专利名称：纯化vwf以增加非-脂质包封的病毒的去除的制作方法
技术领域：
通常，本发明涉及纯化VWF以增加非-脂质包封的病毒的去除的方法。
背景技术：
Von Willebrand因子(VWF)以大小为约500至20，OOOkD的范围的一系列多聚体在血浆中循环的糖蛋白。VWF的多聚体形式由通过二硫键连接在一起的250kD的多肽子单元构成。VWF介导初始血小板粘附损坏的血管壁的内皮下。只有较大的多聚体表现出止血活性。假设内皮细胞分泌加大的聚合物形式的VWF，并且具有低分子量的那些形式(低分子量VWF)源自蛋白水解分裂。具有较大分子量的多聚体储存在内皮细胞的Weibel-Pallade 体中，并且在刺激时释放。VffF由作为前原-VWF的内皮细胞和巨核细胞合成，所述前原-VWF由较高程度的重复结构域构成。在信号肽分裂时，原-VWF通过其C-末端区域的二硫键连接而形成二聚体。 所述二聚体起到多聚化的原体的作用，其由游离末端之间的二硫键连接控制。装配成多聚体后进行蛋白水解以除去前肽序列(Leyte et al.，Biochem. J. 274 (1991)，257-261)。从VWF的克隆cDNA预测的初级翻译产物是2813-残基前体多肽(前原-VWF)。前原-VWF由22个氨基酸信号肽和741个氨基酸前肽构成，其中成熟VWF包含2050个氨基酸 (Ruggeri Ζ. A.，and Ware, J.，FASEB J.，308—316 (1993))。VWF中的缺陷引起Von Willebrand病(VWD)，其特征在于或多或少显著的出血显型。3型VWD是最严重的形式，其中VWF完全缺失，并且1型VWD涉及VWF的定量损失，其显型可以是非常温和的。2型VWD涉及VWF的定性缺陷并且可以和3型VWD—样严重。2型 VWD具有多种亚型形式，一些相关于高分子量多聚体的损失或减少。2a型Von Willebrand 综合征(VWS-2A)的特征在于中间体和较大多聚体的损失。VWS-2B的特征在于最高分子量多聚体的损失。涉及VWF的其他疾病和病患是本领域已知的。来自治疗蛋白溶液的非-脂质包封的病毒的去除或失活传统上通过使用物理方法处理来完成，例如高温(例如，干燥加热、蒸汽加热、巴氏消毒法)、高能量射线的辐射(例如，紫外线(UV)射线或β辐射)、低ρΗ、纳米过滤、或色谱法特别是亲和色谱法。然而，当纯化高分子量蛋白例如VWF时，这些方法通常是无效的，其不通过纳米过滤器和/或在使用加热或辐射处理时失去其效力或分子完整性。当前管理规范要求生产商提出减少和/或失活脂质包封的和非_脂质包封的病毒以用于重复药物产品的问题。ICH" Guideline on Viral Safety Evaluations of Biotechnology Products" (Federal Register, 1998,63 (185) :51074_51084)提供生产商灵活性如何将病毒问题考虑到产品类型中、生产方法和潜在污染性病毒的风险。这些规范指出病毒污染的风险是源自细胞系的所有生物产品共有的特征。这种污染可具有严重的临床后果，并且可源自源细胞系本身的污染(细胞底物)或源自生产中病毒的偶然引入。而脂质-包封的病毒的失活可以通过溶剂/去污剂(S/D)处理方案非常有效地进行，因为它们较小尺寸和物理稳定性，非-脂质-包封的模型病毒(NLEV’ s)的失活或去除可能是挑战性的。因此，本领域存在需要开发方法以在VWF纯化的过程中有效地失活或去除非_脂质包封的病毒。发明概述本发明提供纯化VWF以增加非-脂质包封的病毒的去除的有效方法。本发明提供通过下列步骤纯化VWF以增加NLEV' s的去除的新型方法进行产物负载步骤；以及在较高pH下纯化方法的洗涤步骤。本领域已知的从NLEV' s纯化多肽的一种方法涉及使用纳米过滤。使用纳米过滤有效地分离蛋白和病毒中的原理利用了多肽和病毒之间的尺寸差异；有效的分离要求多肽的有效尺寸小于病毒，这允许多肽通过纳米过滤器的孔，而病毒得以保留。然而，如果多肽和病毒相对于彼此具有相当的尺寸，因为多肽和病毒都通过纳米过滤器的孔或都通不过， 因此分离是有问题的。本文公开的方法通过下列方式克服了该问题使用阳离子交换树脂而不是纳米过滤，并且在足够高的PH下负载和/或洗涤树脂以从病毒中分离多肽。不受到理论的束缚，本文公开的方法可用于从多肽溶液中改善地去除NLEV，其中多肽具有某种尺寸和/或形态。足够大的多肽在多肽的等电点或更高点处可能具有局部带电特性，即，多肽的区域可以保持局部正电荷或负电荷，从而允许多肽吸附至柱树脂，而病毒则通过树脂。尽管在该PH下进行树脂的负载和/或洗涤，但是在多肽长度上该不均勻的电荷分布允许多肽保持附接至树脂。本发明提供从含蛋白的溶液在去除非-脂质包封的病毒的方法，包括使溶液中的蛋白负载到阳离子交换树脂上；以及在高于蛋白的等电点的PH下使用缓冲液洗涤树脂， 以洗脱病毒。在一个方面中，在高于蛋白的等电点的PH下，缓冲液中的蛋白负载到树脂上以洗脱病毒。在另一方面中，缓冲液(不是洗涤步骤中使用的缓冲液)中的蛋白负载到树脂上，随后在高于蛋白的等电点的PH下使用缓冲液洗涤树脂。在一个实施方案中，提供一种从含蛋白的溶液中去除非_脂质包封的病毒的方法，包括在高于所述蛋白的等电点的PH下将所述溶液施加至阳离子交换树脂；以及使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第一洗涤缓冲液的PH等于或小于施加至所述阳离子交换树脂的溶液的pH。在一个方面中，溶液的PH比蛋白的等电点高约1个PH单位。在其他方面中，溶液的PH比蛋白的等电点高约1. 1，或约1. 2，或约1. 3，或约1. 4，或约1. 5，或约1. 6，或约1. 7， 或约1. 8，或约1. 9，或约2. 0，或约2. 1，或约2. 2，或约2. 3，或约2. 4，或约2. 5，或约2. 6，或约2. 7，或约2. 8，或约2. 9，或约3. 0，或约3. 1，或约3. 2，或约3. 3，或约3. 4，或约3. 5，或约3. 6，或约3. 7，或约3. 8，或约3. 9，或约4. 0，或约4. 1，或约4. 2，或约4. 3，或约4. 4，或约4. 5，或约4. 6，或约4. 7，或约4. 8，或约4. 9，或约5. 0,或约5. 1，或约5. 2，或约5. 3，或约 5. 4，或约5. 5，或约5. 6，或约5. 7，或约5. 8，或约5. 9，或约6. 0或更多个pH单位、或更高。 在这些实施方案中，PH大于约7。在相关的方面中，含蛋白的溶液的pH为约7.0。在其他方面中，含蛋白的溶液的PH为约7. 1，或约7. 2，或约7. 3，或约7. 4，或约7. 5，或约7. 6，或约7. 7，或约7. 8，或约7. 9，或约8. 0，或约8. 1，或约8. 2，或约8. 3，或约8. 4，或约8. 5，或约8. 6，或约8. 7，或约8. 8，或约8. 9，或约9. 0，或约9. 1，或约9. 2，或约9. 3，或约9. 4，或约9. 5，或约9. 6，或约9. 7，或约9. 8，或约9. 9，或约10. 0,或约10. 1，或约10. 2，或约10. 3， 或约10. 4，或约10. 5，或约10. 6，或约10. 7，或约10. 8，或约10. 9，或约11.0，或约11. 1，或约11. 2，或约11. 3，或约11. 4，或约11. 5，或约11. 6，或约11. 7，或约11. 8，或约11. 9，或约12. 0，或约12. 1，或约12. 2，或约12. 3，或约12. 4，或约12. 5，或约12. 6，或约12. 7，或约 12. 8，或约12. 9，或约13. 0或更高。在另一实施方案中，提供一种从含蛋白的溶液中去除非_脂质包封的病毒的方法，包括将所述溶液施加至阳离子交换树脂；在高于施加至所述阳离子交换树脂的溶液的PH的pH下使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂；以及使用第二洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第一洗脱液的PH等于或小于所述第一洗涤缓冲液的PH。在一个方面中，第一洗涤缓冲液的pH比施加至阳离子交换树脂的溶液的pH高约1个pH单位。在其他方面中，第一洗涤缓冲液的pH比蛋白的等电点高约0. 1，或约0. 2， 或约0.3，或约0.4，或约0.5，或约0.6，或约0.7，或约0.8，或约0.9，或约1. 1，或约1.2， 或约1.3，或约1.4，或约1.5，或约1.6，或约1.7，或约1.8，或约1. 9，或约2. 0，或约2. 1， 或约2. 2，或约2. 3，或约2. 4，或约2. 5，或约2. 6，或约2. 7，或约2. 8，或约2. 9，或约3. 0， 或约3. 1，或约3. 2，或约3. 3，或约3. 4，或约3. 5，或约3. 6，或约3. 7，或约3. 8，或约3. 9， 或约4. 0，或约4. 1，或约4. 2，或约4. 3，或约4. 4，或约4. 5，或约4. 6，或约4. 7，或约4. 8， 或约4. 9，或约5. 0，或约5. 1，或约5. 2，或约5. 3，或约5. 4，或约5. 5，或约5. 6，或约5. 7，或约5. 8，或约5. 9，或约6. 0，或约6. 1，或约6. 2，或约6. 3，或约6. 4，或约6. 5，或约6. 6，或约
6.7，或约6. 8.或约6. 9，或约7. 0，或约7. 1，或约7. 2，或约7. 3，或约7. 4，或约7. 5，或约
7.6，或约7. 7，或约7. 8，或约7. 9，或约8或约8. 1，或约8. 2，或约8. 3，或约8. 4，或约8. 5， 或约8. 6，或约8. 7，或约8. 8，或约8. 9，或约9，或约9. 1，或约9. 2，或约9. 3，或约9. 4，或约9. 5，或约9. 6，或约9. 7，或约9. 8，或约9. 9，或约10或更大pH单位、或更高。在这些实施方案中，第一洗涤缓冲液的PH大于约7。在其他方面中，第一洗涤缓冲液的pH为约7. 1， 或约7. 2，或约7. 3，或约7. 4，或约7. 5，或约7. 6，或约7. 7，或约7. 8，或约7. 9，或约8. 0，或约8. 1，或约8. 2，或约8. 3，或约8. 4，或约8. 5，或约8. 6，或约8. 7，或约8. 8，或约8. 9，或约9. 0，或约9. 1，或约9. 2，或约9. 3，或约9. 4，或约9. 5，或约9. 6，或约9. 7，或约9. 8，或约9. 9，或约10.0，或约10. 1，或约10. 2，或约10. 3，或约10. 4，或约10. 5，或约10. 6，或约 10. 7，或约10. 8，或约10. 9，或约11.0或更高.在实施方案中，溶液中的蛋白是分子量为至少约150千道尔顿的多肽。在各种方面中，溶液中的蛋白是下列分子量的多肽至少约175千道尔顿，或约180千道尔顿，或约 190千道尔顿，或约200千道尔顿，或约210千道尔顿，或约220千道尔顿，或约230千道尔顿，或约240千道尔顿，或约250千道尔顿，或约260千道尔顿，或约270千道尔顿，或约280 千道尔顿，或约290千道尔顿，或约300千道尔顿，或约310千道尔顿，或约320千道尔顿， 或约330千道尔顿，或约340千道尔顿，或约350千道尔顿，或约360千道尔顿，或约370千道尔顿，或约380千道尔顿，或约390千道尔顿，或约400千道尔顿，或约410千道尔顿，或约420千道尔顿，或约430千道尔顿，或约440千道尔顿，或约450千道尔顿，或约460千道尔顿，或约470千道尔顿，或约480千道尔顿，或约490千道尔顿，或约500千道尔顿或更高。如本文所述，多肽还包含多聚体结构，在各种方面中，这种多聚体结构的分子量为至少约500千道尔顿。在相关方面中，多聚体结构的分子量为至少约510，或约520，或约530， 或约540，或约550，或约560，或约570，或约580，或约590，或约600，或约610，或约620， 或约630，或约640，或约650，或约660，或约670，或约680，或约690，或约700，或约710， 或约720，或约730，或约740，或约750，或约760，或约770，或约780，或约790，或约800， 或约810，或约820，或约830，或约840，或约850，或约860，或约870，或约880，或约890， 或约900，或约910，或约920，或约930，或约940，或约950，或约960，或约970，或约980， 或约990千道尔顿，或约1兆道尔顿，或约1. 1兆道尔顿，或约1. 2兆道尔顿，或约1. 3兆道尔顿，或约1. 4兆道尔顿，或约1. 5兆道尔顿，或约1. 6兆道尔顿，或约1. 7兆道尔顿，或约 1. 8兆道尔顿，或约1. 9兆道尔顿，或约2. 0兆道尔顿，或约2. 1兆道尔顿，或约2. 2兆道尔顿，或约2. 3兆道尔顿，或约2. 4兆道尔顿，或约2. 5兆道尔顿，或约2. 6兆道尔顿，或约2. 7 兆道尔顿，或约2. 8兆道尔顿，或约2. 9兆道尔顿，或约3. 0兆道尔顿，或约3. 1兆道尔顿， 或约3. 2兆道尔顿，或约3. 3兆道尔顿，或约3. 4兆道尔顿，或约3. 5兆道尔顿，或约3. 6兆道尔顿，或约3. 7兆道尔顿，或约3. 8兆道尔顿，或约3. 9兆道尔顿，或约4. 0兆道尔顿，或约4. 1兆道尔顿，或约4. 2兆道尔顿，或约4. 3兆道尔顿，或约4. 4兆道尔顿，或约4. 5兆道尔顿，或约4. 6兆道尔顿，或约4. 7兆道尔顿，或约4. 8兆道尔顿，或约4. 9兆道尔顿，或约 5.0兆道尔顿或更高。在一些实施方案中，阳离子交换树脂具有选自羧甲基(CM)、磺基烷基(SP，SE)、硫酸酯和甲基磺酸根(S)以及任何其他带负电荷的配体的带负电荷基团。在进一步实施方案中，蛋白是凝血蛋白。在各种方面中，凝血蛋白选自因子 VIII，Vonffillebrand因子，FI (血纤蛋白原)，FV(促凝血球蛋白原)，FXI (血浆-凝血激酶前质)和FXIII (血纤蛋白稳定因子)。在实施方案中，提供一种从含von Willebrand(VWF)的溶液中去除非-脂质包封的病毒的方法，包括在高于所述蛋白的等电点的PH下将所述溶液施加至阳离子交换树脂；以及使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第一洗涤缓冲液的PH等于或小于施加至所述阳离子交换树脂的溶液的pH。在另一实施方案中，提供一种从含VWF的溶液中去除非-脂质包封的病毒的方法， 包括将所述溶液施加至阳离子交换树脂；在高于施加至所述阳离子交换树脂的溶液的PH 的PH下使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂；以及使用第二洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第一洗脱液的PH等于或小于所述第一洗涤缓冲液的pH。在进一步实施方案中，提供一种从含VWF的溶液中去除非-脂质包封的病毒的方法，包括在高于所述蛋白的等电点的PH下将所述溶液施加至阳离子交换树脂；和在高于施加至所述阳离子交换树脂的蛋白的等电点的PH下使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂；以及使用第二洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第一洗脱液的PH等于或小于所述第一洗涤缓冲液的pH。附图简述
图1示出SDS-PAGE分离、然后进行银染色法(A)和剩余rFVIII的蛋白质印迹法(B)分析的结果。图2示出使用MMV和REO病毒掺加的样品进行UNO S实验的染色的凝胶。图3示出使用MMV和REO病毒掺加的样品进行UNO S实验的染色的凝胶。图4示出下列结果使通过方法变化形式获得的rVWF的纯化制剂在天然状态下通过V8蛋白酶经历蛋白水解消化，然后通过RP-HPLC分离所得肽。图5示出下列结果使通过方法变化形式获得的rVWF的纯化制剂在变性状态下经历胰蛋白酶，然后通过RP-HPLC分离所得肽。发明详述本发明涉及在非-脂质包封的病毒的去除增加的条件下纯化VWF的方法。本发明的方法适用于柱(即，色谱法)以及成批(即，没有柱硬件)方式。本发明的方法使用在阳离子交换树脂上纯化的方法以增加非-脂质包封的病毒的去除。使用阳离子交换色谱法纯化VWF的之前方法在中性pH下进行。这些方法允许制备良好收率和纯度的纯化的WF，但吃惊地，所述方法没有去除非_脂质包封的病毒的能力。术语定义除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有和本发明所属技术领域的技术人员通常理解相同的意思。下列参考文献赋予熟练技术人员本发明中使用的多种术语的通常定义Singleton，et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2d ed. 1994) ；THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed. ,1988) ；THE GLOSSARY OF GENETICS,5TH ED. , R. Rieger, et al. (eds.)，Springer Verlag(1991)；和Hale and Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。本文引用的各公开文献、专利申请、专利和其他参考文献在和本公开一致的程度上通过引用的方式全部并入。如本申请和所附权利要求书中使用的，除非上下文明确地指示，否则此处注意单数形式〃 a，‘‘ “ an"和〃 the"包括复数形式。如本文使用的，除非明确地说明，下列术语具有归于它们的意思。如本文使用的，术语表达(〃 express, “ ‘‘ expressing"禾口〃 expression")是指允许或引起基因或DNA序列中的信息变得明显，例如，通过激活涉及对应的基因或DNA序列的转录和翻译的细胞功能来产生蛋白。DNA序列在细胞中或通过细胞表达以形成"表达产物"，例如蛋白。表达产物本身(例如所得蛋白)也可以称为是"表达的"。表达产物可以表征为细胞内、细胞外或分泌的。术语"细胞内"是指在细胞内部。术语"细胞外" 是指在细胞外部，例如，某些类型的跨膜蛋白。如果其以显著量度在细胞外部、来自细胞上的某处或在细胞内部，则该物质是被细胞"分泌的"。如本文使用的，“多肽"是指这样的聚合物，其由氨基酸残基、结构变体、相关天然存在的结构变体、及其通过肽键连接的合成非-天然存在的类似物构成。合成多肽可以例如使用自动的多肽合成器来制备。术语"蛋白"典型地是指较大多肽。术语"肽"典型地是指较短多肽。术语"多肽"还包括聚合物结构。因此，“多肽"可以是单体、二聚体、 三聚体或较大多聚体结构。这些多聚体结构可以为至多5兆道尔顿或更高。如本文使用的，“等电点"是PH值，在该pH值下水溶液中的多肽的净电荷为零。如本文使用的，多肽的"片段"是指比全长多肽或蛋白表达产物小的多肽或蛋白的任何部分。如本文使用的，“类似物”是指两种或多种多肽中的任一种，其和整个分子或其片段具有基本上类似的结构和相同的生物活性，但是可以具有改变的活性程度。基于涉及一个或多个氨基酸被其他氨基酸取代的一个或多个突变，类似物的它们氨基酸序列组成不同。基于被取代的和氨基酸取代的氨基酸的物理-化学或官能团关系，取代可以是保守的或非保守的。如本文使用的，“变体"是指被修饰以包含通常不是分子的一部分的另外化学部分的多肽、蛋白或它们的类似物。这些部分可以调节分子的溶解度、吸收性、生物半衰期等。 或者所述部分可以降低分子的毒性并且消除或减弱分子的任何不期望的副作用等。能够介导这些效果的部分公开于Remington' s Pharmaceutical Sciences (1980)。使这些部分偶联分子的方法是本领域熟知的。例如，变体可以是具有赋予蛋白更长体内半衰期的化学修饰的凝血因子。在各种方面中，多肽通过糖基化、聚乙二醇化和/或聚唾液酸化。重组VWF前原-VWF的多核苷酸和氨基酸序列分别阐述在SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2中， 并且可分别以GenBank登陆No. NM_000552和NP_000543得到。对应于成熟VWF蛋白的氨基酸序列阐述在SEQ ID NO :3(对应于全长前原-VWF氨基酸序列的氨基酸764-2813)。一种形式的有用rVWF具有至少体内稳定性的性质，例如结合至少一种因子 VIII (FVIII)分子并且任选地具有药理学上可接受的糖基化图案。其特定例子包括不具有 A2 结构域的 WF,因此耐受蛋白水解(Lankhof et al.，Thromb. Haemost. 77 :1008_1013， 1997)，并且来自Val 449至Asn 730的VWF片段包括用于胶原和肝素的糖蛋白Ib-结合结构域和结合位点(Pietu et al.，Biochem. Biophys. Res. Commun. 164 1339—1347，1989)。 VWF稳定至少一种FVIII分子的能力的确定可以根据本领域现有技术中已知的方法在 VWF-缺陷哺乳动物中进行。本发明的rVWF可以通过本领域任何已知的方法来制备。一种具体例子公开于1986年10月23日公开的W086/06096和1990年7月23日提交的美国专利申请 No. 07/559，509，涉及制备重组VWF的方法通过引用并入本文。因此，下列方法是本领域已知的(i)通过基因工程化来产生重组DNA，例如通过RNA的反向转录和/或DNA的扩增； ( )通过转染将重复DNA引入原核细胞或真核细胞，例如通过电穿孔或微注射；(iii)例如以连续或分批的方式来培养所述转染的细胞；(iv)例如构成地或在诱导时表达VWF ；以及 (ν)例如从培养基或通过收获转化的细胞来分离所述VWF，以(vi)例如通过阴离子交换色谱法或亲和色谱法来获得纯化的rVWF。重组VWF可以使用本领域熟知的重组DNA技术在转化的宿主细胞中制备。例如，编码多肽的序列可以使用合适的限制性内切酶从DNA中切除。或者，DNA分子可以使用化学合成技术来合成，例如氨基磷酸酯法。此外，可以使用这些技术的组合。本发明还提供在合适宿主中编码本发明的多肽的载体。所述载体包含多核苷酸， 所述多核苷酸编码操作性地连接合适的表达控制序列的多肽。在多核苷酸插入载体之前或之后，实现该操作性的连接的方法是熟知的。表达控制序列包括启动子、活化剂、增强子、操作子、核糖体结合位点、起始信号、停止信号、封盖信号、多腺苷酸化信号、和涉及转录或翻译的控制的其他信号。其中具有多核苷酸的所得载体用于转化合适的宿主。该转化可以使用本领域熟知的方法来进行。多数可得和熟知的宿主细胞中的任一种可以用于实施本发明。特定宿主的选择取决于本领域识别的多种因素，包括例如和选择的表达载体的相容性、DNA分子编码的肽的毒性、转化率、回收肽的难易程度、表达特性、生物安全性和成本。必须在理解并非所有宿主细胞相等地有效表达特定DNA序列的条件下触发这些因素的平衡。在这些通常规范内，有用的微生物宿主细胞包括细菌、酵母菌和其他真菌、昆虫、植物、培养基中的哺乳动物(包括人)细胞、或本领域已知的其他宿主。然后，将转化的宿主培养和纯化。宿主细胞可以在常规发酵条件下培养，使得期望化合物得以表达。这些发酵条件是本领域熟知的。最后，多肽通过本领域熟知的方法从培养物中纯化。取决于用于表达本发明的化合物的宿主细胞，碳水化合物(寡糖)基团可以便捷地附接在蛋白中已知是糖基化位点的位点。通常当它们是序列Asn-X-Ser/Thr的部分时，0-连接的寡糖附接丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基，而N-连接的寡糖附接天冬酰胺 (Asn)残基，其中X可以是除了脯氨酸的任何氨基酸。X优选是不包括脯氨酸的19种天然存在的氨基酸中的一种。各种类型中发现的N-连接的和0-连接的寡糖与糖残基的结构是不同的。通常在两者上发现的一种类型的糖是N-乙酰基神经氨糖酸(称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接的和0-连接的寡糖的末端残基，并且通过其负电荷可以赋予糖基化的化合物酸性属性。这些位点可以引入本发明的化合物的接头中，并且在多肽化合物(例如，在哺乳动物细胞例如CHO，BHK，COS中)的重组制备的过程中优选被细胞糖基化。然而，这些位点可以进一步通过本领域已知的合成或半合成方法来糖基化。或者，化合物可以通过合成方法来制备。例如，可以使用固相合成技术。合适的技术是本领域熟知的，并且包括Merrifield(1973)，Chem. Polypeptides, pp.335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.) ；Merrifield(1963), J. Am.Chem. Soc. 85 2149 ；Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10 394-414 ；Stewart and Young(1969), Solid Phase Peptide Synthesis ；美国专利 No. 3，941，763 ；Finn et al. (1976)，The Proteins(3rd ed.)2 :105—253 ；禾口 Erickson et al. (1976)，The Proteins(3rd ed.)2 257-527中所述。固相合成是制备各种肽的优选技术，因为其是制备小肽的最成本有效的方法。VffF的片段、变体和类似物制备多肽的片段、变体或类似物的方法是本领域熟知的。多肽片段使用但不限于酶切除(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)来制备，还使用重组方式来产生具有特定氨基酸序列的多肽片段。可以产生多肽片段，包含具有特定活性的蛋白的区域，例如多聚化结构域或本领域已知的任何其他可鉴别的VWF结构域。多肽变体涵盖包括人和非人形式的VWF(例如，鼠源VWF)。本文方法还涵盖包含例如鼠/人融合多肽的嵌合多肽。制备多肽类类似物的方法也是熟知的。多肽的氨基酸序列类似物可以是取代的、 插入的、增加的或缺失的类似物。缺失类似物(包括多肽片段)缺乏对于官能或免疫原活性非必需的天然蛋白的一种或多种残基。插入类似物涉及在多肽的非-末端点处增加例如氨基酸。该类似物可包括插入免疫反应性抗原决定基或简单地插入单一参加。增加类似物(包括多肽片段)包括在蛋白(例如融合蛋白)的两个末端的任一个处增加一个或多个氨基酸。取代类似物典型地在蛋白的一个或多个位点处交换野生型的一个氨基酸和另一个，并且可设计以调节多肽的一种或多种性能，而不损失其他官能或性能。在一个方面中， 取代是保守取代。“保守氨基酸取代"是指氨基酸被具有类型化学特性的侧链的氨基酸取代。制备保守取代的类似氨基酸包括具有下列的那些酸性侧链(谷氨酸，天冬氨酸)；碱性侧链(精氨酸，赖氨酸，组氨酸)；极性酰胺侧链(谷氨酸，天冬酰胺)；疏水性脂肪族侧链 (亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，丙氨酸，甘氨酸)；芳族侧链(苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)；小侧链(甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，蛋氨酸)；或脂肪族羟基侧链(丝氨酸，苏氨酸)。类似物可以和它们衍生的重组VWF基本上同源或基本上相同的。优选的类似物是保留至少一些野生型多肽的生物活性(例如凝血活性)的那些。多肽变体涵盖包括通过这样的技术化学修饰的多肽，所述技术例如为遍在蛋白化、糖基化包括聚唾液酸化、缀合治疗剂或诊断剂、标记、共价聚合物附接例如聚乙二醇化 (使用聚乙二醇衍生化)、引入不可水解的键、和通过通常不存在于人蛋白中的氨基酸例如鸟氨酸的化学合成来插入或取代。变体保留本发明的非修饰的分子的相同或基本上相同的结合性能。这些化学修饰可包括直接或间接(例如通过接头)附接试剂至VWF多肽。在间接附接的情况下，涵盖接头可以是可水解的或不可水解的。制备聚乙二醇化多肽类似物通常包括下列步骤(a)在条件下使多肽和聚乙二醇 (例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应，从而结合构建体多肽附接一个或多个PEG基团； 以及(b)获得反应产物。通常，醛化反应的最优反应条件基于已知的参数和期望结果来确定。例如，PEG 蛋白的比越高，聚-聚乙二醇化产物的百分率越高。在一些实施方案中，结合构建体在N-末端处具有单一 PEG部分。聚乙二醇(PEG)可以附接凝血因子以提供体内更长半衰期。PEG基团可以具有任何便捷的分子量，并且可以是直链或支链的。PEG的平均分子量为约2千道尔顿(〃 kD〃 )至约100kDaJ々 5kDa至约50kDa、或约5kDa至约lOkDa。 PEG基团通过醛化或还原性烷基化经过PEG部分上的中性或工程化反应性基团(例如，醛、 氨基、硫醇或酯基)至凝血因子上的反应性基团(例如，醛、氨基或酯基)而附接凝血因子， 或通过本领域已知的任何其他技术。制备聚唾液酸化的多肽的方法在美国专利公开20060160948，Femandes et Gregoriadis ；Biochim. Biophys. Acta 1341 :26_34,1997 禾口 Saenko et al., Haemophilia 12 =42-51,2006中有所描述。简言之，将含有0. IM NaI04的多聚乙酰神经氨糖酸溶液在室温下在暗处搅拌以氧化CA。将激活的CA溶液针对例如0.05M磷酸钠缓冲液(pH 7. 2)在暗处透析，并且将该溶液加入rVWF溶液，并且在室温下在暗处在温和振荡的条件下孵育18h。 然后可以通过超滤/渗滤从rVWF-聚唾液酸缀合物分离游离试剂。rVWF和聚唾液酸的缀合还可以使用戊二醛作为交联剂来完成(Migneault et al. ,Biotechniques 37:790-796， 2004)。还涵盖的是本发明的多肽可以是和第二试剂(其是多肽)的融合蛋白。在一个实施方案中，第二试剂(其是多肽)不限于酶、生长因子、抗体、细胞因子、趋化因子、细胞-表面受体、细胞表面受体的细胞外结构域、细胞粘附分子、或上述蛋白的片段或活性结构域。 在相关的实施方案中，第二试剂是凝血因子，例如因子VIII、因子VII、因子IX。涵盖的融合蛋白通过本领域熟知的化学或重组技术来制备。还涵盖，前原-VWF和原-VWF多肽可以在本发明的制剂中提供治疗益处。例如，美国专利No. 7，005，502描述药物制剂，包含体外在存在血小板的条件下诱导凝血产生的实质量的原-VWF。除了天然存在的成熟VWF的重组生物活性片段、变体或类似物，本发明涵盖前原-VWF的重组生物活性片段、变体或类似物(阐述于SEQ ID NO 2)或原-VWF多肽的重组生物活性片段、变体或类似物(SEQ ID NO :2的氨基酸残基23至764)在本文所述制剂中的应用。编码片段、变体和类似物的多核苷酸可以由熟练技术人员容易地产生，以编码具有和天然存在的分子相同或类似生物活性的天然存在的分子的生物活性片段、变体或类似物。这些多核苷酸可以使用PCR技术、DNA编码分子的消化/连接等来制备。因此，本领域技术人员将能够使用本领域已知的任何方法(包括但不限于位点_特异性突变)在DNA链中产生单一碱基改变，以导致改变的密码子和错义突变。如本文使用的，措词"中等严格杂交条件〃例如是指在42°C下在50%甲酰胺中杂交，并且在60°C下在0. Ix SSC，0. 1 % SDS中洗涤。本领域技术人员理解，基于待杂交的序列的长度和GC核苷酸碱基含量，这些条件发生改变。本领域中的公式标准适于确定精确的杂交条件。参见Sambrook et al.，9. 47-9. 51， Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)。VffF的制备方法工业上，VWF、特别是人重组VWF(rVWF)合成并且在基因工程化的CHO细胞系中和 rFVIII—起表达。共表达的rVWF的功能是在细胞培养过程中稳定rFVIII。rVWF在细胞中合成为原型，含有附接N-末端的较大原-肽。在内质网和Golgi设备中成熟时，通过细胞蛋白酶弗林蛋白酶的作用，原-肽切除，并且分泌为相同子单元的均聚物，由表达的蛋白的二聚体构成。VffF的纯化本文提供一种从含蛋白的溶液中去除非-脂质包封的病毒的方法，包括在高于所述蛋白的等电点的PH下将所述溶液施加至阳离子交换树脂；以及使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第一洗涤缓冲液的PH等于或小于施加至所述阳离子交换树脂的溶液的PH。在一个方面中，溶液的pH比蛋白的等电点高约1个pH单位。在其他方面中，溶液的PH比蛋白的等电点高约1. 2，或约1. 4，或约1. 6，或约1. 8，或约2. 0，或约2. 2，或约2. 4， 或约2. 6，或约2. 8，或约3. 0,或约3. 2，或约3. 4，或约3. 6，或约3. 8，或约4. 0,或约4. 2，或约4. 4，或约4. 6，或约4. 8，或约5. 0,或约5. 5，或约6. 0个pH单位或更高。在这些实施方案中，pH大于约7。在其他方面中，pH为约7. 1，或约7. 2，或约7. 3， 或约7. 4，或约7. 5，或约7. 6，或约7. 7，或约7. 8，或约7. 9，或约8. 0,或约8. 1，或约8. 2， 或约8. 3，或约8. 4，或约8. 5，或约8. 6，或约8. 7，或约8. 8，或约8. 9，或约9. 0，或约9. 1， 或约9. 2，或约9. 3，或约9. 4，或约9. 5，或约9. 6，或约9. 7，或约9. 8，或约9. 9，或约10. 0， 或约10. 1，或约10. 2，或约10. 3，或约10. 4，或约10. 5，或约10. 6，或约10. 7，或约10. 8，或约10. 9，或约11.0，或约11. 1，或约11. 2，或约11. 3，或约11. 4，或约11. 5，或约11. 6，或约11. 7，或约11. 8，或约11. 9，或约12. 0，或约12. 1，或约12. 2，或约12. 3，或约12. 4，或约12. 5，或约12. 6，或约12. 7，或约12. 8，或约12. 9，或约13. 0或更高。在另一实施方案中，提供一种从含蛋白的溶液中去除非_脂质包封的病毒的方法，包括将所述溶液施加至阳离子交换树脂；在高于施加至所述阳离子交换树脂的溶液的PH的pH下使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂；以及使用第二洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第二洗涤缓冲液的PH等于或小于所述第一洗涤缓冲液的PH。在一个方面中，第一洗涤缓冲液的pH比施加至阳离子交换树脂的溶液的PH高约1个pH单位。对于该阶段，涵盖的是，离子交换介质是UNOsphere S (BioRad Laboratories, Inc.，Hercules, CA)，但是在实施所述方法时可以使用其他阳离子交换体系。这些阳离子交换体系是本领域技术人员已知的。在其他方面中，第一洗涤缓冲液的pH比蛋白的等电点高约1. 1，或约1.2，或约 1.3，或约1.4，或约1.5，或约1.6，或约1.7，或约1.8，或约1. 9，或约2. 0，或约2. 1，或约
2.2，或约2. 3，或约2. 4，或约2. 5，或约2. 6，或约2. 7，或约2. 8，或约2. 9，或约3. 0，或约
3.1，或约3. 2，或约3. 3，或约3. 4，或约3. 5，或约3. 6，或约3. 7，或约3. 8，或约3. 9，或约
4.0，或约4. 1，或约4. 2，或约4. 3，或约4. 4，或约4. 5，或约4. 6，或约4. 7，或约4. 8，或约
4.9，或约5. 0，或约5. 1，或约5. 2，或约5. 3，或约5. 4，或约5. 5，或约5. 6，或约5. 7，或约
5.8，或约5. 9，或约6. 0个pH单位或更高。在这些实施方案中，第一洗涤缓冲液的pH大于约 7。在其他方面中，第一洗涤缓冲液的pH为约7. 1，或约7. 2，或约7. 3，或约7. 4，或约7. 5， 或约7. 6，或约7. 7，或约7. 8，或约7. 9，或约8. 0，或约8. 1，或约8. 2，或约8. 3，或约8. 4，或约8. 5，或约8. 6，或约8. 7，或约8. 8，或约8. 9，或约9. 0,或约9. 1，或约9. 2，或约9. 3，或约9. 4，或约9. 5，或约9. 6，或约9. 7，或约9. 8，或约9. 9，或约10. 0，或约10. 1，或约10.2， 或约10. 3，或约10. 4，或约10. 5，或约10. 6，或约10. 7，或约10. 8，或约10. 9，或约11.0，或约11. 1，或约11. 2，或约11. 3，或约11. 4，或约11. 5，或约11. 6，或约11. 7，或约11. 8，或约11. 9，或约12. 0，或约12. 1，或约12. 2，或约12. 3，或约12. 4，或约12. 5，或约12. 6，或约 12. 7，或约12. 8，或约12. 9，或约13. 0或更高。下列实施例不旨在是限制性的，而仅仅是本发明的特定实施方案的例子。 实施例实施例1下文所述测定中使用的病毒和细胞如下RE0-3 (呼肠孤病毒科；非-包封的dsRNA病毒)，菌株Dearing (ATCC VR-824)得自 ATCC0病毒在得自ECACC(84113001)的Vero细胞上繁殖和滴定。MMV(细小病毒科；非-包封的ssDNA病毒)，原型菌株(ATCC VR-1346)，得自美国典型培养物保藏中心，Rockville, Maryland。病毒在A9细胞(ATCC CCL-1. 4)上繁殖和滴定。PPV(细小病毒科；非-包封的 ssDNA 病毒)、菌株 Tennessee (BRFF#PP951024)得自 Biological Research Faculty & Facility, Ijamsville, Maryland。病毒在 PK-13 细胞(ATCC CRL-6489)上繁殖和滴定。 EMCV(小核粮核酸病毒科；非-包封的ssRNA) (ATCC #VR-129B)得自美国典型培养物保藏中心。病毒在 Vero 细胞(European Collection of Cell Cultures,ECACC, #84113001)上繁殖和滴定。HadV(腺病毒科；非-包封的dsDNA)，菌株Adenoid 75 (ATCC VR-5)，得自美国典型培养物保藏中心。病毒在HeLa细胞(ATCC CCL-2)上繁殖和滴定。
涉及示例性VWF纯化方法的步骤包括 细胞培养基上清的免疫亲和色谱法i.流通馏分 阴离子交换(例如，三甲基氨基乙基阴离子交换柱) 过滤(0. 45/0. 2 μ m) 阴离子交换(例如，Mustang Q(Pall Corporation)) 病毒灭活(例如，使用溶剂/去污剂处理) 过滤(0. 8/0. 65 μ m)·阳离子交换(例如，UNO S柱) 超滤/浓缩 过滤(0. 45/0. 2 μ m) 凝胶过滤(Superose 6 预备级(GE Life Sciences))UNO S步骤的优化.在UNO S步骤的过程中，rVWF结合强阳离子交换树脂，同时一些杂质穿过。在使用传导性增加的缓冲液洗涤柱后，结合的rVWF在盐步骤的条件下从柱上释放。在初始病毒去除研究中，该步骤显示对于模型REO病毒至少具有显著的去除率。应用的参数的条件和对应的结果列于下面表1中。表 1
权利要求
1.一种从含蛋白的溶液中去除非-脂质包封的病毒的方法，包括 在高于所述蛋白的等电点的PH下将所述溶液施加至阳离子交换树脂；以及使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第一洗涤缓冲液的 PH等于或小于施加至所述阳离子交换树脂的溶液的pH。
2.权利要求1所述的方法，其中施加至所述阳离子交换树脂的溶液比所述蛋白的等电点高至少1个PH单位。
3.一种从含蛋白的溶液中去除非-脂质包封的病毒的方法，包括 将所述溶液施加至阳离子交换树脂；在高于施加至所述阳离子交换树脂的溶液的PH的pH下使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂；以及使用第二洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第一洗脱液的PH 等于或小于所述第一洗涤缓冲液的PH。
4.权利要求3所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液的pH比施加至所述阳离子交换树脂的蛋白的等电点高至少1个PH单位。
5.一种从含蛋白的溶液中去除非-脂质包封的病毒的方法，包括 在高于所述蛋白的等电点的PH下将所述溶液施加至阳离子交换树脂；和在高于施加至所述阳离子交换树脂的蛋白的等电点的PH下使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂；以及使用第二洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第一洗脱液的PH 等于或小于所述第一洗涤缓冲液的PH。
6.权利要求5所述的方法，其中施加至所述阳离子交换树脂的溶液比所述蛋白的等电点高至少1个PH单位。
7.权利要求5所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液的pH比施加至所述阳离子交换树脂的溶液的PH高至少1个pH单位。
8.权利要求2、4、6或7所述的方法，其中所述pH大于7.0。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述溶液中的蛋白是分子量为至少约150 千道尔顿的多肽。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换树脂具有选自羧甲基 (CM)、磺基烷基(SP，SE)、纤维素的硫酸酯、肝素和甲基磺酸根(S)的带负电荷基团。
11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述蛋白是凝血蛋白。
12.权利要求11所述的方法，其中所述凝血蛋白选自因子VIII和VonWillebrand因子。
13.一种从含von Willebrand(VffF)的溶液中去除非-脂质包封的病毒的方法，包括 在高于所述蛋白的等电点的PH下将所述溶液施加至阳离子交换树脂；以及使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第一洗涤缓冲液的 PH等于或小于施加至所述阳离子交换树脂的溶液的pH。
14.一种从含VWF的溶液中去除非-脂质包封的病毒的方法，包括 将所述溶液施加至阳离子交换树脂；在高于施加至所述阳离子交换树脂的溶液的PH的pH下使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂；以及使用第二洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第一洗脱液的PH 等于或小于所述第一洗涤缓冲液的PH。
15. 一种从含VWF的溶液中去除非-脂质包封的病毒的方法，包括 在高于所述蛋白的等电点的PH下将所述溶液施加至阳离子交换树脂；和在高于施加至所述阳离子交换树脂的蛋白的等电点的PH下使用第一洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂；以及使用第二洗涤缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂以形成洗脱液，所述第一洗脱液的PH 等于或小于所述第一洗涤缓冲液的PH。
全文摘要
本发明提供纯化Von Willebrand因子(VWF)以增加非-脂质包封的病毒的去除的方法。
文档编号C07K14/755GK102482341SQ201080039582
公开日2012年5月30日 申请日期2010年8月20日 优先权日2009年8月20日
发明者A·米特雷尔, C·迈尔, M·哈斯拉赫尔 申请人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特国际公司