专利名称：：Pcr筛选方法PCR篩选方法
技术领域：
：本发明涉及新颖的筛选点突变的方法。具体地，其涉及允许甚至在有其它突变存在下快速且明确地检测这样的突变的筛选点突变的方法。基因编码区中的单个核吝酸变化(点突变)可以在生物上具有深远的生化和生理后果。具有引人注目的后杲的这种变化的众所周知的实例是造成镰状细胞病的突变。还已经将许多其它点突变与健康问题相关联，所述健康问题范围从糖尿病到心力衰竭，包括例如，参与遗传性癌、家族性肥厚型心肌病和肌营养不良的那些突变。在农用化学品领域，已经表明杀虫剂靶酶中的几个点突变赋予对大部分杀虫剂类别的抗性。例如，已知靶位点突变赋予对主要杀真菌剂和杀虫剂类(分别例如嗜球果伞素和拟除虫菊酯)以及大多数除草剂类(包括三。秦、草甘膦、ACCase和ALS抑制剂)的抗性。在许多情况下，已经鉴别出准确的抗性突变。例如，在鼠尾看麦娘(blackglass)(大稳看麦娘(J/o/ecwn^myon^o/ifes))中已经表明，乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)基因(ACCase抑制剂的靶酶，一组控制单子叶杂草、对双子叶植物没有作用的除草剂)的羧基转移酶结合域内的单个点突变(Ilel781Leu)赋予对环己二酮(DIM)和芳氧基丙酸盐(FOP)除草剂的广谱抗性(Delye爭乂2002a)。已经在其它杂草物种中发现同源突变黑麦草(瑞士黑麦草(Z^/&Wng^wm);Delye爭乂2002b);野生燕麦(野燕麦(爿ve船/aa^);Christoffers爭乂2002)和狗尾草(狗尾草(;Delye爭乂2002c)。Uel781Leu突变是由于腺噪呤5341被置换为胸腺嗜啶或Ile2041Asn/Val/Thr突变赋予对FOP的抗性和一些对DIM的抗性，且其原因是在位置6122的胸腺嘧啶被置换为腺噪呤或胞嘧咬(Ue2041Asn/Thr)或在位置6121的腺噤呤被置换为鸟噪呤(Ile2041Val)。(注为在氨基酸2041处的突变给出的氨基酸和核苷酸位置是来自大穗看麦娘的；在其它物种中发现了对应的突变)。另一个突变(Asp208Gly)赋予对FOP和DIM的抗性。关于除草剂草甘膦(可能是目前使用的最重要的非选择性除草剂)，靶是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因。已经在4个物种(瑞士黑麦草、多花黑麦草(丄o/zwwwz^z;/7onw2)、小白酒草(Co"z少ac朋a6fe腦、)和牛筋草(57e諸力ezW/ca))中证实了抗性,且怀疑所述抗性存在于几个其它的物种中(包括苋属(/4maraW/z^)和藜属(C/ze"o/oWwm)物种)。在有些这样的情况下，抗性是由于EPSPS基因中的Prol06Thr/Ser突变。使用农用化学品领域作为实例，注意到存在几种用于检测点突变和它们的互补体的方法，且在有些情况下，可以替代费力且费时的抗性生物测定。根据它们应用于单个个体还是群体，检测方法可以分成2大类。例如，单植物测定包括PASA测定(特定等位基因的PCR扩增)、SSCP测定(单链构型多态性)、CAPS测定(分裂多态序列标记)和dCAPS测定(衍生的分裂多态序列标记)，同时，基于群体的、定量PCR(Q-PCR)方法经常基于等位基因特异性的杂交或等位基因特异性的扩增测定。但是，现有的定性和定量方法的一个共同特征是，可靠性依赖于在目标点突变周围的其它核苷酸的保守。具体地，在植物中，已知抗性倾向的物种倾向于在形态学和生理学水平非常不同，且这反映了在DNA水平的变异性因此使用现有技术准确检测目标点突变是非常困难的。例如，未知的多态性可能通过阻止引物的杂交干扰PCR反应的引发，另外，在例如其中在PCR反应之后需要限制酶消化的CAPS和dCAPS方法中，在目标突变附近的其它突变的存在可能破坏限制酶识别。在两种情况下，可能得到不准确的结果(例如抗性的假阴性或阳性指示)。当然，当在目标点突变位点附近存在多态性时，在测定人或动物中造成疾病的突变时，也可能发生相同的问题。例如，使用上述ACCase基因中位置2041处的突变的情况，不仅存在2个在位置6122处的突变和在位置6121处的另一个突变造成抗性表型，而且在核苷酸水平在目标突变上游5个碱基处(N-5)(对抗性造成轻微影响)和在目标突变下游1个碱基和4个碱基处(N+1和N+4;都是沉默突变)的其它突变使情况复杂化，且导致在没有测试的每个样品的详细序列信息存在的情况下解释上述筛选测定的结果的困难。在EPSPS基因的情况下发生类似的复杂情形，其中，在位置N-l和N+2处向Prol06Thr/Ser突变位点的核苷酸变化阻止跨物种或甚至物种内的可靠的PASA和CAPS测定开发。因此，需要开发不受目标点突变周围的DNA序列变异性的影响的方法。目标点突变可以是，例如，赋予对杀虫剂例如除草剂的抗性的点突变或造成导致疾病的生物(具体地，人或动物)的生化或生理变化的点突变。因此，本发明提供了用于检测目标基因中的点突变的方法，其包含a)使用一对能扩增在突变周围和包含突变的区域的引物，在从目标基因得到的DNA提取物上进行PCR反应；b)用至少一种限制酶消化步骤(a)的PCR产物，所述限制酶区分野生型^^j^^^r^^序刮，汰#^限^切消化；c)分析步骤(b)的消化的PCR产物，以鉴别那些指示突变存在的DNA提取物；其特征在于，PCR引物的3'末端被3个或更少的核苷酸隔开，其中的一个包含所述突变。本发明的方法(为了方便称作LP-(d)PACS:长引物(衍生的)多态的扩增的且切割的序列)允许甚至在目标点突变附近存在其它点突变/多态性的情况下检测基因内的点突变。本发明的方法也适用于将许多点突变彼此区分开和将所述点突变与野生型序列区分开(如下面讨论的)，且也允许区分二倍体生物的纯合和杂合个体。在有其它点突变存在下一个或多个目标点突变的检测，借助于2个PCR引物的3'末端之间的小分隔距离来实现除了在引物末端之间的3个或更少的核苦酸以外，侧接目标点突变的所有核普酸都被引物固定。因而，克服了造成异常引发或破坏在消化步骤中使用的限制酶的识别位点的已知或未知的点突变/多态性的问题，且不得到不准确的(例如假阴性的和/或阳性的)结果。当然，PCR引物之间的间隔可以进一步减少至2或1个核苷酸，具体地，如果已知在目标突变的甚至更靠近的近处存在突变的话。但是，注意到，具有3个核苦酸的间隔的优点是，可以将引物设计成区分影响氨基酸密码子的3个核苷酸中的任一个的突变，这可以具有相同的表型效应。当然，通过使用他关于目标物种的核苷酸序列保守的知识结合他关于一个或多个目标突变的知识，技术人员能在任意给定情况下确定适当分隔距离。当然，在有6些情况下，其中已知在目标点突变的紧密周围不存在多态性，可能增加本文所述本发明的方法的引物之间的间隔至4、5或甚至6个核苷酸。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中引物的3，末端被3个核普酸隔开。在另一个实施方案中，引物被2个核苷酸隔开，且在另一个实施方案中，引物被l个核苷酸隔开。注意到，用于本发明方法的PCR引物倾向于比在一般PCR反应中使用的那些更长。这是因为，引物需要足够长，以便在限制酶切消化后，PCR片段可以通过技术人员使用的分析方法区分开。当然，在一般的PCR反应中，PCR产物的大部分由扩增的DNA组成，引物仅占总长度的小部分。但是，在本方法中，因为引物通常仅间隔最多3个核苷酸，所以PCR产物的大部分由引物本身组成。如果用于分析消化的PCR片段的方法是在一般的琼脂糖凝胶上运行的，那么引物需要足够长，从而使得限制酶切消化的产物可以在凝胶上看到和区分。在实践中，这意味着2个引物的总长度必须是约100个碱基。当然，技术人员将明白，存在其它分析通过本发明方法生成的DNA片段的方法(这种其它方法包括、但不限于，MALDI-TOFMS(基质辅助激光解吸电离-飞行时间质i普分析法)和焦磷酸测序(pyros叫uencing)方法，它们二者都是技术人员已知的)，且能设计用于这种方法中的适当长度的引物。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中PCR引物对中的至少一个的长度是至少30个核苷酸。在另一个实施方案中，PCR引物对中的至少一个的长度是至少50个核苷酸。在另一个实施方案中，PCR引物对中的至少一个的长度是至少80个核苷酸。在另一个实施方案中，PCR引物对中的至少一个的长度是至少100个核苷酸。在另一个实施方案中，PCR引物对中的至少一个的长度是至少120个核苷酸。在另一个实施方案中，PCR引物对中的至少一个的长度是至少150个核苷酸。正如PCR产物的长度受PCR引物长度的控制一样，限制酶切消化生产的片段的大小也是如此限制位点将必然包括2个引物之间的突变位点，且因而，在限制酶切后，生产的片段的大小将基本上等于引物的长度。因此，必须使引物长度比为这样的，以便可能通过使用的分析方法将未消化的PCR产物与消化产物区分开。例如，在琼脂糖凝胶上，135bp未切割产物和100bp片段之间的差异是明显的(当然，剩余的35bp片段的显现不是必需的)，且实际上，依赖于使用的条件，更小的大小差异也是可分辨的。因此，在本发明的一个实施方案中，PCR引物对之一比另一个小至少10bp。在另一个实施方案中，PCR引物对之一比另一个小至少15bp。在另一个实施方案中，PCR引物对之一比另一个小至少20bp。在另一个实施方案中，PCR引物对之一比另一个小至少25bp。在另一个实施方案中，PCR引物对之一比另一个小至少30bp。在另一个实施方案中，PCR引物对之一比另一个小至少35bp。在另一个实施方案中，PCR引物对之一比另一个小至少40bp。为了进行本发明方法所需的可辨别的限制酶切消化，限制位点必须存在于野生型序列或突变型序列的PCR产物中，但是不存在于二者中。该限制位点可能天然存在于野生型和突变型序列的一个或另一个中，但是，如果不是这样，可以以与dCAPS测定中使用的方式类似的方式，爿使用一个或另一个或两个PCR引物导入(参见，例如，WO2005/123946和Neff爭乂1998)。技术人员将能肉眼扫描在目标点突变周围的核苦酸序列，以确定是否存在可辨别的限制酶识别位点。如果不存在这种位点，那么他能通过参考已知酶的已知识别位点，设计导入这种可辨别的限制酶识别位点的引物。如果需要超过一种核普酸变化，则可能必须使用两种引物来产生变化，以生成限制位点。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述PCR引物对中的至少一个用于PCR反应中时将限制位点导入核苷酸序列中，所述限制位点包括突变位点，且仅存在于野生型序列或含有点突变的序列中，但不存在于二者中。注意到，优选地引物肯定地鉴别野生型和突变型等位基因，从而不由于限制条件的问题得到错误结果。因此，优选地，尽管不是必需地，在上述情况下，进行两种限制酶切消化，一种使用能消化野生型序列的酶，且一种使用能消化突变序列的酶。如果不是天然存在，技术人员当然能设计必需的引物，以确保导入这些限制酶位点。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中在消化步骤中使用两种限制酶，第一种能消化野生型序列、但不能消化突变序列，且第二种能消化突变序列、但不能消化野生型序列。应当明白，在有些情况下，存在超过一个目标突变。具体地，在8不同的群体中，可能在相同核苷酸处或可能在不同核苷酸处但是在相同密码子内存在不同突变。这些突变可能导致单个突变氨基酸序列或多个不同的突变氨基酸序列结果，这些突变可以对表型具有不同的作用。例如，在ACCase基因中，上述Uel781Leu突变是由于腺嘌呤5341被胸腺嘧啶或胞嘧啶置换。在该情况下，在核苷酸5341处的两种置换导致相同的氨基酸。在也在ACCase基因中的Ue2041Asn/Val/Thr突变中，和在EPSPS基因中的Prol06Ser/Thr中，在相同核苷酸和/或在相同密码子中的突变导致不同的氨基酸和潜在不同的表型。在ALS基因(乙酰乳糖酶合酶)中发现了一个极端情况，其中由于下表所示的CCG野生型密码子的突变，在氨基酸位置197发生了6个不同的抗性突变表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>使用本发明的方法，其包含单个PCR反应和一个或多个选择性限制酶消化，可以简单地测定所有上面详述的情形。例如，如果只是关心在特定位点存在或不存在突变，且不关心它的确切序列(例如因为在该位点的所有已知的突变都以相同方式改变氨基酸序列)，例如，在鼠尾看麦娘中1781处腺噪呤变成胸腺嘧啶或腺嘌呤变成胞嘧啶突变的情况下，那么发现区分野生型和突变序列的限制酶是足够的。例如，参见WO2005/123946,其中进行dCAPS测定，并提供引物来将A^'I位点导入野生型序列的1781处，但是不导入任一种突变形式中因此在限制酶切后仅消化野生型序列。现在已经设计了本发明的方法，技术人员将明白，在这些dCAPS测定中使用的可辨别的限制位点也可以用于本发明的方法中。技术人员将明白，在这种情况下，必须消化野生型序列，且突变体必须保持未被消化，除非可能发现能消化两种突变序列且不切割野生型序列的限制酶。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中超过一个目标突变存在于引物的3'末端之间的(通常)3个或更少的核苷酸中，且其中PCR反应产物是这样的，从而在限制酶切后，野生型序列被使用的限制酶消化，而超过一种突变体中的每个的PCR产物未被消化。当然，如果因为例如它们具有不同的表型效应而必须区分每个突变体，则可能使用本发明的方法来实现，其中使用超过一种限制酶，/人而为野生型和每个突变体生成独特的卩艮制冲既况。参见，例如，实施例1和实施例2。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中超过一个目标突变存在于引物的3'末端之间的(通常)3个或更少的核苷酸中，且其中PCR反应产物是这样的，从而当使用至少一种限制酶来消化PCR产物时，每个突变产生不同的限制概况，且该限制概况不同于野生型序列的限制概况。当然，在其中存在超过一个目标突变的上述情况下，也可以优选地确实地鉴别野生型和每个个别突变。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中当存在超过一个目标突变时，使用超过一种限制酶，限制酶的数目对应于目标突变数目+1,且(i)所述限制酶之一能消化野生型序列，但是不能消化突变序列，且(ii)每种额外的限制酶能消化单个突变序列，但是不能消化野生型序列。当然，在本发明的所有实施方案中，需要的区分限制位点可能将存在于野生型和突变型核苷酸序列中。如果不存在这种限制位点，则可能使用一种或两种PCR引物来导入它们。使用正向和反向PCR引物来导入可辨别的限制位点的能力在本发明的方法中是可能的，因为两种引物都在目标突变附近结束(不同于一般的基于PCR的测定，例如dCAPS测定)。技术人员将明白，在本发明的方法中使用的PCR条件将取决于使用的PCR引物的长度和它们导入目标核苷酸序列中的错配的数目以及PCR引物之间的间隔和因此PCR片段长度。但是，一般而言，由于引物的长度，就一般的PCR反应而言，杂交可能需要降低的温度。随着错配数增加，可能需要进一步降低杂交温度，尽管注意到，本发明人已经发现，由于使用的引物的长度，错配似乎不显著影响杂交效率。合适地，可以使用60摄氏度的退火温度，l分钟的退火时间。另外，就一般的PCR反应而言，杂交步骤所需的时间也应当增加。此外，延伸步骤可以显著缩短，因为(通常)每次添加仅3个或更少的核苷酸。本发明的一个目的也是，提供一种计算机程序，其实施扫描在该一个或多个目标点突变周围的核苷酸序列，并鉴别用于本发明方法中的潜在引物、限制位点和限制酶。在提交野生型和突变型DNA序列后，该程序将鉴别目标核苷酸序列中现有的可辨别的限制位点和/或将产生可以导入正向或反向引物中的突变的列表，以产生需要的限制位点以及将揭示该一个或多个目标点突变存在与否的对应的限制酶列表。因此，在另一个方面，本发明提供了一种计算机程序，其能设计用于本发明方法中的可辨别的PCR引物。本发明的方法主要用于区分除草剂抗性的杂草中的不同的抗性等位基因，且已经显示稳健地跨不同的杂草物种，且实际上，在远源物种中起作用，而不需要改变PCR引物，且无需这些远源物种的目标基因中的核苦酸序列的现有知识。例如，使用牛筋草EPSPS序列设计的PCR引物对已经显示从棉花、玉米、黑麦草、大豆和稷扩增正确长度的DNA(参见实施例2)。可以看出，这是由于在本发明方法中使用的引物的增加的长度与一般的PCR引物相比可以适应更大比例的错配，而不造成有缺陷的杂交。另外，如从实施例1和实施例2可以看出的，本发明的方法已经显示于2种不同的除草剂抗性情况下起作用。此外，本发明的方法不仅可以用于检测和证实抗性生物型在群体中的存在，也可以用于估计群体内抗性植物的频率。现在，将通过下面的非限制性实例结合下面的序列表来描述本发明，其中SEQIDNO:1-Ile2041Asn/Val/Thr的LP國(d)PACS正向引物SEQIDNO:2—Ile2041Asn/Val/Thr的LP-(d)PACS反向引物iiSEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:3-五coM识别位点4-^wzl识别位点5-D&I识别位点6-2041正向PCR引物7-2041反向PCR引物8-Prol06Ser/Thr的LP画(d)PACS正向引物9—Prol06Ser/Thr的LP-(d)PACS反向引物识别位点11—尸vwl识别位点12-106正向PCR引物13—106正向PCR引物14—Prol06Ser/Thr的替代LP画(d)PACS反向引物实施例才艮才居Sambrook爭乂(1989)'Molecularcloning:Alaboratorymanual'，2ndEdition.ColdSpringHarbourLab.Press,进行普通分子生物学方法。实施例1-ACCase基因中Ile2041Asn/Val/Thr突变的研究从待测植物瑞士黑麦草和大穗看麦娘收集个3'J叶样品。对于每个植物，在SpexCertiprep2000modelGenogrinder上研磨3cm叶片段。随后使用来自Promega的WizardMagnetic96DNA植物系统试剂盒，在BeckmanCoulterBiomekFx自动仪器(robot)上提取来自研磨的材料的DNA。设计PCR引物来鉴别ACCase基因中的Ile2041Asn/Val/Thr突变。正向引物的长度是120个碱基对，并与在突变位点上游的共有瑞士黑麦草序列匹配。反向引物的长度是35个碱基对，并相对于共有序列发生突变。引物的3，末端被2个碱基对隔开，从而可以鉴别所有3个潜在突变。正向引物序列CCAGATTCTGCTACCAAGACAGCGCAGGCAATGATGGACTTCAACCGTGAAGGATTACCTCTGTTCATCCTTGCTAACTGGAGAGGCTTCTCTGGTGGGCAAAGAGACCTTTTTGAAGGA[SEQIDNO:1]反向引物序列TAAGGTTCTCAACAATTGTTGATCCAGCCTGCTGA[SEQIDNO:2]在使用五coM(识别位点=GAATTC[SEQIDNO:3])、A7w"I(识别位点=GAANNNNTTC[SEQIDNO:4])和Z)tM(识别位点=CTNAG[SEQIDNO:5])进行限制酶切消化后，预见到下述限制概况表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>当然，当植物样品在该基因座处是杂合子时，可以得到每个样品的上述限制概况的混合物。例如，如果样品是杂合的且含有野生型等位基因和Asn突变型等位基因，则限制概况将显示接近一半的用EcaRI和Zw"I消化的样品，但是未消化的带仍然存在于所有3个消化测定中。4吏用puReTaqReady画To-GoPCR珠(AmershamBiosciences)进行聚合酶链反应，总体积为25|til,含有0.8|tiM每种引物和10-50ng植物基因组DNA。在EppendorfMasterCycle梯度热循环仪96型上进行PCR，将程序设定为，初始变性步骤是在94。C2分钟，随后是40个在94。C30秒、在64"C30秒和在72。Cl分钟的循环。也包括在72。C10分钟的最终的延伸步骤。还使用一般的PCR引物对扩增每个样品，这产生包括在位置6121/6122(等价于在位置2041处的氨基酸状态)周围的关键核苷酸残基的PCR产物。正向引物序列TGTTGGACTTCAACCGTGAAGG[SEQIDNO:6]反向引物序列AGGCTGATTGTATGTCCTAAGG[SEQIDNO:7]随后使用反向PCR引物，在l(xl净PCR产物上进行直接测序。这样做是为了对比测序和LP-(d)PACS测定结果。用EcoAI、和ZWel(NewEnglandBiolabs)消化净PCR产物的4pl等分试样，根据生产商的推荐，每个反应的总体积是2(Hd，且在1XTBE緩冲液中的2%琼脂糖上分离，二者都含有0.5貼/ml溴化乙锭(EtBr)。对于16个野生型和突变型黑麦草属(Z^//wm)样品，下表显示了使用该测定方法和通过测序样品得到的结果之间的关联。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注是/否表示消化了一半PCR产物，剩余物没有切割另外，注意到，也测定了另一份样品，并使用LP-(d)PACS测定和测序发现是杂合的，含有一个lie等位基因和一个Val等位基因(五coWI:是/否；有；DcM:否)。另外，使用相同的引物和PCR条件来研究13个看麦娘属(J/o/ecwn^)样品中的相同的2041突变。在所有情况下，测定预测存在正确的突变，如通过序列分析所证实的。因而，PCR引物、循环条件和限制酶切消化都可以从黑麦草属转移到看麦娘属。实施例2-EPSPS基因中Prol06Ser/Thr突变的研究从牛筋草(￡/eWC,'"e,>2C//C)植物收集个别叶样品。对于每个植物，在SpexCertiprep2000modelGenogrinder上研磨3cm叶片段。随后使用来自Promega的WizardMagnetic96DNA植物系统试剂盒，在BeckmanCoulterBiomekFx自动仪器上提取来自研磨的材料的DNA。设计PCR引物来鉴别EPSPS基因中的Prol06Ser/Thr突变。正向引物的长度是120个碱基对，并与在突变位点上游的共有牛筋草序列匹配；该引物相对于在Prol06Ser/Thr位点的N誦4处的共有序列突变。反向引物的长度是35个碱基对，也基于共有序列，并相对于在Prol06Ser/Thr位点的N+2处的共有序列发生突变。引物的3'末端被单个石咸基对隔开。正向引物序列GAAGCGGACAAAGCTGCCAAAAGAGCAGTAGTTGTTGGCTGTGGTGGCAAGTTCCCAGTTGAGAAGGATGCGAAAGAGGAGGTGCAGCTCTTCTTGGGGAATGCTGGAACTGCAATTCGA[SEQIDNQ:8〗'反向引物序列ATTTCCTCCAGCAGCAGTTACGGCTGCTGTCAACG[SBQIDNO:9〗在用Awl(识别位点=TTCGAA[SEQIDNO:IO])和尸vwl(识别位点=CGATCG[SEQIDNO:1l])进行限制酶切消化后，预见到下述限制相无况表4由下述切割PCR产物野生型(Pro;CCA)否否突变体1(Thr;ACA)是否突变体2(Ser;TCA)否是16当然，当植物样品在该基因座处是杂合子时，可以得到每个样品的上述限制概况的混合物。例如，如果样品是杂合的且含有野生型等位基因和Thr等位基因，则限制概况将显示接近一半的用消化的样品，且尸vwl才艮本不消化。使用puReTaqReady-To-GoPCR珠(AmershamBiosciences)进4亍聚合酶链反应，总体积为含有0.8jliM每种引物和10-50ng植物基因组DNA。在EppendorfMasterCycle梯度热循环仪96型上进行PCR,将程序设定为，初始变性步骤是在94°C2分钟，随后是40个在94°C30秒、在64。C30秒和在72。C1分钟的循环。也包括在72°C10分钟的最终的延伸步骤。还使用一般的PCR引物对扩增每个样品，这产生包括在位置6121/6122(等价于在位置2041处的氨基酸状态)周围的关键核苷酸残基的PCR产物。正向引物序列CTCTTCTTGGGGAATGCTGGA[SEQIDNO:2〗反向引物序列TAACCTTGCCACCAGGTAGCCCTC[SEQIDNO:13]随后使用反向PCR引物，在lpl净PCR产物上进行直接测序。这样做是为了对比测序和LP-dPACS测定结果。用AwII和尸vwl(NewEnglandBiolabs)消化净PCR产物的4pl等分试样，根据生产商的推荐，每个反应的总体积是20p1,且在1XTBE緩冲液中的2%琼脂糖上分离，二者都含有0.5|ig/ml溴化乙锭(EtBr)。将该方法应用于来自马来西亚的混合草甘膦抗性的牛筋草群体。如从下表可以看出的，该测定正确地鉴别出在每个植物中含有的等位基因，正如通过测序所证实的。表5样品由下述切割PCR产物测定预测测序结果1是/否否Pro/ThrPro/Thr2否否Pro/ProPro/Pro否否Pro/ProPro/Pro4否是/否Pro/SerPro/Ser是否Thr/ThrThr/Thr6否否Pro/ProPro/Pro7否否Pro/ProPro/Pro8是/否否Pro/ThrPro/Thr在其它物种上测试引物对，且发现从棉花、玉米、黑麦草、大豆和稷扩增正确长度的DNA，从而证实了甚至从单子叶植物到双子叶植物的引物广泛可转移性。也与在N+3处具有一个额外的强制突变的不同的反向引物组合使用相同的120bp正向引物。这样做是为了也能确实地鉴别野生型脯氨酸残基。正向引物序列GAAGCGGACAAAGCTGCCAAAAGAGCAGTAGTTGTTGGCTGTGGTGGCAAGTTCCCAGTTGAGAAGGATGCGAAAGAGGAGGTGCAGCTCTTCTTOGGGAATGCTGGAACTGCAATTCGA[SEQ:DDNO:S]反向引物序列ATTTCCTCCAGCAGCAGTTACGGCTGCTGTCACCG[SEQIDNO:14]在PCR扩增后，该额外的突变产生酶/^aII的特征性限制位点，该酶对于野生型脯氨酸氨基酸残基的检测是特异性的。虽然有3个强制突变(l个在正向引物中，且2个在反向引物中)，且第二组引物证实是非常可转移的，并可以跨广泛且不同范围的植物物种成功地扩增。//pall消化确实地鉴别出脯氨酸残基，并与测序结果相关联。注意到，在反向引物中包含该第二突变不改变用它们各自的尸vwl和限制酶确实地鉴别2个丝氨酸或苏氨酸残基的可能性。该实施例是本发明测定的稳健性的进一步证据。应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于解释目的，且不脱离由所附权利要求书定义的本发明的范围的各种修饰对本领域技术人员是显而易见的。本文引用的所有出版物都为所有目的整体引作参考，其程度如同特别地和单独地指出每篇个别的出版物这样引作参考一样。参考文献Christoffers,MJ.;Berg,M丄.；Messersmith，C.G.Anisoleucinetoleucinemutationinacetyl-CoAcarboxylaseconfersherbicideresistanceinWildoat.Genome,2002.Vol.45，No.6.p.10494056.Delye,C.;Calraes,R;Matejicek,A.SNP'markersforblack-grass(v4/o;ec"rwmyojwozVfesHuds.)genotypesresistanttoacetyl-CoAcarboxylaseinhibitingherbicides.Theoreticalandappliedgenetics,2002a.Vol,104，p」U4-1120.Delye,C.;Matejicek,A.;Gasquez,J.PCR-Baseddetectionofresistance'toacetyl-CoAcarboxylase-inhibitingherbicidesinblack-grass(/(/o;ecwntf附yosMro^ayHuds)andryegrass(Zo&'柳r,wmGaud)PestManagementScience,2002b.Vol58,p.474-478.Delye,C.;Wang,T.;Darmency,H,Anisoleucine-leucinesubstitutionmcWoroplasticacetyl-CoAcarboxylasefromgreenfoxtailOSteton.crv!'n'cfoL.Beauv.)isresponsibleforresistancetothecyclohexanedioneherbicidesethoxydim.Planta,2002c.Vol.214,No.3.p.421-427.Neff'M.M.;Neff,J,:D.;Chory,J.;Pepper,A.E,dCAPS，asimpletedmiqueforthegeneticanalysisofsinglenucleotidepolymorphisms:experimentalapplicationsin爿mW鄉j/j/磁朋agenetica.PlantJournal,1998,Vol.14,p.387-392.权利要求1.用于检测目标基因中的点突变的方法，其包含a)使用一对能扩增在突变周围和包含突变的区域的引物，在从目标基因得到的DNA提取物上进行PCR反应；b)用至少一种限制酶消化步骤(a)的PCR产物，所述限制酶区分野生型序列和含有突变的序列，以得到限制酶切消化；c)分析步骤(b)的消化的PCR产物，以鉴别那些指示突变存在的DNA提取物；其特征在于，PCR引物的3’末端被3个或更少的核苷酸隔开，其中的一个包含所述突变。2.根据权利要求l的方法，其中所述引物的3，末端被下述隔开a)3个核苷酸；b)2个核普酸；c)1个核苷酸。3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述PCR引物对中的至少一个的长度是至少30个核苷酸。4.根据权利要求3的方法，其中所述PCR引物对之一比另一个小至少20bp。5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述PCR引物对中的至少一个用于PCR反应中时将限制位点导入核苷酸序列中，所述限制位点包括突变位点，且仅存在于野生型序列或含有点突变的序列中，但不存在于二者中。6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中在消化步骤中使用两种限制酶，第一种能消化野生型序列、但不能消化突变序列，且第二种能消化突变序列、但不能消化野生型序列。7.根据权利要求1的方法，其中超过一个目标突变存在于引物的3，末端之间的3个或更少的核苷酸中，且其中PCR反应产物是这样的，从而在限制酶切后，野生型序列被使用的限制酶消化，而超过一种突变体中的每个的PCR产物未被消化。8.根据权利要求1的方法，其中超过一个目标突变存在于引物的3'末端之间的3个或更少的核苷酸中，且其中PCR反应产物是这样的，从而当使用至少一种限制酶来消化PCR产物时，每个突变产生不同的限制概况，且该限制概况不同于野生型序列的限制概况。9.根据权利要求8的方法，其中当存在超过一个目标突变时，使用超过一种限制酶，限制酶的数目对应于目标突变数目+1,且(i)所述限制酶之一能消化野生型序列，但是不能消化突变序列，且(ii)每种额外的限制酶能消化单个突变序列，但是不能消化野生型序列。10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述一个或多个目标点突变赋予杀虫剂抗性。11.权利要求10的方法，其中所述一个或多个目标点突变赋予除草剂抗性。12.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述一个或多个目标点突变造成导致疾病的生物中的生化或生理变化。13.—种计算机程序，其能设计用于根据权利要求1-9中任一项的方法中的可辨别的PCR引物。全文摘要本发明尤其是涉及用于检测目标基因中的点突变的方法，其中使用PCR和基于限制酶切消化的方法。文档编号C12Q1/68GK101506386SQ200780031651公开日2009年8月12日申请日期2007年6月25日优先权日2006年6月27日发明者S·S·考恩邓申请人:先正达有限公司