专利名称：一种在玻片上检测基因突变的方法
技术领域：
本发明涉及固相DNA序列突变检测，更具体涉及一种检测耐药性结核杆菌中耐药性相关基因点突变的方法。
目前应用于玻片中检测点突变的方法常见的有芯片微测序和高密度寡核苷酸测序芯片。芯片微测序方法是利用荧光素标记的双脱氧核苷酸进行固相引物延伸，测定基因突变热点区的序列，可以准确地定位突变。但本方法需要合成大量引物，导致成本高而且所测的序列非常有限，一般难以超过100个碱基。以高密度寡核苷酸测序芯片来检测基因点突变是在芯片上原位合成4倍于待测基因碱基数的8(或9)聚体寡核苷酸，以荧光标记的待测基因为模板进行芯片杂交，在与野生型基因的杂交信号进行比较后确定突变。寡核苷酸测序芯片检测突变的准确性无法达到100％，需要原位合成大量的寡核苷酸片段，杂交模板必须标记荧光素，并且芯片密度高，杂交信号的收集与数据的分析处理难度大，因此从开始芯片的制作到最后信息的处理必需成套设备和相应的软件，成本昂贵。芯片毛细管电泳是利用DNA双链分子形态变化会导致电泳迁移的改变，通过灵敏度高的毛细管电泳可以将突变的DNA双链区分开来。但是该方法对仪器要求很高，许多实验室尚无能力使用该方法，应用就显得更为困难。
本发明的目的是提供了一种在玻片上检测基因突变的方法，将化学法和酶学切割方法结合起来，以酶学检测或荧光检测手段准确，简便易行地检测固定在玻片上的DNA序列的点突变。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施固相载体上的DNA序列的突变的检测方法是将杂交所得异源双链DNA固定在载体上，然后利用化学试剂对双链DNA和单链DNA具不同的化学活性，即化学试剂能够特异的修饰未配对和错配的嘧啶类碱基羟胺盐酸修饰错配碱基中的胞嘧啶，高锰酸钾和氯化四乙胺混合液或四氧化锇溶液修饰错配碱基中的胸腺嘧啶。派啶能够特异的识别被修饰的嘧啶类碱基并在该碱基3′端的磷酯键上进行切割造成一个切口，由于切口的一侧存在错配碱基，因此并非严格意义上的切口而更类似于一个缺口。用S1核酸酶在一定的温度和离子浓度下可以将切口所对应的单链部分切开。由于产生完全切割，引入的荧光或生物素标记分子可能被完全洗脱。通过荧光或酶学手段检测标记分子的信号就可以判断待检的DNA序列是否存在点突变。
在玻片上检测结核杆菌耐药性相关基因点突变的方法是将确定好的结核杆菌标准株(H37Rv)中耐药性相关基因的一条DNA链用巯基衍生物固定在玻片上，然后与突变株中获得的5′端连有荧光或生物素标记分子的相对应的耐药性相关基因进行杂交，其特征在于将杂交生成的完整的异源DNA双链固定在玻片或其他固相载体上，异源DNA双链中一条链的5′端与巯基硅烷化的玻片或表面连有链霉亲和素的固相载体相交联，另一条链的5′端携带生物素或荧光标记分子；用羟胺溶液修饰错配碱基中的胞嘧啶，用高锰酸钾和氯化四乙胺混合液或四氧化锇溶液修饰错配碱基中的胸腺嘧啶，用哌啶剪切点突变中的被修饰嘧啶类碱基，加入2到5个单位的S1核酸酶消化处理异源DNA双链中出现的单链部分；酶学或荧光检测连入的标记，确定是否存在突变。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果，本发明不仅能够在玻片上准确并灵敏快速的检测结核杆菌耐药性相关基因中存在的点突变，而且还能够检测插入、缺失等其他突变，并且检测DNA序列长度范围大，成本低廉，操作简便，适合于玻片和经共价修饰的固相载体上的突变检测。
实施例采用羟胺和高锰酸钾或四氧化锇分别修饰固定在玻片上的异源双链DNA碱基错配中的胞嘧啶或胸腺嘧啶，再用哌啶切割异源双链DNA中被修饰的碱基，然后利用S1核酸酶将异源双链DNA彻底打断。通过检测标记信号的有无来表明该异源双链DNA是否存在单碱基的错配，确定该段基因或DNA序列是否存在点突变。在玻片上检测结核杆菌耐药性相关基因上突变的具体步骤如下1、荧光素或生物素标记待检测的基因序列将6′端带有巯基的两种引物分别扩增结核杆菌标准菌株中的基因片段；用5′端带有生物素标记或带有荧光的引物圹增耐药性菌株的相关基因片段。由于两对引物序列完全一致，扩增的两段基因片段除了点突变位点外顺序完全一致。用柱式PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。
2、异源DNA双链的获得纯化所得两种PCR产物在退火缓冲液中95℃变性5分钟，缓慢退火至25℃，无水乙醇沉降并回收退火所得的双链DNA。
3、异源DNA双链在玻片上的固定将纯化好的双链DNA固定在经过硅烷化的玻片上，加入1-2μl的大肠杆菌碱性磷酸酶使其结合在异源DNA双链上，加入3-5μl的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸和硝基四氮唑蓝混合液，37℃反应30-60分钟，通过底物显色反应或用荧光检测仪检测异源双链DNA上连入的荧光分子，确证耐药性相关基因形成的异源DNA双链是否固定成功。
4、羟胺盐酸盐对固定的异源DNA双链中错配的嘧啶碱基的修饰在固定异源DNA双链的玻片上加入20μl的2-4mM羟胺盐酸盐溶液PH6．0，37℃保温2小时，用终止缓冲液终止该反应，缓冲液由以下试剂构成，1-3M乙酸钠，0．05-0．3mM乙二胺四乙酸钠盐，15-30mg／ml的tRNA。用去离子水或双蒸水清洗该玻片，无菌条件下自然风干。
5、高锰酸钾、氯化四乙胺混合液或四氧化锇溶液对异源DNA双链错配的嘧啶碱基的修饰在羟胺盐酸盐处理过的玻片上加入20μl左右的1-3mM高锰酸钾、20-30mM氯化四乙胺混合溶液或者是15μl，4-5％的四氧化锇溶液，25℃保温1小时，用去离子水或双蒸水清洗玻片，无菌风干。
6、哌啶和S1核酸酶作用并切割异源DNA双链在风干的玻片上加入20-50μl，1-2M哌啶，90℃保温30分钟，用双蒸水或去离子水清洗，风干。加入20μl含有2-5个单位的S1核酸酶，23℃保温15分钟。
7、信号标记的检测清洗玻片，加入1-2μl的大肠杆菌碱性磷酸酶和3-5μl的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸和硝基四氮唑蓝混合液，37℃反应30-60分钟，底物混合液呈蓝紫色，说明待测基因中无点突变，底物混合液呈淡黄色说明待测基因中有突变，或者用荧光检测仪直接检测荧光的强度变化来说明待测基因是否存在突变，荧光强度不变则说明待测基因中无点突变，荧光强度减弱则说明待测基因中存在突变。
权利要求
1.一种在玻片上检测基因点突变的方法，包括下列步骤A、生物素标记检测的基因序列，将5′端带有巯基的引物分别扩增结核杆菌标准菌株中的基因片段，用5′端带有生物素标记的引物扩增突变型耐药性菌株的基因片段；B、异源DNA双链的获得，将纯化所得两种PCR产物在退火缓冲液中95℃变性，退火至25℃，无水乙醇沉降并回收；C、异源DNA双链在玻片上的固定，将纯化的双链DNA固定在经过硅烷化的玻片上，加入1-2μl的大肠杆菌碱性磷酸酶使其结合在异源DNA双链上，加入3-5μl的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸和硝基四氮唑蓝混合液，37℃反应30-60分钟；D、羟胺盐酸对固定的异源DNA双链中错配的嘧啶碱基的修饰，在固定异源DNA双链的玻片上加入20μl的2-4mM羟胺盐酸盐溶液PH6．0，37℃保温2小时，用终止缓冲液终止反应，用双蒸水清洗玻片，风干；E、高锰酸钾、氯化四乙胺混合液对异源DNA双链错配的嘧啶碱基修饰，在羟胺盐酸处理过的玻片上加入20μl的1-3mM高锰酸钾，20-30mM氯化四乙胺混合溶液，25℃保温1小时，用双蒸水清洗玻片，风干；F、用哌啶和S1核酸酶切割异源DNA双链，在风干的玻片上加入20-50μl，1-2M哌啶，90℃保温，用双蒸水清洗，风干，加入20μl含有2-5个单位的S1核酸酶，23℃保温；G、信号标记检测，清洗玻片，加入1-2μl的大肠杆菌碱性磷酸酶和3-5μl的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸和硝基四氮唑蓝底物混合液，37℃反应30-60分钟。
全文摘要
本发明公开了一种在玻片上检测基因突变的方法,其特征在于将杂交生成的完整异源DNA双链固定在玻片上,异源DNA双链中一条链的5′端与巯基硅烷化的玻片相交联,双链的5′端携带生物素,用羟胺溶液修饰错配碱基中的胞嘧啶,用高锰酸钾和氯化四乙胺混合液修饰错配碱基中的胞嘧啶,用哌啶剪切点突变中的被修饰嘧啶类碱基,加入2到5个单位的S1酸酶消化处理异源DNA双链,连人大肠杆菌碱性磷酸酶进行突变检测。本发明不仅能够在玻片上准确、灵敏、快速的检测结核杆菌耐药性基因点突变,而且检测DNA序列长度范围大,成本低廉,操作简便。
文档编号C12Q1/68GK1293255SQ0011609
公开日2001年5月2日 申请日期2000年10月25日 优先权日2000年10月25日
发明者张先恩, 文继开, 邓教宇, 刘虹, 张治平 申请人:中国科学院武汉病毒研究所