鼠玻璃体内，可使CNTF mRNA和蛋白稳定表达，至少持续18天，起到有效治疗神经萎缩等病变的作用。然而天然或重组的人CNTF经皮下或静脉给药后不能由血液循环有效穿越血脑屏障，实现治疗中枢神经相关病变的功效。本发明提供了 rhCNTF(A17R6315) 脂质体的制备工艺及其进入脑组织中的情况，可实现人CNTF有效穿越血脑屏障。本发明以Axokine (AX15)的cDNA为基础，在基因序列上设计了带有Nde I酶切位点和ATG翻译起始密码子，下游引物则带有BamHI酶切位点和TAA终止密码子，全部使用大肠杆菌偏爱密码子,命名为 rhCNTF (A17R6315) (Recombinant Human CNTF, rhCNTF)。采用表达载体质粒 pET-3c，重组表达并经高效纯化工艺获得具有生物活性的rhCNTF，将其成功地用于含CNTF 的脂质体制备研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能穿越血脑屏障的含rhCNTF的脂质体，从而改善神经元损伤和退行性病变相关的疾病，如帕金森氏症、老年痴呆症、脊髓侧索硬化症(ALS)等的治疗效果。为实现上述目的，本发明以Axokine (AX15)的cDNA为基础(将野生型人CNTF的 cDNA C端去掉15个氨基酸，增加其生物活性，同时将17位Cys突变为Ala，63位Gln突变为Arg)，在基因序列上设计了带有酶切位点和ATG翻译起始密码子，下游引物则带有酶切位点和TAA终止密码子，全部使用大肠杆菌偏爱密码子，命名为rhCNTF (A17R6315)。经人工全基因合成后用Nde I和BamHI双酶切后，与Nde I和BamHI双酶切的pET_3c大片段在 T4连接酶作用下连接，转化大肠杆菌DH5ci。将鉴定后含AX15的外源基因的重组质粒转化 BL21 (DE3)PlysS,诱导筛选高效表达的工程菌。rhCNTF (A17R6315)的纯化工艺包括包涵体处理、复性及重组蛋白纯化过程。本发明提供了一种含rhCNTF脂质体的制备方法。本发明制备的脂质体的粒径为20-200nm，rhCNTF的包封率不低于70%。脂质体是由磷脂分散在水中形成的多层微囊。微囊每层均为脂质双分子层，各层之间被水相隔开。脂质体首先于1971年由英国莱门 (Rymen)等人用作药物载体。脂质体作为药物或其它物质的载体，具有生物降解性和生物相容性，通过延缓药物代谢和清除、降低药物分布体积，有利于药物向病变组织分布，提供可持续的药物释放。一个IOOnm的脂质体分子可以包裹上万个药物分子，脂质体可以显著地增加药物在脑部的转运量。脂质体技术作为一种药物的新型制剂，已广泛应用于小分子药物和生物大分子药物的载药中。脂质体包裹可改善药物分子在血液中的代谢和组织分布行为，达到缓释和靶向性的目的。脂质体的配方和制备方法已具有一定的成熟度，常规的配方主要含不同比例的磷脂和胆固醇，制备方法包括薄膜超声法、反相蒸发法、旋涡分散法等。本专利为实现含CNTF 脂质体的脑靶向给药，以单唾液酸四己糖神经节苷脂(GMl)做为脂质体的配方中的主要成分，再与一定的磷脂和胆固醇组合，经薄膜超声法和挤压法制备含CNTF的独特脂质体。已知磷脂有多种形式，如天然磷脂和合成磷脂。天然磷脂具有组分不均一性，而合成磷脂以单一成分为主。本专利采用的磷脂主要指合成磷脂，包括DSPE、DSPC、DPPC、DMPG、DSPA、DPPG寸。
图1 :rhCNTF(A17R6315)的碱基和氨基酸序列对比示意2 :pET-rhCNTF工程菌测序结果。其中rhCNTF的cDNA为50-617位正向序列， 与设计序列测定结果完全吻合。图3 :rhCNTF表达和纯化的SDS-PAGE分析图谱。㈧1 表达对照；2 诱导表达的目的蛋白rhCNTF。(B) 1 =Q柱纯化后rhCNTF ；2 复性后rhCNTF ；3 蛋白质分子量标准。
图4rhCNTF脂质体的粒径测定分析图。
具体实施例方式
下文通过具体实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明的保护范围不受实施例的限制。实施例IrhCNTF (A17R6315)基因的获得根据Gene Bank获得CNTF cDNA序列，将野生型人CNTF的cDNA C端去掉15个氨基酸，增加其生物活性，同时将17位Cys突变为Ala，63位Gln突变为Arg，在基因序列上设计了带有NdeI酶切位点和ATG翻译起始密码子，下游引物则带有BamHI酶切位点和TAA 终止密码子，全部使用大肠杆菌偏爱密码子，全基因人工合成，并嵌入PUC18载体且命名为 PUC-CNTF0相应的碱基及氨基酸序列分析如图1实施例2质粒PET-CNTF的构建和表达用Nde I和BamHI双酶切后，与Nde I和BamHI双酶切的pET_3c大片段在！"4连接酶作用下连接，转化大肠杆菌DH5 α涂布LB-Ampicillin平板，提取阳性克隆质粒，用Nde I和BamHI双酶切鉴定正确后，命名为pET_CNTF。该重组表达质粒转化BL21 (DE3) plyss，获得重组表达CNTF的工程菌。IPTG诱导表达筛选高表达菌株并保存。工程菌测序结果如图 2。工程菌诱导表达如图3A。实施例3rhCNTF的分离纯化经实验证明rhCNTF重组蛋白为包涵体表达。1.将冰箱保存的菌体以1 10放入细菌裂解液中，37°C下搅拌4h后超声，4°C冷却后，按功率P < 400W工作时间5秒，间歇5秒超声40次，12000r/min离心lOmin，取上清电泳，包涵体进一步处理。2.将包涵体放入洗涤液 M20mmol/L Tris-HCl pH 8. 0,5mmol/L EDTA，2mol/L Urea, 1% TritonX-100)中，超声功率P < !MOW工作时间5秒，间歇5秒超声40次。搅拌 30min 后，12000r/min 离心 15min，取上清 A 60 μ L 进行 SDS-PAGE。3.将包涵体放入洗涤液 BQOmmol/L Tris-HCl pH 8. 0,4mol/L Urea, 1. Omo 1/L NaCl)中，超声功率P < 340W工作时间5秒，间歇5秒超声40次(使尿素与菌液充分作用)，搅拌 30min 后，12000r/min 离心 15min，取上清 B 60 进行 SDS-PAGE。4.溶解包涵体以原菌液体积的10%加包涵体溶解液05mmol/L Tris-HCl pH 8. 0，8mol/L Urea, 2mmo 1/L EDTA, 1/2000B-ME)，37°C温育 3h，4°C 8 IOh 使包涵体充分溶解，离心12000r/min 15min，弃不溶物。5.稀释复性包涵体溶解液中逐步加入10倍体积的复性液05mmol/L Tris-HCl pH 8. 0)，置于4°C、100r/min搅拌，进行稀释复性。6. Q-Sepharose 柱层析纯化:25mmol/L Tris-HCl pH 8. O 的缓冲液平衡，含 0. 5mol/L NaCl的缓冲液梯度洗脱，收集rhCNTF洗脱液。7.纯化后rhCNTF经SDS-PAGE和HPLC分析纯度达到98. O % (图3B)。经TF-I体外细胞生物测活ED50为1. 2ng/mL。实施例4rhCNTF脂质体的制备取GM1250mg、磷脂酰乙醇胺(DSPE) 500mg和胆固醇lOOOmg，溶解于50mL有机溶剂中。充分溶解后旋转蒸发，待残留的有机溶剂完全挥发后，用2. 5mg/mL的rhCNTF(lOmmol/ LpH 7. 4磷酸盐溶液)100mL溶解脂质体膜，制得水性混悬液。探头超声(功率20-50W，超声时间5s，间隔时间4s，超声次数10-40次)、高压均质机均质后过0. 22 μ m滤膜，即得rhCNTF 脂质体。采用激光粒子测定仪测定rhCNTF脂质体粒径。粒径分布范围为20-200nm，平均粒径为 85. Onm (图 4)。实施例5包封率的测定取ImL rhCNTF 脂质体，加入 1 10DDW 后，100000r/min 离心 2h (日立 CP100MX 超速冷冻离心机)。取上清和脂质体沉淀，脂质体沉淀用IOmL破乳液(1% SDS，10% TritonX-100)彻底破乳。根据rhCNTF的HPLC标准峰面积，计算沉淀和上清中rhCNTF的总含量，以脂质体包封率公式计算包封率(包封率％ = 1_上￡二直量Χ·%)。制备的rhCNTF 脂质体包封率为82.5%。实施例6rhCNTF标准曲线取 rhCNTF 原液 10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、 750ng/mL、1000ng/mL加入酶标板进行测定，同时取Human CNTF ELISA(R&D公司)试剂盒样品稀释液作为空白对照。450nm测定OD值后，根据OD值和样品浓度得出公式Y = 66. 011Χ-1. 6658 (Y 为浓度，X 为 OD 值)，R = 0. 999，线性范围为 lO-lOOOng/mL。实施例7精密度实验HPLC测定rhCNTF浓度精密度实验精密量取rhCNTF储备液适量，用流动相A稀释成质量浓度为100，250，500 μ g/mL溶液。于Id和1周内重复进样5次，进样量20 μ L， 计算日内和日间精密度见表1。ELISA测定rhCNTF含量精密度实验精密量取rhCNTF储备液适量，用Human CNTF ELISA试剂盒样品稀释液稀释成100，250，500ng/mL溶液。于Id和1周内重复测定5次，计算日内和日间精密度见表2。表IHPLC测定rhCNTF浓度的日内和日间精密度
权利要求
1.一种将重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)进行脂质体包裹的制备方法及配方和用途。其特征在于，脂质体形式的rhCNTF，能更有效地穿越血脑屏障。
2.权利要求1中的脂质体配方特征在于含有单唾液酸四己糖神经节苷脂(GMl)、磷脂和胆固醇，其比例为1 4 8至1 2 4。
3.权利要求2中单唾液酸四己糖神经节苷脂在脂质体中的含量为0.25% 1. 0%。
4.权利要求2中磷脂为合成磷脂DSPE、DSPC、DPPC,DMPG, DSPA, DPPG中的任何一种。
5.权利要求1中的rhCNTF指具有天然CNTF生物活性70%以上的CNTF类似物或突变体的重组蛋白。
6.权利要求3中rhCNTF优选CNTF的17位Cys突变为Ala，63位Gln突变为Arg，并缺失了 C末端的15个氨基酸的rh-CNTF (A17R6315)。
7.权利要求1中脂质体包裹CNTF的制备方法包括以下步骤a)取一定量单唾液酸四己糖神经节苷脂(GMl)、合成磷脂和胆固醇按相应比例溶解于甲醇氯仿(70 30, V/V)的溶剂中，旋转蒸发制成单层或多层脂质膜。b)含0.02-1.0% rhCNTF磷酸盐溶液(pH5. 5-8. 0)加入脂质膜中，超声处理制备包裹 rhCNTF的脂质体。c)rhCNTF脂质体经高压挤出器，制备20-200nm粒径的脂质体悬液。d)经0.22 μ m滤膜过滤，制成无菌脂质体溶液。e)加入相应辅料制成注射液、冻干粉、微球、微囊等制剂。
8.权利要求1和7所述的含rhCNTF脂质体，可用于制备成神经元损伤或神经退行性病变相关的疾病等方面的药物。
全文摘要
本发明提供了一种含单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的脂质体包裹重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)及其制备方法。本发明制备的rhCNTF脂质体粒径在20-200nm范围内分布均匀，药物包封率不低于70％。经动物实验证明该rhCNTF脂质体能实现rhCNTF通过血脑屏障，具有治疗神经元损伤和退行性病变相关的疾病的应用价值。
文档编号A61K38/18GK102462662SQ20101055286
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月15日 优先权日2010年8月16日
发明者张继兰, 杨黎, 胡春兰, 范开, 陈海容, 高剑坤 申请人:重庆富进生物医药有限公司