专利名称：柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和生物医药领域；更具体地，本发明涉及柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒疫苗。
背景技术：
手足口病是儿童的常见疫病，目前仍无有效的疫苗和治疗药物。柯萨奇病毒 A16(CVA16)和人肠道病毒71(EV71)是手足口病的两个最主要病原，属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属，单链正义RNA病毒，基因组约7400bp (Xu, J.，Y. Qian, S. Wang，J. Μ. Serrano, W. Li, Ζ. Huang, and S. Lu. 2010. EV71 :anemerging infectious disease vaccine target in the Far East Vaccine28 :3516-21 禾口 Zhang, Y. , D.Wang, D. Yan, S. Zhu, J. Liu, H. Wang, S. Zhao, D. Yu, L. Nan, J. An, L. Chen, H. An, A. Xu, and W. Xu. 2010. Molecular evidence of persistentepidemic and evolution of subgenotype Bl coxsackievirus A16_associated hand, foot, and mouth disease in China. J Clin Microbiol 48 619-22)。肠道病毒属基因组编码单股长链多肽，由结构蛋白Pl和非结构蛋白P2、P3组成。病毒蛋白酶将Pl切割为VP0、VPl和VP3，三者组装形成病毒衣壳(Ranganathan， S. , S. Singh, C. L. Poh, and V. Τ. Chow. 2002. The hand, foot and mouth disease virus capsid :sequence analysis and prediction of antigenic sites from homology modelling. ApplBioinformatics 1 :43-52)。其中的一些肠道病毒，如脊髓灰质炎病毒，VPO 蛋白被进一步切割为 VP2 和 VP4 (Kitamura, N.，B. L. Semler, P. G. Rothberg, G. R. Larsen, C. J. Adler, A. J. Dorner, E. A. Emini, R. Hanecak, J. J. Lee, S. van derfferf, C. W. Anderson, and Ε. ffimmer. 1981. Primary structure, gene organizationand polypeptide expression of poliovirus RNA. Nature 291 :547-53)。过去的几年，手足口病在远东地区的很多国家和地区流行，包括中国、香港、日本、 新加坡和台湾。在今年的一月一日到九月三十日期间，中国报道了 1，567，2M例手足口病，其中8 例死亡。EV71被发现与手足口病重症和死亡病例相关联，因此已有的和正在进行的病毒学调查和手足口病疫苗的研发主要集中在EV71。但最近的临床病例研究表明， 中国最近爆发的手足口病与 CVA16 和 EV71 有关(Zhang, Y.，X. J. Tan, H. Y. Wang，D. Μ. Yan, S. L. Zhu, D. Y. Wang, F. Ji, Χ. J. Wang, Y. J. Gao, L. Chen, H. Q. An, D. X. Li, S. W. Wang, A. Q. Xu, Z. J. Wang, and W. B. Xu. 2009. An outbreak of hand,foot, and mouth diseaseassociated with subgenotype C4 of human enterovirus 71 in Shandong, China. JClin Virol 44 262-7 禾口 Zhang, Y. , D. Wang, D. Yan, S. Zhu, J. Liu, H. Wang, S. Zhao, D. Yu, L. Nan, J. An, L. Chen, H. An, A. Xu, and W. Xu. 2010. Molecularevidence of persistent epidemic and evolution of subgenotype Bl coxsackievirusA16-associated hand, foot, and mouth disease in China. J Clin Microbiol48 :619-22)，患者有可能共感染 EV71 和 CVA16，并在体内同时存在这两种病毒，因而导致CVA16和EV71发生重组，导致EV71新亚型D的出现。 CVA16单独感染也可能引起了儿童的死亡。这些研究表明，开发兼抗CVA16和EV71的多价广谱疫苗，才能有效预防和控制手足口病。很多病毒的病毒结构蛋白重组表达后可以自发组装成病毒样颗粒 (virus-likeparticle, VLP)，其结构和抗原性与真病毒没有区别，但缺少病毒核酸，是没有感染性的。病毒样颗粒已经成为开发安全有效的病毒性疾病疫苗的一个有效策略，例如，基于病毒样颗粒的乙型肝炎和人类疱疹病毒疫苗已经获得审批。针对EV71的病毒样颗粒已在昆虫细胞中表达，它能产生中和活性的抗体，从而保护致死剂量病毒攻击的小鼠。然而，目前本领域还没有一种有效的针对柯萨奇病毒的理想疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒疫苗。在本发明的第一方面，提供一种表达载体，其包括至少一个表达盒1 (如1、2或3个)，所述的表达盒1含有柯萨奇病毒A16型病毒 (CVA16)的Pl蛋白的编码序列；和至少一个表达盒2(如1、2或3个)，所述的表达盒2含有柯萨奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的编码序列。在另一优选例中，所述的表达载体是PFastBacTM Dual (pFBD)载体。在本发明的另一方面，提供一种重组杆状病毒，所述杆状病毒的基因组中包括至少一个表达盒(如1、2或3个)，所述的表达盒1含有柯萨奇病毒A16型病毒 (CVA16)的Pl蛋白的编码序列；和至少一个表达盒(如1、2或3个)，所述的表达盒2含有柯萨奇病毒A16型病毒的 3⑶蛋白的编码序列。在另一优选例中，所述的重组杆状病毒用于感染昆虫细胞而获得重组蛋白。在另一优选例中，所述杆状病毒通过以下步骤制备(A)将柯萨奇病毒A16型病毒(CVA16)的Pl蛋白的编码序列和柯萨奇病毒A16型病毒的3⑶蛋白的编码序列克隆入杆粒中，获得重组的杆粒；(B)将(A)获得的重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染后的昆虫细胞；和(C)收获重组的杆状病毒。在另一优选例中，所述的杆粒是Bac-mid杆粒。更优选的，所述的Bacmid来源于大肠杆菌DHlOBac。在另一优选例中，所述的昆虫细胞是sf9昆虫细胞。在本发明的另一方面，提供所述的表达载体或的所述的重组杆状病毒的用途，用于制备病毒样颗粒。在本发明的另一方面，提供一种产生病毒样颗粒的系统，包括(1)所述的重组杆状病毒；和(2)昆虫细胞。在另一优选例中，所述的昆虫细胞是sf9昆虫细胞。在本发明的另一方面，提供一种制备病毒样颗粒的方法，包括(a)将所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞；(b)从昆虫细胞的裂解物中分离获得病毒样颗粒。
在另一优选例中，通过蔗糖密度梯度离心分离病毒样颗粒。在本发明的另一方面，提供一种具有免疫原性的病毒样颗粒，其由所述的方法产生，其平均直径为20-30nm。在本发明的另一方面，提供所述的病毒样颗粒的用途，用于制备预防柯萨奇病毒 A16型病毒感染相关疾病的组合物。在另一优选例中，所述的疾病是手足口病(Hand，foot and mouth disease, HFffl))。在本发明的另一方面，提供一种具有免疫原性的组合物，所述的组合物包含(a)所述的具有免疫原性的病毒样颗粒；和(b)药学上可接受的载体。在本发明的另一方面，提供一种制备预防柯萨奇病毒A16型病毒感染相关疾病的方法，所述方法包括给予需要预防的对象有效量的所述的具有免疫原性的病毒样颗粒，或所述的具有免疫原性的组合物。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、各杆状病毒表达载体Tn7内片段结构示意图。图2、用杆状病毒系统表达CVPl和CV3⑶。Sf9昆虫细胞用重组杆状病毒感染，2 天后收集细胞用抗VPO抗体进行(A)免疫荧光；(B)ELISA ；(C)Western blot 分析。图3、VLP的蔗糖密度梯度离心分析。细胞裂解物被铺在10-50%的蔗糖梯度上进行超速离心后，从上到下收集10个组分进行分析。(A)用抗VPO抗体进行ELISA分析；(B)用抗 VPO 抗体进行 Wfestern blot 分析；(C)用抗 VP3 抗体进行 Wfestern blot 分析；(D)用抗 VPl 抗体进行 Wfestern blot 分析。图4、CVA16病毒样颗粒的电镜分析。图5、免疫小鼠血清中CVA16衣壳亚单位蛋白特异性IgG抗体反应。血清稀释度为 1 100。Y轴数值为450nm的吸光度。图6、免疫小鼠血清对CVA16活病毒的中和效价。Sf9免疫血清在检测最小稀释度 1 32时没有中和作用，因此被赋予一个虚拟中和效价1 16进行计算。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现采用杆状病毒感染昆虫细胞来表达 CVA16的Pl蛋白和CVA16的3⑶蛋白，可获得具有比较好的空间构型且经适当切割的蛋白， 所述蛋白可自动组装为病毒样颗粒，所述病毒样颗粒具有高的免疫原性。在此基础上完成了本发明。杆状病毒本发明提供了一种重组的杆状病毒，其可用于感染昆虫细胞而获得经适当切割的蛋白。所述的杆状病毒的基因组中含有至少一个含有柯萨奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的编码序列的表达盒1 ；和至少一个含有柯萨奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的编码序列的表达盒2。所述的重组的杆状病毒可以稳定传代，零下70°C可以长期保存并具有高的滴度。 利用该病毒感染昆虫细胞后1-2天后可以得到重组蛋白，且表达稳定。作为本发明的优选方式，所述杆状病毒通过以下步骤制备(A)将柯萨奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的编码序列和的柯萨奇病毒A16型病毒的 3⑶蛋白的编码序列克隆入杆粒中，获得重组的杆粒；(B)将㈧获得的重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染后的昆虫细胞；和(C)收获重组的杆状病毒。作为本发明的优选方式，所述的杆粒是Bac-mid杆粒。更优选的，所述的Bac-mid 来源于大肠杆菌DHlOBac。作为本发明的优选方式，所述的昆虫细胞选自sf9昆虫细胞，HighFive昆虫细胞； 最优选的，所述昆虫细胞是sf9昆虫细胞。作为本发明的优选方式，将柯萨奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的编码序列和的柯萨奇病毒A16型病毒的3⑶蛋白的编码序列及其两端重组序列，在转座酶的作用下重组入 Bacmid杆粒的Tn7位点。更优选的，所述的转座酶由大肠杆菌DHlOBac中携带的辅助质粒 (helper)所表达。作为本发明的优选方式，在步骤(A)中，所述重组的杆粒通过以下步骤获得(a)将柯萨奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的编码序列和的柯萨奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的编码序列插入穿梭载体(优选pFASTBac-Dual载体)的多克隆位点中，获得插入了外源编码序列的重组载体；(b)将(a)获得的重组载体转入宿主细胞DHlOBac，获得转化的宿主细胞，所述转化的宿主细胞中含有重组杆粒，所述的重组杆粒携带所述的外源编码序列；和(c)从所述转化的宿主细胞中提取重组杆粒。作为本发明的优选方式，所述的柯萨奇病毒A16型病毒的Pl蛋白具有SEQID NO 1所示的氨基酸序列。所述的柯萨奇病毒A16型病毒的CD3蛋白具有SEQ ID NO :2所示的
氨基酸序列。作为本发明的优选方式，所述的外源蛋白(柯萨奇病毒A16型病毒的Pl蛋白或柯萨奇病毒A16型病毒的CD3蛋白)的编码序列的两端还含有多克隆位点的编码序列。作为本发明的优选方式，所述的杆状病毒是通过将外源基因柯萨奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的编码基因和柯萨奇病毒A16型病毒的CD3蛋白的编码基因克隆进入 PFASTBac的多克隆位点内，然后将pFASTBAC转化DHlOBac基因工程菌，在转座酶的作用下发生重组，获得杆粒后转染昆虫细胞获得的。将这种病毒感染昆虫细胞后数小时，病毒即可进入昆虫细胞，开始复制病毒，并且转录病毒重组区域中蛋白翻译区的外源核酸序列，在该段序列中含有所述外源的核酸序列。感染约1-2天后表达具有病毒重组区域中蛋白翻译区所对应的氨基酸序列的蛋白。此外，在所述的杆状病毒感染昆虫细胞并表达外源蛋白后，还可以通过例如密度梯度离心等方法从培养物中回收重组杆状病毒，用于下次感染。具有免疫原性的病毒样颗粒本发明人提供了一种制备病毒样颗粒的方法，该方法包括步骤(1)将所述的杆状病毒感染昆虫细胞，培养感染后的昆虫细胞，使之表达所述的外源蛋白(2)从昆虫细胞的裂解物中分离获得病毒样颗粒。作为本发明的优选方式，所述的昆虫细胞选自sf9昆虫细胞，HighFive昆虫细胞；最优选的，所述昆虫细胞是sf9昆虫细胞。本发明还提供一种具有免疫原性的病毒样颗粒，其基本上由上述方法制备获得。机体免疫系统的MHC I型和MHC II型对以颗粒状形式存在的外源性抗原的提呈较对可溶性单体抗原的提呈要强1000或10000倍，即以颗粒状形式存在的抗原比可溶性单体抗原具有更强的免疫原性，机体免疫系统的MHC I型和MHC II途径对以颗粒状形式存在的外源性抗原的提呈较对可溶性单体抗原的提呈要强1000或10000倍，即以颗粒状形式存在的抗原比可溶性单体抗原具有更强的免疫原性。本发明获得的病毒样颗粒的平均直径 (粒径)为 20-30nm。本发明还提供所述的具有免疫原性的病毒样颗粒的用途，用于制备预防人柯萨奇病毒A16型病毒感染相关疾病的组合物。所述的疾病例如是手足口病。组合物本发明还提供一种具有免疫原性的组合物(预防性或治疗性疫苗)，所述的组合物包含有效量的本发明所述的具有免疫原性的病毒样颗粒，和药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington’ s PharmaceuticalSciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)中可找至Ij 关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、 盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂；较佳地为注射剂。动物实验表明，利用本发明的具有免疫原性的病毒样颗粒制成的疫苗免疫动物后，可在动物体内产生高效价的抗体。在使用时，是将安全有效量的本发明所述的具有免疫原性的病毒样颗粒施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。 当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于本发明首次制备了 CVA16的重组病毒样颗粒(CVA16-LP)，免疫小鼠后获得了高中和活性的抗体，表明CVA16-LP是预防柯萨奇病毒的理想疫苗。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。材料细胞和病毒RD (人横纹肌肉瘤细胞，购自ATCC)细胞含10 % FBS、100unit/mL青霉素和 100ug/mL链霉素的DMEM培养基37°C，5% CO2培养。病毒CVA16 shzh05-l(基因组序列参见GenBank登录号EU262658)(参见Wu， Ζ. , Y. Gao, L. Sun, P. Tien, and Q. Jin. 2008. Quick identification of effectivesmall interfering RNAs that inhibit the replication of coxsackievirus A16. AntiviralRes 80 :295-301. Yang, F. ， Q. Jin, Y. He, L. Li, and Y. Hou. 2001. The completegenome of Enterovirus 71 China strain. Sci China C Life Sci 44 :178-83) 在RD细胞中增殖；微量滴定法测定CVA16病毒滴度，根据Reed-Muench方法测定半数组织 ^ (TCID50) (Reed, L. J. Μ. ， H. 1938. A simple method ofestimating 50 percent endpoints. Am J Hyg 27 :493-499)。采用SF90 Oil SFM 培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)于 27°C培养昆虫细胞 Sf9。抗体抗EV71的鼠单克隆抗体MAB979(与CVA16有交叉反应)购于 Millipore (Billerica, MA, USA)；豚鼠的抗VP0、VPl或VP3的抗血清通过用大肠杆菌表达 (常规方法表达)的重组VP0、VPl或VP3免疫(常规免疫方法)豚鼠三次制备得到。制备重组杆状病毒CVA16 shzh05-l 感染 RD 细胞，Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)法提取病毒 RNA，oligo(dT)为引物，M-MLV(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)反转录酶进行反转录， 以获得的第一链cDNA为模板扩增编码CVA16的Pl蛋白和3CD蛋白的基因片段，分别命名为 CV Pl和 CV 3CD。采用5，-CACTCTAGAATGGGGTCACAAGTCTCC-3，(SEQID NO 3)为上游引物，5，-CCA AAGCTTTTACAATCTTGTTATCTTGTC-3，(SEQ ID NO 4)为下游引物，扩增 CV Pl ；Xba I 和 Hind III双酶切后，亚克隆到同样酶切处理的pFBD(piiastBacTM Dual的缩写(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA))，构建 pFBD-CVPl。以 5，-TCACCATGGGACCGAGCTTAGACTT-3，(SEQ ID NO :5)为上游引物，5，-CACATGCATCTAAAATAATTCGAGCCA-3，(SEQ ID NO :6)为下游引物，扩增 CV 3CD ；Nco I 禾Π Nsi I 双酶切后，亚克隆到同样酶切处理的PFBD，构建pFBD-CV3⑶。Xba I和Hind III双酶切pFBD-CVPl获得CVP1，亚克隆到同样酶切的pFBD_CV3CD， 构建 PFBD-CVP1/CV3CD。上述三个质粒通过Bac-t0-Bac 系统 Qnvitrogen, Carlsbad, CA, USA)制备相应的杆状病毒，分别命名为Bac-CVPl、Bac-CV3CD和Bac_CVPl/3CD。按照hvitrogen说明书将重组质粒转化DHlOBac E. coli，鉴定重组质粒Bac-mid，Bac-mid转染Sf9细胞，筛选扩增重组杆状病毒。按^witrogen说明书指定的MOI用重组杆状病毒感染Sf9细胞，表达目的蛋白。感染后48h收集感染的细胞和上清，准备做生化分析和电镜试验。免疫荧光试验重组病毒感染Sf9细胞4 后，PBS洗细胞两次，4% (w/v)多聚甲醛室温固定细胞20min，PBS洗三次，(v/v)NP40作用室温lOmin，PBS洗三次，10% (ν/ν)正常羊血清 (NGS) 37 °C 作用 30min，PBS 洗三次，豚鼠抗 CVVPO (1 100) 37°C 作用 30min，PBS 洗三次， FITC标记的羊抗豚鼠(1 500) 37°C作用30min，PBS洗三次，DAPI室温染核5min，PBS洗五次，50% (ν/ν)甘油封片，荧光显微镜观察。ELISA 禾口 Western blot收集杆状病毒感染的细胞，预冷的PBS缓冲液重悬细胞，FastprepFP120(Biol01, Vista, CA, USA)破碎细胞，12000rpm 4°C离心15min，收集上清。以牛血清白蛋白为标准蛋白，Bradford蛋白分析试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)测定上清中可溶性总蛋白的浓度。直接ELSA检测，PBS为包被液，细胞裂解物离心后上清50uL/孔，37°C包被96孔 ELISA板 2h，PBST (含 0.05% (ν/ν)吐温-20 的 1XPBS)漂洗 3 次，5% (w/v)脱脂奶粉 37°C 封闭lh，PBST漂洗3次，一抗为1 2000豚鼠抗CVVPO (大肠杆菌表达的重组CVA16 VPO 免疫豚鼠三次后的抗血清)37°C作用》!，PBST漂洗3次，二抗为1 5000 HRP标记的羊抗豚鼠IgG(sigma)37°C作用lh，PBST漂洗5次，四甲基联苯胺(TMB)-过氧化氢系统为底物显色，IM H3PO4中止，酶标仪450nm检测，同时设阴性对照和空白对照。Western bloting检测，制备样品先进行12%凝胶SDS-PAGE电泳，然后转印PVDF 膜，5% (w/v)脱脂奶粉室温封闭2h，PBST (0. 05% (ν/ν)的吐温20)漂洗3次，1 1000 稀释的一抗(豚鼠的抗VP0、VP1或VP3的抗血清，通过用大肠杆菌表达的重组VP0、VPl或 VP3免疫豚鼠三次制备得到)室温孵育2h，PBST漂洗3次，HRP标记的相应二抗(羊抗豚鼠IgG)室温孵育lh，PBST漂洗5次，加适当量的BeyoECL发光试剂LAS-4000冷光分析仪 (Fujifilm Life Science)显影。蔗糖密度梯度及部分纯化VLP感染细胞裂解物12000rpm 4°C离心15min，收集上清加到10%-50%的蔗糖梯度上层，Beckman离心机39000rpm 4°C离心3h，收集10个蔗糖梯度(0. 4mL/梯度)，做ELISA 和Wfestern blot检测分析。依据ELISA和^festern blot结果，收集CV VPO富集的梯度，Centrifugal Filter Units (Millipore, UFC800396, USA)浓缩蛋白样品，据已建立的 Western blot方法定量收集的病毒样颗粒，准备免疫动物。电镜分析
0. 5% (w/v)水溶性乙酸双氧铀负染上述部分纯化的病毒样颗粒，飞利浦CM-12S 扫描电镜分析。小鼠免疫程序和抗体效价检测将抗原蛋白和铝佐剂(Pierce，Rockford, IL)按照铝佐剂自带操作说明书进行混合，腹腔免疫6只雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)，Iug/只病毒样颗粒(据VPO定量)，同样处理空白细胞Sf9，设立阴性对照组。第3和6周分别进行第二和三次免疫，每次免疫前采血，第八周小鼠眼球采血，收集血清，_80°C分装保存。原核表达的CVA16的VP0、VP1和VP3各IOOng/孔包板，按照已建立的ELISA方法 (6)测定血清中特异的IgG，以大于相应阴性孔(免疫前血清)0. 1个OD值的检测孔为阴阳性判定，其血清稀释倍数的倒数即为血清ELISA效价。中和试验通过在RD细胞上进行TCID5tl减数试验分析血清的中和滴度，简述如下RD细胞接种96孔板，1 X IO4/孔细胞，过夜培养到细胞达70%汇合度时，进行中和试验。2% (v/v)FBS 的DMEM梯度稀释血清样品，CVA16病毒稀释到2TCID5(1/uL，50uL稀释的血清样品和50uL稀释的CVA16病毒(IOOTCID5ci)混合37°C孵育lh，血清病毒混合物加到长有RD细胞的孔内 37°C培养3d，能减少50%细胞病变(CPE)的血清稀释度为该血清的中和滴度。
实施例实施例1、杆状病毒的构建CVA16/shzh05的编码Pl和3⑶的基因片段通过反转录第一链cDNA后由PCR扩增合成，然后克隆到PFBD载体，分别命名为pFBD-CVP 1和pFBD_CV3CD。CVP1基因通过 pFBD-CVPl中的polyhedrin启动子调控，CV3CD基因则由pFBD_CV3CD内的plO启动子直接调控。同时装载了两个基因的PFBD-CVP1/3⑶(图1)也成功构建，其可以在同种细胞里共同有效表达两种蛋白。上述三种结构再随后构建到相应的杆状病毒，分别命名为Bac-CVPl，Bac_3⑶， Bac-CVP1/3CDο实施例2、在昆虫细胞内表达CVA16VLPs用Bac-CVPl，Bac_3CD，Bac_CVPl/3CD 分别感染 Sf9 昆虫细胞。首先用抗-CVA16VP0 的多抗通过免疫荧光方法来检测感染昆虫细胞中目的蛋白表达。结果如图2A所示， Bac-CVPl和Bac-CVPl/3⑶有明亮绿色荧光；空白组和Bac_3⑶感染组并未检测到荧光信号。Bac-CVPl在昆虫细胞的表达同时通过ELISA实验也得到证实抗CVA16 VPO的抗体检测到Bac-CVPl和Bac-CVPl/3⑶的细胞裂解的表达，而空白组和Bac_3⑶感染组并未检测到信号(图2B)。其次，抗VPO抗体Wfestern blot分析了 Pl被3CD的剪切过程。如图2C所示，空白组和Bac-3⑶感染组未检测到条带，而Bac-CVPl的裂解物有一分子量约为60KDa的条带， Bac-CVPl/3CD有两条分别为39KDa和^KDa的条带，这些条带与预期的VPO和VP2被正确切割所产生的目的条带大小一致。同样的条带形式与在野生型CVA16上已发现的一致。总之，这些结果证明，在Bac-CVPl/3⑶感染的细胞中Pl蛋白可以有效产生并被正确切割。Bac-CVPl/3⑶用于下一步的研究。
ELISA*WfeStern blot分析Bac-CVPl/3CD感染细胞后病毒样颗粒的构成，蔗糖密度梯度离心分离细胞裂解物，ELISA检测不同蔗糖梯度CVA16的特异蛋白。抗CVVPO多克隆抗体检测到目的蛋白主要存在梯度6#(图3A)，证明病毒样颗粒的存在。分别利用CVA16 的三个多克隆抗体抗CVVP0、抗CVVPl和抗CVVP3 Western bloting进一步分析不同的蔗糖梯度发现组分#6均出现针对这三个抗体的强烈信号，与ELISA结果相一致(图3B、3C和 3D)。更重要的是目的条带的分子量和已报道的野生毒株亚结构蛋白分子量一致，即VPO大小为39KDa，VP2为^KDa，VPl为33KDa，VP3为^KDa。结果表明，病毒样颗粒是由正确切割修饰的衣壳亚结构蛋白形成。为直接确定病毒样颗粒的形成，梯度6#样品负染后，电镜观察分析，结果观察到直径约25nm的病毒样颗粒(图4)。实施例3、CVA16病毒样颗粒在小鼠中的免疫原性动物实验评价CVA16病毒样颗粒的免疫原性，于第0、3和6周用粗提纯的病毒样颗粒腹腔注射Iug/只小鼠，铝佐剂为佐剂，同样处理的未感染的Sf9细胞作为对照。最后一次免疫后两周收集小鼠血清，用重组抗原包被ELISA检测特异的抗体，结果表明VLP免疫组血清可以和重组的亚单位外壳蛋白反应，而对照Sf9血清不反应(图5)。实施例4、VLP免疫血清的中和活性中和试验评估VLP免疫血清的中和活性，两倍梯度稀释的血清与100TCID50的 CVA16病毒混合，加入RD细胞，据能引起减少50%细胞病变(CPE)的血清稀释度判定血清的中和滴度。结果表明，Sf9细胞裂解物免疫小鼠获得的血清在检测的最低稀释度(1 32)没有中和活性，而病毒样颗粒免疫小鼠血清的中和效价高达1 4096(图6)。这一结果表明， 重组的CVA16病毒样颗粒能引起机体产生较高中和活性的抗体，因而可以作为防治CVA16 的疫苗。讨论世界范围内，柯萨奇病毒(CVA16)和肠道病毒71(EV71)病毒是手足口病的最主要病原。最近的研究发现，CVA16和EV71病毒发生共感染和重组，这可能是过去几年中国大陆手足口病大规模爆发的主要原因。因此，CVA16和EV71病毒都应该是手足口病疫苗研究的靶点，从而广泛有效地防治手足口病。本发明首次报道了 CVA16病毒样颗粒的制备及其诱导高效价中和抗体的能力。利用重组的杆状病毒在昆虫细胞共表达Pl和3CD制备CVA16的病毒样颗粒，生化试验和电镜分析发现CVA16病毒样颗粒为约25nm的球形结构，主要由病毒的衣壳蛋白VP0、VP1、VP3和少量的VP2亚结构蛋白组成。CVA16病毒样颗粒免疫小鼠后制备的抗血清与衣壳亚单位蛋白有特异的反应，更有意义的是，该血清能在体外有效地中和CVA16活病毒，中和效价高达 1 4096。本发明说明CVA16病毒样颗粒诱导产生的抗体对CVA16有强有效的保护作用， 因此CVA16病毒样颗粒可作为预防CVA16引起的手足口病的疫苗。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种表达载体，其包括表达盒1，所述的表达盒1含有柯萨奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的编码序列；和表达盒2，所述的表达盒2含有柯萨奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的编码序列。
2.一种重组杆状病毒，所述杆状病毒的基因组中包括表达盒1，所述的表达盒1含有柯萨奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的编码序列；和表达盒2，所述的表达盒2含有柯萨奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的编码序列。
3.权利要求1所述的表达载体或的权利要求3所述的重组杆状病毒的用途，用于制备病毒样颗粒。
4.一种产生病毒样颗粒的系统，包括(1)权利要求2所述的重组杆状病毒；和(2)昆虫细胞。
5.如权利要求4所述的系统，其特征在于，所述的昆虫细胞是sf9昆虫细胞。
6.一种制备病毒样颗粒的方法，包括(a)将权利要求2所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞；(b)从昆虫细胞的裂解物中分离获得病毒样颗粒。
7.一种具有免疫原性的病毒样颗粒，其由权利要求6所述的方法产生，其平均直径为 20-30nm。
8.权利要求7所述的病毒样颗粒的用途，用于制备预防柯萨奇病毒A16型病毒感染相关疾病的组合物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的疾病是手足口病。
10.一种具有免疫原性的组合物，其特征在于，所述的组合物包含(a)权利要求8所述的具有免疫原性的病毒样颗粒；和(b)药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒疫苗。意外地发现采用杆状病毒感染昆虫细胞来表达CVA16的P1蛋白和CVA16的3CD蛋白，可获得具有比较好的空间构型且经适当切割的蛋白，所述蛋白可自动组装为病毒样颗粒，所述病毒样颗粒具有高的免疫原性。
文档编号A61K39/125GK102465144SQ201010553419
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者刘庆伟, 蔡一村, 黄忠 申请人:中国科学院上海巴斯德研究所