专利名称：淀粉样蛋白寡聚体构象型抗原表位多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于含肽的医药配制品领域，具体涉及一种淀粉样蛋白寡聚体构象型抗原 表位多肽及其应用；本发明应用于识别多种淀粉样蛋白寡聚体的抗体制备淀粉样蛋白疾病 的诊断、治疗和实验研究。
背景技术：
多年来，淀粉样蛋白或多肽自身的聚集导致的多种疾病对人类的健康造成了越来 越大的危害。某些蛋白质本身无毒性或毒性很小，但它们自身可聚集成具有毒性作用的寡 聚物(oligomer)或纤维状物(fibril)而引起一系列疾病，如由Beta-amyloid (A-Beta)引 起的阿兹海默病(俗称老年性痴呆)(Alzheimer，disease, AD)，由alpha-synuclein引起 的帕金森病(Parkinson，disease, PD)，由朊病毒蛋白(Prion protein (PrP))引起的包 括疯牛病在内的人和动物的至少十余种脑病，由含有多聚谷氨酰胺(PolyQ)的多肽引起的 包括亨廷顿病(Huntington’ s disease)的至少9种遗传性神经退行性疾病，由胰岛淀粉样 多肽(islet amyloid polypeptide, IAPP，amy 1 in)引起的II型糖尿病及由长时间透析导 致的溶菌酶(lysozyme)聚集沉积导致的疾病等。其中，对人类健康危害最大的为AD和PD 及II型糖尿病。医学统计表明，我国和欧美国家中65岁以上老年人中5 6%患有AD，并 且发病率逐年上升。该病已被列为导致死亡的第四大疾病，仅次于心脏病、癌症和中风。另 有约1%的65岁以上老年人患有PD。而患有II型糖尿病的人数可达总人口的5%以上。这 些疾病对人类的健康造成了越来越大的危害，其发病的根本原因(或部分原因)在于淀粉样 蛋白或多肽自身的聚集。研究表明，不同蛋白质的聚集最先始于错误折叠或变性的蛋白质(或多肽)单体， 单体多肽链间氢键的形成导致了蛋白分子的聚合。首先形成由电子或原子力显微镜可观察 到的大小约3-10 nm的可溶性的球形寡聚物，某些寡聚物可进一步结合成弯曲柔韧的丝状 物(protofibril)，进而形成直径为6-10 nm的表面光滑或呈螺旋的纤维。非同源性的蛋白 质最终可形成具有相似结构的蛋白聚合物。由A-Bet^alpha-synuclein和amylin等各种 各样的淀粉样蛋白聚集形成的纤维都含有“cross-Beta”结构，其中Beta片层构成的骨架 与纤维纵轴垂直，而骨架中的氢键网与纵轴平行。多肽在Beta片层中排列为平行的Beta 链，在Beta片层中，氨基酸都有精确的位置。即使是不同来源的寡聚物也具有相似的结构 特征，寡聚物特异性识别抗体可以与由不同来源的淀粉样蛋白单体形成的寡聚物结合，而 不与它们的单体和纤维结合。这表明寡聚物可由蛋白多肽骨架形成独立于其氨基酸一级序 列之外的共同的寡聚物特有的抗原表位。Glabe实验室应用连接有A-Beta 40的胶体金颗 粒模拟A-Beta 40寡聚物制备出了不仅可与A-Beta 40和A-Beta 42寡聚物结合并且还可 与 alpha-synuclein、IAPP, PolyQ, PrP, Insulin, Lysozyme 等形成的寡聚物特异结合的多 克隆抗体(All)，该抗体还能够有效抑制所有这些寡聚物的细胞毒性。过去人们一直认为淀粉样蛋白疾病的发生是由蛋白质聚集成的不溶性的纤维引 起的。近年来大量的研究表明，许多淀粉样蛋白疾病的关键致病因素是体积较小的水溶性的寡聚物。由蛋白寡聚物引起的疾病存在着相似的机理，即细胞膜损伤、氧化应激、线粒体 功能失调、细胞死亡、信号传递异常等。但人们对寡聚物影响细胞正常的生理活动的详细机 理尚不清楚。寡聚物的拓扑结构及其抗原表位如何，怎样才能有效地抑制其细胞毒性等这 些都是人们亟待探讨和解决的问题。应用主动和被动的免疫技术治疗AD从而抑制A-Beta 的聚集，并加快A-Beta的清除是AD研究领域的热点之一。2000-2002年美国科研人员应用A-Beta制成的疫苗进行了动物试验和一期临床 试验。实验结果令人鼓舞，实验动物和病人的临床症状明显减轻，记忆力明显恢复，病理变 化也显著减退。同时，应用抗A-Beta抗体对实验动物的被动免疫治疗也收到了很好的疗 效。然而，不幸的是在二期临床试验中，虽然大多数的病人仍表现出良好效果，却有6%的病 人表现出了脑膜炎的症状和病理变化，有的病人甚至发生死亡。因此，对A-Beta疫苗和抗 体的实验研究立即终止。尽管如此，从上述的研究我们可以看出A-Beta疫苗对AD的治疗 效果是应该肯定的。研究表明由A-Beta疫苗导致的副作用可能是由该疫苗诱导机体产生 的T淋巴细胞介导的自身免疫反应，并且该副作用的产生是由Thl而不是Th2型免疫反应 造成的。为了克服A-Beta疫苗的副作用，在疫苗设计时应加强诱发B细胞反应和Th2型免 疫反应的发生，并且避开诱发T细胞免疫反应和Thl型免疫反应的发生。基于A-Beta寡聚 物抗原表位肽设计的疫苗能够容易地兼顾上述特性，还不会诱导机体形成抗A-Beta单体 的抗体。后一特性可彻底消除疫苗与体内A-Beta单体之间产生副作用的可能，并且还不会 影响A-beta的正常生理功能。因此，根据A-Beta寡聚物抗原表位研制的肽疫苗将具有潜 在的应用价值，而获得A-Beta寡聚物抗原表位是该肽疫苗设计和研制的先决条件。所以， 在科研和临床中均需要获取一种淀粉样蛋白寡聚体构象型抗原表位多肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种淀粉样蛋白寡聚体构象型抗原表位多肽(简称ΡΕ0Ζ)， 其氨基酸序列为Cys-Ser-Hi s-Ala-Leu-Hi s-Asn-Asn-Cys，或由上述的氨基酸序列经过取 代、缺失、或添加一个或几个氨基酸，且具有抑制淀粉样蛋白聚集作用的多肽。本发明可以 有效刺激机体产生识别淀粉样蛋白寡聚体的特异性抗体，并且该抗体可以抑制淀粉样蛋白 的聚集和细胞毒性。在本发明的具体实施例中，将本发明所述多肽的N端应用PEG2000修饰(序列为 PEG-Cys4er-His-Ala-Leu-His-Asn-Asn-Cys)、删除丙氨酸(序列为Cys-Ser-His-Leu_Hi s-Asn-Asn-Cys)、丝氨酸置换成丙氨酸(序列为Cys-Ala-His-Ala-Leu-His-Asn-Asn_Cys) 或插入丙氨酸(序列为Cys-Ser-His-Ala-Leu-His-Asn-Asn-Cys)，经检测表明PEOZ多肽 经过某些修饰、某个氨基酸经置换、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍能保留有与All结合 的能力。体外试验表明，本发明所述的多肽可与All结合，证明了所述的多肽是多克隆All 所对应的抗原表位之一；所述的多肽具有良好的抗原特性，可有效刺激机体产生抗体；所 述的多肽是多种淀粉样蛋白寡聚体上所共有的抗原表位；所述的多肽抗体可以明显抑制淀 粉样蛋白Ab42、PrP, amylin、a-synuclein, Iysozyme聚集；所述的多肽抗体能够明显抑制 Ab42、PrP> amylin、a-synuclein、Iysozyme 的细胞毒性。本发明还提供所述多肽应用于淀粉样蛋白寡聚体抑制剂。
本发明还提供所述多肽应用于制备特异识别淀粉样蛋白寡聚体抗体。
本发明还提供所述多肽应用于制备治疗淀粉样蛋白疾病疫苗。本发明相比现有技术具有如下有益效果
1.本发明可以有效刺激机体产生识别淀粉样蛋白寡聚体的特异性抗体，并且该抗体可 以抑制淀粉样蛋白的聚集和细胞毒性。2.基于本发明的疫苗能够加强诱发B细胞反应和Th2型免疫反应的发生，并且避 开诱发τ细胞免疫反应和Thl型免疫反应的发生；不会诱导机体形成抗A-Beta单体的抗 体，可彻底消除疫苗与体内A-Beta单体之间产生副作用的可能，并且还不会影响A-beta的 正常生理功能。3.本发明具有较好的免疫原性，可有效刺激机体产生抗体，因而在淀粉样蛋白疾 病的治疗或预防用疫苗的研制方面可作为良好的免疫原。
图1. PEOZ与All结合的ELISA测定；
图2.经置换、缺失或插入了氨基酸的PEOZ与All结合的ELISA测定；
图3.经PEOZ免疫后小鼠血清中的抗体与Ab42寡聚体结合；
图4. PEOZ抗体与多种淀粉样蛋白的寡聚体结合；
图5. ThT荧光染色测定PEOZ抗体抑制淀粉样蛋白的聚集；
图6. PEOZ抗体抑制淀粉样蛋白的细胞毒性；
具体实施例方式
实施例1
一种多肽(简称 PEOZ)，其氨基酸序列为Cys-Ser-His-Ala-Leu-His-Asn-Asn-Cys，或 由上述的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸，且具有抑制淀粉样蛋白聚 集作用的多肽。本发明可以有效刺激机体产生识别淀粉样蛋白寡聚体的特异性抗体，并且 该抗体可以抑制淀粉样蛋白的聚集和细胞毒性。将所述多肽的N 端应用 PEG2000 修饰(序列为PEG-Cys4er-His-Ala-Leu-His-A sn-Asn-Cys )、删除丙氨酸(序列为Cys-Ser-Hi s-Leu-Hi s-Asn-Asn-Cys )、丝氨酸置换成丙 氨酸(序列为Cys-Ala-His-Ala-Leu-His-Asn-Asn-Cys)或插入丙氨酸(序列为Cysle r-Hi s-Ala-Leu-Hi s-Asn-Asn-Cy s ),经检测表明PEOZ多肽经过某些修饰、某个氨基酸经置 换、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍能保留有与All结合的能力。体外试验表明，所述的多肽可与All结合，证明了所述的多肽是多克隆All所对应 的抗原表位之一；所述的多肽具有良好的抗原特性，可有效刺激机体产生抗体；所述的多 肽是多种淀粉样蛋白寡聚体上所共有的抗原表位；所述的多肽抗体可以明显抑制淀粉样蛋 白Ab42、PrP, amylin、a-synuclein、Iysozyme聚集；所述的多肽抗体能够明显抑制Ab42、 PrP> amylin、a-synuclein、Iysozyme 的细胞毒性。所述多肽应用于淀粉样蛋白聚抑制剂；还应用于制备特异识别淀粉样蛋白寡聚体 抗体；还应用于制备治疗淀粉样蛋白疾病疫苗。所述多肽可以有效刺激机体产生识别淀粉样蛋白寡聚体的特异性抗体，并且该抗 体可以抑制淀粉样蛋白的聚集和细胞毒性。基于所述多肽的疫苗能够加强诱发B细胞反应 和Th2型免疫反应的发生，并且避开诱发T细胞免疫反应和Thl型免疫反应的发生；不会诱导机体形成抗A-Beta单体的抗体，可彻底消除疫苗与体内A-Beta单体之间产生副作用的 可能，并且还不会影响A-beta的正常生理功能。PEOZ的合成制备的方法为
PEOZ为一环形七肽，由上海吉尔生化有限公司按常规方法合成制备(制备方法参见 Weng C C, Peter D W. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis A Practical Approach. Oxford: University Press, 2000. 1 8 ；Atherton Ε, Sheppard R C. Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1989) ；PEOZ ^it^ 大于或等于95% ;PE0Z保存于-20 ° C，避免反复冻融。PEOZ用于特异抗淀粉样蛋白寡聚体抗体的制备方法为
将展示PEOZ多肽的M13噬菌体免疫新西兰大白兔。每2周免疫一次，每次免疫用抗原 为个噬菌粒/兔。共免疫4次。于最后一次免疫15天后，采集兔血清。以连接有PEOZ多 肽的琼脂糖凝胶对兔血清进行亲和层析，纯化抗PEOZ的抗体。该特异结合淀粉样蛋白的寡 聚体的抗体可用于实验研究，并对淀粉样蛋白疾病的治疗和临床诊断也具有潜在的应用价 值。PEOZ的所有的实验数据都是通过至少3次独立的实验获得的，实验数据表示为平 均数加减标准差。数据的统计分析是应用One-way ANOVA软件进行。以下结合实施例2-7，进一步阐述PEOZ的性质。实施例2 =PEOZ与多克隆抗体All结合
将100 μ 1 PEOZ (1 mg/孔)包被96孔酶联免疫微孔板(以不包被PEOZ的孔作为对 照)，置37° C 2 h，以3% BSA 37° C封闭2 h，200 μ L/孔。以PBS洗板3次，。每孔加 入100 μ 1 All (1 :500)，室温孵育1 h后，用含有0. 1% Tween-20的PBS洗涤3次。室温 孵育1 h后，用含有0. 1% Tween-20的PBS洗涤3次。每孔加入100 μ 1稀释后的羊抗兔 HRP酶标二抗(1 5000),室温孵育1 h后，用含有0. 1% Tween-20的PBS洗涤3次。每孔加 入底物溶液TMB IOOyL,放置37° C 20 min，然后每孔加入50 μ 1 1 mmol/L硫酸终止反 应，于酶联免疫检测仪上测定OD值(波长450nm)。图1所示PEOZ可被All特异识别。PEOZ 是以All作为筛选底物获得的多肽，它与All的结合证实了它是多克隆抗体All所对应的 抗原表位之一。实施例3 经置换、缺失或插入了氨基酸的PEOZ仍与All结合
将 PEOZ 的 N 端应用 PEG2000 修饰(简称为 PEG-PE0Z)(序列为PEG-CysIer-His-A la-Leu-His-Asn-Asn-Cys)、删除丙氨酸(简称为ΡΕ0Ζ_ΔΑ)(序列为Cys-Ser-His-Leu_Hi s-Asn-Asn-Cys)、丝氨酸置换成丙氨酸(简称为PE0Z-S/A)(序列为=Cys-Ala-His-Ala-Le u-His-Asn-Asn-Cys)或插入丙氨酸(简称为PE0Z_G)(序列为Cys-Ser-His-Ala-Leu-H is-Asn-Asn-Cys)0为了能够检测改造后的多肽与All的结合情况，将这些多肽与带有组氨 酸标签的未改造的PEOZ竞争地与All结合，然后以ELISA检测后者与All的结合情况。将 加入1 mg未改造的带有标签的PEOZ与10 mg改造后的PEOZ的混合物100 ml加入包被有 All的孔中，然后用ELISA检测带有标签的PEOZ与All的结合，测定OD值，结果见图2。表 明PEOZ多肽经过某些修饰、某个氨基酸经置换、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍能与未修 饰改造的PEOZ有效竞争结合All，致使带有标签的PEOZ与All的结合明显降低(与单独的 PEOZ阳性对照相比，P<0. 01)。
实施例4: PEOZ可诱发机体产生抗体
应用展示PEOZ多肽的M13噬菌体及未有多肽展示的噬菌体(作为对照)免疫小鼠(5只 /组)，每只每次免疫噬菌体IOltl个。每2周免疫一次，共免疫4次。第4次免疫后15天采 血，分离血清。应用ELISA检测血清中PEOZ抗体的含量。将100 μ 1 Ab寡聚体(1 mg/孔) 包被96孔酶联免疫微孔板，置37° C 2 h，以3% BSA 37° C封闭2 h (200 μ L/孔)。以 PBS洗板3次，加入2000倍稀释的血清，室温孵育1 h后，用含有0. 1% Tween-20的PBS洗 涤3次。每孔加入100 μ 稀释后的羊抗鼠酶标二抗(1:3000)，室温孵育1 h后，用含有 0.1% Tween-20的PBS洗涤3次。每孔加入底物溶液TMB 100 μ L，放置37° C 20min，然 后每孔加入50 μ 1 1 mmol/L硫酸终止反应，于酶联免疫检测仪上测定OD值(波长450nm) (图3)。图2所示免疫PEOZ的5只小鼠都能产生抗PEOZ的抗体，表明PEOZ具有良好的抗 原特性，可有效刺激机体产生抗体。实施例5 =PEOZ的免疫抗体的制备及其与各淀粉样蛋白寡聚体的结合
将展示PEOZ多肽的M13噬菌体免疫新西兰大白兔。每2周免疫一次，每次抗原IO12个 噬菌粒。共免疫4次。于最后一次免疫15天后，采集兔血清。以连接有PEOZ多肽的琼脂 糖凝胶对兔血清进行亲和层析，纯化抗PEOZ的抗体。100 μ 1 Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、lysozyme 单体(mon)、寡聚体(olig) 和纤维(fib) (1 mg/孔)分别包被96孔酶联免疫微孔板，BSA为阴性对照。以PEOZ抗体 作为一抗，以HRP标记的羊抗兔LgG作为二抗，并按上述ELISA方法进行实验操作。图4显 示，PEOZ抗体可分别与Ab、PrP, amylin、a-synuclein的寡聚体结合，而不与它们的单体和 纤维结合(lysozyme除外)，表明PEOZ是多种淀粉样蛋白寡聚体上所共有的抗原表位，而淀 粉样蛋白的单体和纤维没有这种抗原表位(lysozyme除外)(图4)。实施例6 =PEOZ抗体体外抑制淀粉样蛋白的聚集
1)将国外购买的Ab42、amylin、a-synuclein以六氟异丙醇(HFIP)溶解至1 mg/ml，室 温超声波处理10 min，分装到印idorf管中，与真空中挥发HFIP，然后于-20 ° C保存。用 前将HFIP处理过的Ab42、amylin、a-synuclein在室温放置20 min，然后加入二甲基亚砜 (DMS0)，使各蛋白浓度为5 mg/ml，然后以0. 02 M pH 7. 4的PBS缓冲液进行稀释至所需浓 度。PrP、lysozyme则直接用0. 02 M pH 7. 4 PBS制备到所需浓度。2)将PEOZ抗体溶解于0. 02 M pH 7. 4的PBS缓冲液中，然后加入到Ab42、PrP, amylin、a-synuclein, Iysozym 溶液(lysozym 为 pH2. 5 的醋酸缓冲液，其余样品为 pH7. 4 的PBS缓冲液)中，使各蛋白的终浓度分别为10、200、20、40、200 μ M0各蛋白与PEOZ抗体 的摩尔比分别为1:1、10:1、1:1、2:1和10:1。以不加PEOZ抗体的蛋白溶液做为对照。将 Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、Iysozym 样品于 37 ° C (lysozym 放置于 65 ° C)分别 放置1天、5天、5小时、4天和6天。3)将硫黄素(ThT)溶解在pH 6. 5、50 mM的磷酸盐缓冲液使其浓度为5 mM。取孵 育后的样品20 ml加入到含有180 ml ThT溶液的黑色酶标板中。混勻后在多功能酶标仪 上以450 nm激发波长和482 nm的发射波长测定ThT的荧光强度。将各样品的荧光强度减 去ThT本身的背景荧光，并分析样品之间的差异显著情况。加入PEOZ抗体后降低的蛋白荧 光强度除以不加抗体的蛋白荧光强度即为抗体对蛋白聚集的抑制率。图5为PEOZ抗体对 Ab42、amylin、a-synuclein、lysozyme, PrP的聚集抑制率，表明PEOZ可明显抑制各淀粉样蛋白的聚集。实施例7 PEOZ抗体抑制淀粉样蛋白的细胞毒性
用含10%胎牛血清的培养基(MEM)将SH-SY5Y细胞配成单个细胞悬液，以每孔10000 个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔体积100 UL0细胞于37 ° C培养M小时，培养箱 C02 浓度为 5%。每孔加入样品(Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、lysozyme 与 PEOZ 抗体的 混合物，淀粉样蛋白对照及PBS对照)，Ab42、PrP, amylin、a-synuclein, lysozyme蛋白的 终浓度是分别为2、200、5、2、20 μM，PE0Z抗体的终浓度为l、20、2.5、l、10 μ Μ。细胞继续 培养48小时后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL) 10 μ L，37° C孵育3小时，终止培养，每孔 加100 μ L晶体溶解液(10%SDS和5%异丁醇溶解在0. 01 M HCL中)，37° C孵育过夜，使 结晶物充分溶解。在多功能酶联免疫检测仪上以570nm波长测定各孔光吸收值。以样品 的吸光度除以不加样品的细胞的吸光度作为细胞的活性指标，并分析样品之间的差异显著 情况(与各淀粉样蛋白对照相比，0，P<0. 05 ;#，Ρ<0.01)，结果表明，PEOZ抗体能够明显抑制 Ab42> PrP> amylin> a-synuclein> lysozyme 白勺个生( 6)。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
权利要求
1.如下(a)或(b)的多肽，(a)其氨基酸序列为Cys-Ser-His-Ala-Leu-His-Asn-Asn-Cys，(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸，且具有抑制淀粉 样蛋白聚集作用的由(a)衍生的多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其为(a)所示的多肽N端用PEG2000修饰。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为=Cys-Ser-His-Leu-His-Asn—Asn—Cys。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为CyS-Ala-HiS-Ala-LeU-Hi s-Asn-Asn-Cys。
5.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为=Cys-Ser-His-Ala-Leu-Hi s-Asn-Asn-Cys。
6.根据权利要求1-5任一项所述多肽应用于淀粉样蛋白寡聚体抑制剂。
7.根据权利要求1-5任一项所述多肽应用于制备特异识别淀粉样蛋白寡聚体抗体。
8.根据权利要求1-5任一项所述多肽应用于制备治疗淀粉样蛋白疾病疫苗。
全文摘要
本发明属于含肽的医药配制品领域，具体涉及一种淀粉样蛋白寡聚体构象型抗原表位多肽及其应用；本发明应用于识别多种淀粉样蛋白寡聚体的抗体制备淀粉样蛋白疾病的诊断、治疗和实验研究。本发明提供一种淀粉样蛋白寡聚体构象型抗原表位多肽(简称PEOZ)，其氨基酸序列为Cys-Ser-His-Ala-Leu-His-Asn-Asn-Cys，或由上述的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸。本发明可以有效刺激机体产生识别淀粉样蛋白寡聚体的特异性抗体，并且该抗体可以抑制淀粉样蛋白的聚集和细胞毒性。
文档编号A61P25/16GK102060912SQ20101055270
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者刘瑞田, 赵敏 申请人:清华大学