角质形成细胞衍生的干扰素的制作方法

专利名称：角质形成细胞衍生的干扰素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种编码是干扰素家族成员的多肽的新的人基因，更具体地本发明提供了编码称为“角质形成细胞衍生的干扰素”或“KDI”的人多肽的分离的核酸分子。还提供了KDI多肽，生产这种物质的载体、宿主细胞及重组方法。本发明还提供了检测与免疫系统相关疾病的诊断方法，及治疗免疫系统疾病的方法。本发明还涉及鉴别KDI的兴奋剂和拮抗剂的筛选方法。
抗病毒IFN已用于临床抗病毒治疗，例如用于治疗AIDS(Lane.Semin.Oncol.18:46-52(Ocl.1991))，病毒性肝炎包括慢性乙肝，丙肝(Woo,M.H.and Brunakis,T.G.,Ann.Parmacother.31:330-337(1997年3月)；Gibas.A.L.Gastroenterologist,1:129-142(1993.6))，丁肝，乳头瘤病毒(Levine,L.A.等，Urology 47:553-557(1996.4))，疱疹病毒(Ho,M.,Annu.Rev.Med.38:51-59(1987))，脑炎病毒(Wintergerst等，感染，20:207-212(1992,7))，及用于预防鼻炎和呼吸道感染(Ho.M.,Annu.Rev.Med.38:51-59(1987))。
抗寄生虫IFN已被建议用于抗寄生虫治疗，例如γ-IFN可用于治疗Cryptosporidium parvum感染(Rehg,J.E.,J.Infect.Des.174:229-232(1996.7))。
抗细菌IFN已临床用于抗菌治疗。例如γ-IFN已用于治疗多抗药性肺结核(Condos,R.等，Lancet.349:1513-1515(1997))。
抗癌干扰素疗法已用于治疗各种癌症(例如，多毛细胞白血病(Hofmann等，癌症治疗综述，12(增刊.B):33-37(1985,12))急性骨髓样白血病(Stone,R.M.等，Am.J.Clin.Oncol.16:159-163(1993,4))，骨肉瘤(Strander,H.等，Acta Oncol,34:877-880(1995))，基细胞癌(Dogan,B.等，癌症信息91:215-219(1995,5))，神经胶质瘤(Fetell,M.R.等，癌症65:78-83(1990.1)，肾细胞癌(Aso.Y.等，Prof.Clin.Biol.Res.303:653～659(1989))，多骨髓瘤(Peest.D.等，Br.J.Haematol.94:425-432(Sept.1996))，黑素瘤(Ikic.D.等.，Int.J.Dermatol.34:872-874(1995.12))和Hodgkin’s病(Rybak,M.E.等，J.Biol.Response Mod.9:1-41(1990.2))。α干扰素和替莫唑胺组合治疗癌症的增效治疗进展已经报道(专利公开WO9712630,Dugan,M.H.)。
免疫疗法IFN已临床用于免疫治疗或更特别地用于(1)例如预防移植体对宿主的排斥，或缩短自身免疫系统疾病的渐进如关节炎、多发硬化，(2)糖尿病。β-IFN在美国批准销售治疗多发硬化(即作为免疫抑制剂)。近来有报道多发硬化患者Ⅰ型干扰素和白细胞介素-2的产生减少(Wandinger,K.P.等，J.Neurol.Sci.149:87-93(1997))。另外，重组α-IFN免疫疗法(与重组人IL-2组合)已成功用于自体骨髓或造血干细胞移植后的淋巴癌患者，其可在翻译后促进病情好转(Nagler,A.等，Blood 89:3951-3959(1997.7))。
抗变态反应服用γ-IFN已用于治疗哺乳动物变态反应(参见专利公开WO8701288,Parkin,J.M.和Pinching,A.J.)现也已证实变态反应哮喘患者体内IL-12和IL-12依赖型γ-IFN释放减少(van der Pouw kraan,T.C.等，免疫杂志158:5560-5565(1997))。因此，IFN通过抑制体液应答而可用于治疗变态反应。
疫苗佐剂干扰素可用作佐剂或辅佐剂以增强或刺激预防或治疗接种情况下的免疫应答。(Heath,A.W和Playfair,J.H.L.疫苗10:427-434)1992))。
显然地，本领域中需要揭示新干扰素蛋白的各种应用，例如免疫治疗，以及抗病毒，抗寄生虫，抗细菌，或抗癌治疗中，或需要提高干扰素活性的症状。
编码的多肽具有推导的27个氨基酸的前导序列，在

图1中下划线处；推导的成熟KDI蛋白质的氨基酸序列在图1中如28～207位氨基酸所示，在SEQ ID NO:2中如1～207位残基所示。
图1(SEQ ID NO:2)的165-183位残基包括干扰素多肽尤其KDI多肽的特征序列。因此，优选的是包括图1的165-183位残基的多肽及编码这种多肽的多核苷酸。
因此，本发明一方面提供了分离的核酸分子，其包括含有选自以下一组核苷酸序列的多核苷酸(a)编码具有SEQ ID NO:2中完整氨基酸序列的KDI多肽的核苷酸序列；(b)编码具有除N末端甲硫氨酸之外完整SEQ ID NO:2氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的2～207位残基)的KDI多肽的核苷酸；(c)编码SEQ ID NO:2中28～207位残基所示成熟KDI多肽的核苷酸序列；(d)编码SEQ ID NO:2的165～183位残基的核苷酸序列；(e)编码由克隆HKAPI15中所含人cDNA编码的完整多肽的核苷酸序列；(f)编码由克隆HKAPI15中所含的人cDNA编码的除N末端甲硫氨酸之外完整多肽的核苷酸序列；(g)编码由克隆HKAPI15中所含的人cDNA编码的成熟多肽的核苷酸序列；和(h)与以上(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)的任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明的另一实施方案包括分离的核酸分子，其包括具有至少90％，优选至少95％,96％,97％,98％或99％相同于上述(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)或(h)任一核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或具有在严格杂交条件下与(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)或(h)中多核苷酸杂交的多核苷酸。此杂交的多核苷酸在严格杂交条件下与具有只由A或T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸不杂交。本发明的另一核酸实施方案涉及分离的核酸分子,其包括编码具有上述(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)氨基酸序列的KDI多肽的携带表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
本发明还涉及重组载体，其包括本发明分离的核酸分子，还涉及含有重组载体的宿主细胞，以及生产这种载体和宿主细胞及用它们通过重组技术生产KDI多肽或肽的方法。
本发明还提供了分离的KDI多肽，其包括选自以下一组氨基酸序列的氨基酸序列(a)具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列的全长KDI多肽的氨基酸序列；(b)具有除N末端甲硫氨酸之外的SEQID NO:2所示完整氨基酸序列的全长KDI多肽的氨基酸序列(即SEQID NO:2的2～207位残基)；(c)SEQ ID NO:2中28～207位残基所示成熟KDI多肽的氨基酸序列；(d)SEQ ID NO:2的165～183位残基所示氨基酸序列；(e)由克隆HKAPI15中含有的人cDNA编码的全长KDI多肽；(f)由克隆HKAPI15中含有的人cDNA编码的除N-末端甲硫氨酸之外的全长KDI多肽；和(g)由克隆HKAPI15含有的人cDNA编码的成熟KDI多肽。本发明的多肽还包括具有至少80％，优选至少90％，更优选95％,96％,97％,98％或99％相同于上述(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中所述氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，以及与上述那些序列具有至少90％，优选至少95％相似性的氨基酸序列的多肽。
本发明的另一实施方案涉及肽或多肽，其包括具有以上(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)所述氨基酸序列的KDI多肽的携带表位部分的氨基酸序列。具有本发明KDI多肽的携带表位部分氨基酸序列的肽或多肽包括具有至少6或7个，优选至少9个，更优选至少30～50个氨基酸的这种多肽的一部分，当然直至并包括本发明多肽的完整氨基酸序列的任何长度的携带表位的多肽也包括在本发明内。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的抗体，其特异地与具有(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)所述氨基酸序列的KDI多肽结合。本发明还提供了分离与具有本文所述氨基酸序列的KDI多肽特异结合的抗体的方法。这种抗体在以下所述治疗中是有效的。
本发明还提供了含KDI多肽的药物组合物，其可用于治疗免疫系统相关疾病如病毒感染，寄生虫感染，细菌感染，癌症，自身免疫系统疾病，多发硬化、淋巴癌及变态反应疾病。本发明还提供了治疗各种需要干扰素多肽的个体的方法。
本发明还提供了含有KDI多肽或KDI多核苷酸的组合物以施用于体外细胞，来自体内的细胞及体内细胞，或多细胞生物体。在本发明的某些特别优选的实施方案中，组合物含有KDI多核苷酸，用于在宿主机体内表达KDI多肽以治疗疾病。尤为优选的是在患者体内表达以治疗与干扰素畸变内源活性相关的功能异常。
本发明还提供了鉴别能增强或抑制KDI多肽生物活性的化合物的筛选法，其包括将由KDI多肽增强的受体在存在KDI多肽时与候选化合物相接触，分析例如在候选化合物和KDI多肽存在时的抗病毒活性，并将此活性与标准活性水平相对比，标准水平是在受体与KDI之间没有候选化合物的情况下相接触分析而得。在此分析中，活性高于标准水平表明候选化合物是KDI活性的兴奋剂，活性低于标准水平表明候选化合物是KDI活性的拮抗剂。
现已揭示KDI在角质形成细胞中表达。因而本发明的核酸用作杂交探针以示差鉴别生物样本中存在的组织或细胞类型。相似地，多肽及其抗体用于提供免疫探针以示差鉴别组织或细胞类型。另外，对上述组织或细胞尤其免疫系统的疾病而言，在取自具有相关的疾病患者的某些组织(例如癌及创作组织)或体液(例如血清、血浆、尿、滑液或脑脊液)中可检测与“标准”KDI基因表达水平相比明显较高或较低水平KDI基因表达，标准KDI基因表达水平即在无免疫系统疾病的健康组织中KDI的表达水平。因此，本发明提供了在诊断这种疾病中的有效诊断方法，其包括(a)分析在个体细胞或体液中KDI基因表达水平；(b)对比此KDI基因表达水平与标准KDI基因表达水平，从而根据对比结果高于或低于标准水平来指示免疫系统疾病。
本发明另一方面涉及一种治疗需要机体内干扰素活性水平增高的患者的方法，包括给予这种患者含有治疗有效量的本发明分离的KDI多肽或其兴奋剂的组合物。
本发明另一方面还涉及一种治疗需要机体内干扰素活性水平降低的患者的方法，包括给予这种患者含有治疗有效量的KDI拮抗剂的组合物。本发明中使用的优选拮抗剂是KDI特异抗体。
图2示出KDI蛋白质与人Ω干扰素mRNA的翻译产物(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列之间的相同区域，这通过Bestfit计算机程序确定(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)。
图3示出KDI氨基酸序列分析。示出了α,β，转角和卷曲区，亲水性和疏水性；两亲性区；柔性区；抗原指数及表面概率。在“抗原指数-Jameson-Wolf”图中，正峰值表明KDI蛋白的高抗原区的位置，即从中可获得本发明携带表位的肽。
图4示出本发明的KDI多肽与干扰素多肽家族一些其它成员的序列对比。所示的是人干扰素β-1(SEQ ID NO:4)，人胎盘干扰素(SEQ ID NO:5)，人Ω干扰素(SEQ ID NO:6)，人α-c干扰素(SEQ ID NO:7)，人α-F干扰素(SEQ ID NO:8)，人干扰素Ⅱ-1(SEQ ID NO:9)，人α干扰素-N(SEQ ID NO:10)，牛TP-1(SEQ ID NO:11),ovi TP-1(SEQ ID NO:12)；猪TP(SEQ IDNO:13)；人干扰素β-2a(IL-6)(SEQ ID NO:14)，牛干扰素β-2(SEQ ID NO:15)，牛干扰素β-1(SEQ ID NO:20)，合成干扰素β-1(SEQ ID NO:21)。此序列对比是通过Megalign常规Clustal方法用PAM250残基重量表产生的。Megalign包含在DNAstar suite程序中。
发明的详细描述本发明提供了分离的核酸分子，其包括编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的角质形成细胞衍生的干扰素多肽(KDI)的多核苷酸。图1所示核苷酸序列(SEQ ID NO:1)是通过对1998年12月1日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801 Boulevard大学，Manassas,Virgina 20110-2209，保藏号ATCC 203500的人HKAPI15 cDNA进行测序而获得的。此保藏的cDNA包含在质粒pCMVSport 2.0中(Life Technologies,Gaithersburg MD)，并可通过位于人cDNA侧翼的SalⅠ/NotⅠ限制性酶位点切除。
本发明的KDI蛋白质与干扰素家族的一些成员呈序列同源，特别是人Ω干扰素mRNA的翻译产物(图2)(SEQ ID NO:3)。Ω干扰素已示出抑制各种肿瘤细胞体外增殖，刺激天然杀伤细胞活性，增强主要组织相容性Ⅰ类(非Ⅱ类)抗原表达，并抑制用促细胞分裂原或同种异型细胞刺激的淋巴细胞增殖。参见Adolf,G.R.人Ω干扰素综述，Mult Scler 1995；1 Suppl 1:S44-S47。已测定KDI表达主要在角质形成细胞、树状细胞和单核细胞中发现，但在角质形成细胞中尤其强。用TNF-α或PolyIC(刺激病毒感染)刺激角质形成细胞特异并迅速地刺激KDI转录物的过表达。基于其结构与Ω-IFN相似且在对刺激的病毒感染应答中表达增加，确认KDI呈现Ω-IFN和其它干扰素蛋白的许多生物活性，包括抑制肿瘤增殖，抗病毒活性，NK细胞功能及免疫系统增强作用。核酸分子除非特别表明，所有通过对本文DNA分子进行测序测定的核苷酸序列均用自动DNA测序仪(如Model 373 from Applied Biosystems.Inc.Foster City.CA)测定，由本文测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列通过如上测定的DNA序列翻译推导。因而如本领域已知通过自动方法测定的任何DNA序列一样，本文测定的核苷酸序列可有一些误差。自动测定的核苷酸序列与测序DNA分子的真正核苷酸序列典型地至少大约90％，更典型地至少大约95％～99.9％相同。真实序列可通过其它方法更精确测定，包括本领域熟知的人工DNA测序法。本领域也已知测定的核苷酸序列与真实序列相对比有一个插入或缺失将导致核苷酸序列翻译中读框移位，由此由测定的核苷酸序列编码的推导的氨基酸序列从这个插入或缺失点开始将完全不同于由测序的DNA分子真实编码的氨基酸序列。
核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”对DNA分子或多核苷酸而言是指脱氧核糖核苷酸的序列，对RNA分子或多核苷酸而言是指相应核糖核苷酸(A,G,C和U)的序列，其中在特异的脱氧核糖核苷酸序列中的每个胸腺嘧啶脱氧核苷(T)被尿嘧啶核苷(U)取代。
用本文提供的信息，如图1中的核苷酸序列，用标准分子生物学方法如用mRNA作起始物克隆cDNA，可获得编码KDI多肽的本发明的核酸分子。本发明例证了图1所示核酸分子(SEQ ID NO:1)在衍生自分离的角质形成细胞的cDNA文库中发现。
图1的KDI DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)包括编码207个氨基酸残基的蛋白质的一开放读框，起始密码子在图1所示核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的35～37位核苷酸。SEQ ID NO:2所示的KDI蛋白质的氨基酸序列大约35％相同于Ω-IFN(图2)。Ω-IFN的序列可在GenBank获得，登记号No.gb1A 12140。
熟练技术人员知道由于可能存在上述序列误差，由保藏的cDNA编码的包括大约207个氨基酸的真正完整KDI多肽有时可以较长或较短。一般地，真正开放读框可以在推导自图1所示(SEQ ID NO:1)N末端甲硫氨酸密码子的±20个，尤其±10个氨基酸范围内。前导和成熟序列完整KDI蛋白的氨基酸序列包括前导序列和成熟蛋白质，如SEQID NO:2所示。本发明尤其提供了编码成熟形式KDI蛋白质的核酸分子。因此根据信号假说，一旦生长蛋白链经过粗面内质网开始输出，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号或分泌性前导序列，其裂解自完整多肽以产生分泌的“成熟”形式蛋白质。大多数哺乳动物细胞甚至昆虫细胞以相同特异性裂解分泌的蛋白质。然而在一些情况中，分泌蛋白的裂解不是完全均匀的，则产生两或多种成熟蛋白质。另外，长期以来已知分泌蛋白质的裂解特异性由完整蛋白质的一级结构最终确定，即其在多肽的氨基酸序列中是固有的。因而本发明提供了编码具有由人克隆HKAPI15(ATCC.保藏号No.203500)中cDNA编码的氨基酸序列的成熟KDI多肽的核苷酸序列。“具有由人克隆HKAPI15中的cDNA编码的氨基酸序列的成熟KDI多肽”是指由包含在保藏载体中的克隆的人DNA序列编码的完整开放读框在哺乳动物细胞中(如下述COS细胞)表达而产生的成熟形式的KDI蛋白质。
另外，本发明提供了推测蛋白质是否具有分泌前导序列以及前导序列裂解点的方法。例如McGeoch的方法(病毒研究3:271-286(1995))使用来自完整的(未裂解)蛋白质的短N-末端荷电区及随后的非荷电区的信息。Heinje的方法(核酸研究14:4683～4690(1986))使用来自围绕裂解位点，典型地-13～+2残基的残基信息，其中+1表示成熟蛋白质的氨基末端。这些方法中已知哺乳动物分泌蛋白的推导的裂解位点准确度为75-80％(Heinje，前述)。然而，这两种方法对于一给定蛋白质不总是得出相同推导的切割点。
在本发明中，完整KDI多肽的推导的氨基酸序列用“PSORT”计算机程序分析，该程序得自京都大学化学研究所的Kenta Nakai博士(参见K.Nakai and M.Kanehisa,Genomics 14:897-911(1992))，其是基于氨基酸序列推测蛋白质的细胞定位的专门系统。作为此计算机推测定位的一部分，可将McGeoch和Heinje的方法掺入。以上计算机分析推测一个在完整氨基酸序列内的潜在切割位点示于SEQ IDNO:2；即在图1(SEQ ID NO:2)中27和28位残基之间。当然，被天然发生的酶使用的切割位点的准确位置与推测的切割位点可有轻微变化且在物种间可以变化。由此提供了起自大约20～34位残基的成熟多肽。尤其地，本发明提供了具有如下SEQ ID NO:2一部分的多肽SEQ ID NO:2中20～207位残基，SEQ ID NO:2中21～207位残基，SEQ ID NO:2中22～207位残基，SEQ ID NO:2中23～207位残基，SEQ ID NO:2中24～207位残基，SEQ ID NO:2中的25～207位残基，SEQ ID NO:2中的26～207位残基，SEQ IDNO:2中的27～207位残基，SEQ ID NO:2中的28～207位残基，SEQ ID NO:2中29～207位残基，SEQ ID NO:2中30～207位残基，SEQ ID NO:2中31～207位残基，SEQ ID NO:2中32～207位残基，SEQ ID NO:2中33～207位残基，SEQ ID NO:2中34～207位残基。本发明还提供了编码这种多肽的多核苷酸。
本发明的核酸分子可以是RNA形式或DNA形式。此DNA可以是双链或单链的。单链DNA或RNA可以是编码链，也指作有义链，或其可以是非编码链，也指作反义链。
在特异实施方案中，本发明的多核苷酸长度小于300kb,200kb,100kb,50kb,15kb,10kb或7.5kb。在另一实施方案中，本发明的多核苷酸包括KDI编码序列的至少15个连续核苷酸，但不包括任何KDI内含子的全部或部分。在另一实施方案中，包括KDI编码序列的核酸不含有基因组侧翼基因的编码序列(即基因组中KDI编码序列的5’或3’)。
“分离的”核酸分子是指已从其天然环境中移出的核酸分子，DNA或RNA。例如，本发明包含于载体中的重组DNA分子是分离的。分离的DNA分子例如包括保存在异源宿主细胞中的重组DNA分子，或溶液中纯化的(部分或基本纯化的)DNA分子。分离的RNA分子包括本发明DNA分子的体内或体外RNA转录物。然而作为还未与文库(如基因组或cDNA文库)的其它成员分离的文库成员(如含有克隆和文库其它成员的均匀溶液形式)的克隆中含有的核酸不是分离的，或分离或取自细胞或细胞裂解物的染色体(如染色体组型中“染色体涂片”)不是分离的。如本文所述，根据本发明的分离的核酸分子可以是天然、重组或合成产生的。
本发明分离的核酸分子包括具有开放读框(ORF)的DNA分子，该读框起始密码子在图1(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列35～37位。
本发明分离的核酸分子还包括具有缺失N末端甲硫氨酸的SEQID NO:2的2～207位所示KDI蛋白编码序列的DNA分子。
另外，本发明的分离的核酸分子由于遗传密码的简并包括含有基本不同于上述那些序列，但仍编码KDI蛋白的序列的DNA分子。当然本领域熟知遗传密码和物种特异密码的优先性。因此，本领域技术人员产生上述简并变体，例如使特殊宿主密码子表达最佳化(例如利用细菌宿主如E.coli将人mRNA中密码改变为其优选的)是常规技术。
本发明另一方面提供了编码具有由克隆HKAPI15(ATCC保藏号No.203500)中人cDNA编码的氨基酸序列的KDI多肽的分离的核酸分子。优选地，此核酸分子将编码由上述保藏的人cDNA编码的成熟多肽。
本发明还提供了具有图1(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列，或具有包含于上述保藏的克隆中的KDI cDNA的核苷酸序列的分离的核酸分子，或具有互补于上述序列之一的序列的核酸分子。这种分离的分子，尤其DNA分子用于生产本发明的KDI多肽，并作为探针检测用载体转染生产KDI的细胞中的mRNA，即作为标记测定宿主细胞中异源基因的表达。
本发明还涉及编码本文所述核苷酸序列一部分的核酸分子，以及所述分离的核酸分子的片段。本发明尤其提供了具有代表SEQ IDNO:1一部分的核苷酸序列的多核苷酸，其由SEQ ID NO:1的35～655位组成。本发明其它特别优选的多核苷酸片段包括或由SEQ IDNO:1的以下核苷酸残基组成 38-655,41-655,44-655,47-655,50-655,53-655,56-655,59-655,62-655,65-655,68-655,71-655,74-655,77-655,80-655,83-655,86-655,89-655,92-655,95-655,98-655,101-655,104-655,107-655,110-655,113-655,116-655,119-655,122-655,125-655,128-655,131-655,134-655,137-655,140-655,143-655,146-655,149-655,152-655,155-655,158-655,161-655,164-655,167-655,170-655,173-655,176-655,179-655,182-655,185-655,188-655,191-655,194-655,197-655,200-655,203-655,206-655,209-655,212-655,215-655,218-655,221-655,224-655,227-655,230-655,233-655,236-655,239-655,242-655,245-655,248-655,251-655,254-655,257-655,260-655,263-655,266-655,269-655,272-655,275-655,278-655,281-655,284-655,287-655,290-655,293-655,296-655,299-655,302-655,305-655,308-655,311-655,314-655,317-655,320-655,323-655,326-655,329-655,332-655,335-655,338-655,341-655,344-655,347-655,350-655,353-655,356-655,359-655,362-655,365-655,368-655,371-655,374-655,377-655,380-655,383-655,386-655,389-655,392-655,395-655,398-655,401-655,404-655,407-655,410-655,413-655,416-655,419-655,422-655,425-655,428-655,431-655,434-655,437-655,440-655,443-655,446-655,449-655,452-655,455-655,458-655,461-655,464-655,467-655,470-655,473-655,476-655,479-655,482-655,485-655,488-655,491-655,494-655,497-655,500-655,503-655,506-655,509-655,512-655,515-655,518-655,521-655,524-655,527-655,530-655,533-655,536-655,539-655,542-655,545-655,548-655,551-655,554-655,557-655,560-655,563-655,566-655,569-655,572-655,575-655,578-655,581-655,584-655,587-655,590-655,593-655,596-655,599-655,602-655,605-655,608-655,611-655,614-655,617-655,620-655,623-655,626-655,629-655,632-655,和635-655本发明尤为优选的多核苷酸片段包括或由SEQ ID NO:1的以下核苷酸残基组成38-68,38-71,38-74,38-77,38-80,38-83,38-86,38-89,38-92,38-95,38-98,38-101,38-104,38-107,38-110,38-113,38-116,38-119,38-122,38-125,38-128,38-131,38-134,38-137,38-140,38-143,38-146,38-149,38-152,38-155,38-158,38-161,38-164,38-167,38-170,38-173,38-176,38-179,38-182,38-185,38-188,38-191,38-194,38-197,38-200,38-203,38-206,38-209,38-212,38-215,38-218,38-221,38-224,38-227,38-230,38-233,38-236,38-239,38-242,38-245,38-248,38-251,38-254,38-257,38-260,38-263,38-266,38-269,38-272,38-275,38-278,38-281,38-284,38-287,38-290,38-293,38-296,38-299,38-302,38-305,38-308,38-311,38-314,38-317,38-320,38-323,38-326,38-329,38-335,38-338,38-341,38-344,38-347,38-350,38-353,38-356,38-359,38-362,38-365,38-368,38-371,38-374,38-377,38-380,38-383,38-386,38-389,38-392,38-395,38-398,38-401,38-404,38-407,38-410,38-413,38-416,38-419,38-422,38-425,38-428,38-431,38-434,38-437,38-440,38-443,38-446,38-449,38-452,38-455,38-458,38-461,38-464,38-467,38-470,38-473,38-476,38-479,38-482,38-485,38-488,38-491,38-494,38-497,38-500,38-503,38-506,38-509,38-512,38-515,38-518,38-521,38-524,38-527,38-530,38-533,38-536,38-539,38-542,38-545,38-548,38-551,38-554,38-557,38-560,38-563,38-566,38-569,38-572,38-575,38-578,38-581,38-584,38-587,38-590,38-593,38-596,38-599,38-602,38-605,38-608,38-611,38-614,38-617,38-620,38-623,38-626,38-629,38-632，和38-635另外，本发明包括含有SEQ ID NO:1的至少大约30个，优选至少大约50个连续核苷酸的任何部分的多核苷酸。
通常地，具有保藏的cDNA的核苷酸序列或图1(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列的分离的核酸分子的片段是指用作所述诊断探针和引物的长度至少大约15nt，优选至少大约20nt，更优选至少大约30nt，最优选至少大约40nt的片段。当然长度为50～600nt的较大片段(长度为400nt,450nt,500nt,550nt和600nt的片段也属于所有长度在15和600nt之间片段，但是考虑空间特性不特别列举)根据本发明也是有用的，相当于保藏的cDNA或图1(SEQ ID NO:1)所示的大部分(如果不是全部)核苷酸序列的片段也是有用的。例如，长度为至少20nt的片段是指包括保藏的cDNA的核苷酸序列或图1(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列的20或更多个连续碱基的片段，当然可包括非衍生自SEQ ID NO:1(或保藏的cDNA)的融合在SEQ ID NO:1或保藏的cDNA的20＋连续碱基的任一个末端的额外核酸序列。本发明优选的核酸片段包括编码如图3中鉴别的KDI多肽携带表位部分的核酸分子，并如下详述。
本发明另一方面提供了分离的核酸分子，其包括在严格杂交条件下与上述本发明核酸分子中一部分多核苷酸例如克隆HKAPI15(ATCC保藏号203500)中人cDNA杂交的多核苷酸。“严格杂交条件”是指在含以下成份的溶液中在42℃培养过夜50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6),5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20μg/ml变性的剪切鲑精DNA，随后在大约65℃用0.1×SSC将滤膜洗涤2次。
与多核苷酸“一部分”杂交的多核苷酸是指与相关多核苷酸的至少大约15个核苷酸(nt)，优选至少大约20nt，更优选至少大约30个nt，最优选至少大约30-70个nt(例如50个)杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。这些多核苷酸如上述用作诊断探针和引物并在下文详述。
例如“长度至少为20个nt”的一部分多核苷酸是指相关多核苷酸的核苷酸序列的20或更多个连续核苷酸(如保藏的cDNA或图1(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列)。当然，只与聚A序列(例如图1(SEQ ID NO:1)所示KDI cDNA的3’末端聚(A)段序列)或T(或U)残基的互补序列杂交的多核苷酸不包括在本发明用于杂交本发明一部分核酸的多核苷酸内，因为这种多核苷酸将与含有聚(A)序列或其互补序列的任何核酸分子(例如实际上任何双链cDNA克隆)杂交。
在特异的实施方案中，本发明的多核苷酸长度小于100000kb,50000kb,10000kb,1000kb,500kb,400kb,350kb,300kb,250kb,200kb,175kb,150kb,125kb,100kb,75kb,50kb,40kb,30kb,25kb,20kb,15kb,7.5kb，或5kb。
本发明编码KDI多肽的核酸分子可包括但非限于那些通过自身编码完整多肽的氨基酸序列的核酸，及完整多肽的编码序列及其它序列，如那些编码加入的前导分泌序列如前蛋白，蛋白原或前蛋白原序列的序列。
本发明核酸还编码具有额外的，非编码序列的上述蛋白质序列，例如包括但非限于内含子和非编码5’和3’序列，如转录的，未翻译的在转录，mRNA加工，包括剪接和聚腺苷酸化信号，例如核糖体结合和mRNA的稳定性中起作用的序列；编码额外氨基酸如那些提供其它功能的氨基酸的额外编码序列。
因此，编码多肽的序列可与标记序列，如编码促进融合多肽纯化的肽的序列融合。在本发明此方面的某些优选实施方案中，标记氨基酸序列是6-组氨酸肽，如pQE载体中提供的标记(QIAGEN,Inc.9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)，其中许多可商购。如Gentz等在Proc.Natl.Acad.Sci USA 86:821-824(1989)中所述，6-组氨酸使融合蛋白便于纯化。“HA”标记是用于纯化的另一种肽，其相当于衍生自流感血凝素蛋白的表位，这已由Wilson等，细胞37:767(1984)中所述。如下所述，其它这种融合蛋白包括在N-或C-末端融合Fc的KDI。变体和突变的多核苷酸本发明还涉及本发明核酸分子的变体，其编码KDI蛋白质的一部分，类似物或衍生物。变体可天然发生如天然等位基因变体。“等位基因变体”是指占据机体染色体上一基因座的基因的几个变化形式之一。参见，基因Ⅱ,Lewin,B.,ed.,John Wiley & Sons，纽约(1985)。非天然发生的变体可用本领域已知诱变技术产生。
这种变体包括通过核苷酸取代，缺失或加入产生的那些变体。取代，缺失或加入可包括一或多个核苷酸。变体可以在编码区，非编码区或二区均有改变。在编码区内改变可产生保守或非保守氨基酸取代、缺失或加入。其中特别优选的是沉默取代，加入和缺失，其不改变KDI蛋白或其部分的性质和活性。保守取代也是特别优选的。
其它实施方案包括一分离的核酸分子，其包括具有至少90％,优选至少95％,96％,97％,98％或99％相同于选自以下一组的多核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸(a)编码具有SEQ ID NO:2中完整氨基酸序列的KDI多肽的核苷酸序列；(b)编码具有除N-末端甲硫氨酸之外，SEQ ID NO:2完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的2-161残基)的KDI多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO:2的28～207位残基所示序列的成熟KDI多肽的核苷酸序列；(d)编码SEQ ID NO:2的165～183位残基的核苷酸序列；(e)编码由包含在克隆HKAPI15中人cDNA编码的完整氨基酸序列的核苷酸序列；(f)编码由包含在克隆HKAPI15中人cDNA编码的除N-末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列的核苷酸序列；(g)编码由包含在克隆HKAPI15中人cDNA编码的成熟多肽的氨基酸序列的核苷酸序列；和(h)互补于以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)和(h)的任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施方案包括分离的核酸分子，其包括具有至少90％，优选至少95％,96％,97％,98％或99％相同于以上(a)(b)(c)(d)(e)(f)(g)或(h)中任何核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或在严格杂交条件下与以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)或(h)中的多核苷酸杂交的多核苷酸。杂交的多核苷酸在严格杂交条件下，与具有只由A或T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸不杂交。本发明其它核酸实施方案涉及一分离的核酸分子，其包括编码具有以上(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中氨基酸序列的KDI多肽的携带表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
本发明还涉及含有本发明分离的核酸分子的重组载体，含有重组载体的宿主细胞，生产这种载体和宿主细胞的方法，及利用它们通过重组技术生产KDI多肽或肽的方法。
具有至少例如95％“相同于”编码KDI多肽的相关核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸是指除了此多核苷酸序列在编码KDI多肽的相关核苷酸序列的每100个核苷酸中包括至多5个点突变外，此多核苷酸的核苷酸序列相同于相关序列。换言之，为获得具有至少95％相同于相关核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，相关核苷酸序列中至多5％的核苷酸可以缺失或用其它核苷酸取代，或占相关序列中全部核苷酸数的5％的核苷酸可以插入相关序列中。相关序列的这些突变可发生在相关核苷序列的5’或3’末端位置，或发生于末端位置之间的任何地方，独立散在相关序列的核苷酸之间或在相关序列内一或多个连续基组中。
事实上，任何特定的核酸分子是否至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同于图1所示核苷酸序列或保藏的cDNA克隆的核苷酸序列，可常规使用已知计算机程序如Bestfit程序(WisconsinSequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics ComputerGroup,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)进行测定。Bestfit利用Smith和Waterman的局部同源性算法以发现二个序列间的最佳同源区段(Advances in Applied Mathematics2:482-489(1981))。当使用Bestfit或任何其它序列对比程序以测定一特殊序列是否例如95％相同于根据本发明的相关序列时，要设立参数，从而可以在全长相关核苷酸序列之上计算相同性百分率，并且允许相关序列中至多全部核苷酸数5％的同源性缺口。测定查询序列〔本发明的序列〕和样本序列之间最佳完全匹配，也称作总体序列对比的一种优选方法，可用基本上如Brutlag等的公式的FASTDB计算机程序测定〔Comp.App.Biosci.(1990)6:237-245〕。在一序列对比中，查询和样本序列均是DNA序列。RNA序列可通过U转变为T加以对比。所述总体序列对比结果以相同性百分率表示。用于DNA序列的FASTDB序列对比以计算百分率的优选参数是Matrix=Unitary,k-tuple=4,Mismatch Penalty=1,Joining Penalty=30,Randomization Group Length=0,Cutoff Score=l,Gap Penalty=5,GapSize Penalty=0.05,Window Size=500，或样本核苷酸序列的长度，取两者较短的。
如果样本序列因为5’或3’缺失而非因为内在缺失而比查询序列短，必须对结果进行手工校正。这是因为FASTDB程序当计算相同性百分率时未考虑到样本序列5’和3’的截短。对相对于查询序列在5’或3’末端截短的样本序列而言，相同性百分率通过计算样本序列5’和3’端的未匹配/对比的查询序列的碱基数占查询序列总碱基数的百分率加以校正。核苷酸是否匹配/对比可通过FASTDB序列对比结果确定。然后将此百分数从通过用特殊参数经FASTDB程序计算的相同性百分率中减去，以得到最终相同性百分率。此校正结果用于本发明。只计算通过FASTDB序列对比展示的不与查询序列匹配/对比的在样本序列5’和3’碱基之外的碱基以用于人为调节相同性百分率。
例如，90个碱基的样本序列与100个碱基的查询序列相对比测定相同性百分率。缺失发生在样本序列的5’端，因而FASTDB序列对比不能示出5’端头10个碱基的匹配/对比。此10个未配对的碱基代表序列的10％(在5’和3’端未匹配的碱基数/查询序列中碱基总数)，所以此10％从经FASTDB程序计算的相同性百分率中减去。如果所剩90个碱基完全匹配则最终相同性百分率为90％。在另一实施例中，一90个碱基的样本序列与100个碱基的查询序列相对比。这次缺失是内部缺失，所以在样本序列的5’或3’末端没有不与查询序列匹配/对比的碱基。在经情况中经FASTDB计算的相同性百分率不用手工校正。同样，样本序列只有5’和3’碱基不与查询序列匹配/对比时，要手工校正。本发明不需要进行其它手工校正。
本发明涉及至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同于图1(SEQ ID NO:1)所示核酸序列的或保藏的DNA的核酸序列的核酸分子，不管它们是否编码具有KDI活性的多肽。这是因为即使特殊的核酸分子不编码具有KDI活性的多肽，本领域技术人员仍知怎样用该核酸分子作为例如杂交探针或聚合酶链反应(PCR)引物。本发明使用的不编码具有KDI活性多肽的核酸分子特别包括cDNA文库中分离的等位基因变体。
然而优选的是具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同于图1(SEQ ID NO:1)所示核酸序列或保藏的DNA的核酸序列的序列的核酸分子，且该分子编码具有KDI蛋白质活性的多肽。“具有KDI活性的多肽”是指在特定生物学分析中，活性类似于但非必须相同于本发明KDI蛋白活性的多肽。例如本发明的KDI蛋白质抑制体外骨髓集落形成并可根据Tiefenthaler M.等的方法(Interferon Cytokine Res,1997,Jun；17(6):327-329，全文并入参考)分析。另外，根据由Mire-Sluis A.R.等报道的分析法(免疫学方法杂志1996.4.9；195(1-2):55-61，并入参考)，KDI可抑制GM-CSF诱导的红白血病细胞系TF-1的增殖。或者，通过本领域已知的一些分析方法，例如由Sugiyama,K等报道的分析法(YakugakuZasshi 1995 5；115(5):390-393)可分析KDI经典抗病毒活性。
在上述分析中，本发明的KDI蛋白抑制骨髓增殖并示出剂量依赖方式抗病毒活性。因此，“具有KDI蛋白活性的多肽”包括在上述分析中也呈剂量依赖方式相同活性的多肽。尽管剂量依赖活性程度不需相同于KDI蛋白的剂量依赖程度，但优选地，“具有KDI蛋白活性的多肽”与KDI蛋白相比给定活性呈基本相似剂量依赖性(即候选多肽将比相关KDI蛋白呈较高活性或其活性降低不超过大约25倍且优选不超过10倍)。
当然，由于遗传密码的简并，本领域技术人员将立即意识到大量具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同于保藏的cDNA的核酸序列或图1(SEQ ID NO:1)所示核酸序列的序列的核酸分子将编码“具有KDI蛋白活性”的多肽。事实上，由于这些核苷酸序列的简并变体都编码相同多肽，即使不进行上述对比分析，本领域技术人员也知此结果。本领域技术人员另外还知晓有适量不是简并变体的这种核酸分子也编码具有KDI蛋白活性的多肽。这是因为本领域技术人员充分知道有的氨基酸取代较少或不明显影响蛋白质功能(例如用另一个脂族氨基酸置换一个脂族氨基酸)。载体和宿主细胞本发明还涉及包括本发明分离的DNA分子的载体，用重组载体遗传工程化的宿主细胞，及通过重组技术生产KDI多肽或其片段。载体例如可以是噬菌体，质粒，病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒可以是可复制型载体或复制缺陷型载体。在后种情况下，病毒增殖通常只在互补宿主细胞中发生。
此多核苷酸可与含选择标志的载体连接以在宿主中增殖。一般地，质粒载体以沉淀物如磷酸钙沉淀物或与荷电脂质复合导入。如果载体是病毒，其可用适当包装细胞系在体外包装，然后转导入宿主细胞中。
DNA插入片段应有效地与适当启动子连接，如λ噬菌体PL启动子，E.coli lac,trp,phoA和tac启动子，SV40早期和晚期启动子和逆转录病毒LTRs的启动子。技术人员还知其它适当启动子。表达构建体还包括转录起始位点，终止位点及在转录区内的翻译核糖体结合位点。由构建体表达的转录物的编码部分优选包括恰当地位于被翻译的多肽起始端的翻译起始密码子和多肽末端合适位置的终止密码子(UAA,UGA或UAG)。
表达载体优选包括至少一个选择标记。这种标记包括对于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶，G418或新霉素抗性，对于E.coli和其它细菌培养物的四环素，卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。适当的宿主的代表性实例包括但非限于细菌细胞如E.coli，链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇S2和Spodoptera St9细胞；动物细胞如CHO,COS,293和Bowes黑素瘤细胞；及植物细胞。本领域已知上述宿主细胞的培养基和培养条件。
优选的细菌载体包括购自QIAGEN公司的pQE70,pQE60和pQE09；购自Stratagene的PBS载体，Phagescript载体，Bluescript载体，pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A；和购自Pharmacia的ptrc99a,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5。优选的真核载体是购自Stratagene的pWLNEO,pSV2CAT,pOG44,pXT1和pSG；及购自Pharmacia的pSVK3,pBPV,pMSG和pSVL。本领域技术人员也知其它适当载体。
构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，阳离子脂质介导的转染，电穿孔，转导，感染或其它方法进行。这些方法在许多标准实验手册中均有阐述，如Davis等，分子生物学基本方法(1986)。
多肽可以修饰形式表达，如融合蛋白，且不仅可包括分泌信号，也可包括其它异源功能区。例如，额外氨基酸尤其荷电氨基酸区可加入多肽的N末端，以改良其在纯化或随后的操作和贮存期间在宿主细胞中的稳定性及持续性。肽基序也可加入多肽中以促进纯化。这个区域可在最后制备多肽之前除去。将肽基序加入多肽以实现分泌或排泄，改良稳定性及促进纯化等，是本领域熟知且常规技术。一优选的融合蛋白包括来自免疫球蛋白的异源区，其用于稳定和纯化蛋白质。例如，EP-A-0 464 533(加拿大相应专利2045869)揭示了包括各种免疫球蛋白C区部分与人体蛋白或其部分的融合蛋白。在许多情况中，融合蛋白的Fc部分用于诊断和治疗是非常有利的，因此例如产生改良的药物动力学性质(EP-A023262)。另一方面，在融合蛋白在以上述有利方式表达，检测及纯化后，对于某些应用需缺失Fc部分，这是在当Fc部分证实妨碍诊断和治疗时，例如融合蛋白被用作免疫反应的抗原时的情况中。在药物开发方面，人体蛋白例如hIL-5已经与Fc部分融合以通过高通量筛选分析鉴别hIL-5的拮抗剂。参见D.Bennett等，分子识别杂志8:52-58(1995)和K.Johanson等。生物化学杂志270:9459-9471(1995)。
KDI蛋白通知熟知方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阳离子或阴离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析和凝集素层析可从重组细胞培养物中回收并纯化。更优选地用高效液相层析(HPLC)进行纯化。本发明的多肽包括纯化自天然来源包括体液，组织和细胞的产物，其可以是直接分离的或是培养；及通过重组技术产自原核或真核宿主如细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞的产物。根据用于重组生产过程的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。另外，本发明的多肽也可包括起始的修饰的甲硫氨酸残基。因此，本领域熟知由翻译起始密码子编码的N-末端甲硫氨酸一般在所有真核细胞中翻译之后，高效地从任何蛋白质中除去。尽管大多数蛋白质上的N-末端甲硫氨酸也能有效地在大多数原核细胞中除去，但根据N-末端甲硫氨酸共价键连的氨基酸的性质，对一些蛋白质而言此原核细胞除去过程是无效的。多肽和片段本发明还提供了具有由保藏的DNA编码的氨基酸序列，或SEQID NO:2中氨基酸序列的分离的KDI多肽，或含有上述多肽一部分的肽或多肽。变体和突变多肽为改良或改变KDI多肽的特性，可应用蛋白质工程。本领域技术人员已知的重组DNA技术可用于产生新的突变体蛋白或“突变蛋白”，包括单或多个氨基酸取代，缺失，加入或融合蛋白。这种修饰的蛋白可示出例如增强的活性或提高的稳定性。另外，它们可以高产量纯化并比相应的天然多肽至少在一定纯化和贮存条件下呈现更好的溶解性。N-末端和C-末端缺失突变体例如，对一些蛋白质包括膜相关蛋白的胞外区或分泌蛋白的成熟形式而言，本领域已知一或多个氨基酸可从N-末端或C-末端缺失而基本不丧失生物功能。例如，Ron等在生物化学杂志268:2984～2988(1993)报道了修饰的KGF蛋白即使缺失3,8或27个氨基末端的氨基酸残基，仍具有肝素结合活性。在本文中，由于本发明的蛋白质是干扰素多肽家族成员，SEQ ID NO:2N末端氨基酸直至SEQ ID NO:2所示59位半胱氨酸的缺失仍可保留一些生物活性如抗病毒活性或抑制骨髓增殖。具有包括SEQ ID NO:2中Cys-59残基的进一步N末端缺失的多肽不能保留这种生物功能，因为干扰素相关多肽中的此残基在一些(非全部)家族成员中是保守的，紧邻其的亮氨酸残基(60位残基)也是如此。在59位的半胱氨酸残基被认为是形成二硫键之所需，以保证为受体结合及信号转导之所需的结构稳定性。
然而，即使一或多个氨基酸从蛋白质N末端缺失导致蛋白质一或多种生物功能丧失变化，其它生物活性仍可保留。因此，缩短的蛋白质诱导和/或结合识别完整蛋白质的抗体的能力，当少于半数的完整蛋白质残基从N末端除去时一般仍被保留。缺失完整蛋白质N末端残基的特定多肽是否保留这种免疫活性可通过本文所述常规方法及本领域已知其它方法测定。
因此本发明还提供了具有一或多个缺失自SEQ ID NO:2所示KDI氨基酸序列氨基末端直至Cys-59的残基的多肽，及编码这种多肽的多核苷酸。本发明尤其提供了包括SEQ ID NO:2的n-207位残基的氨基酸序列的多肽，其中n是1～59范围内的整数，且Cys-59是确信为KDI蛋白活性所需的起自完整KDI多肽(如SEQ ID NO:2所示)N-末端的第一位残基。
本发明尤其提供了具有SEQ ID NO:2的如下残基的氨基酸序列的多肽1～207,2～207,3～207,4～207,5～207,6～207,7～207,8～207,9～207,10～207,11～207,12～207,13～207,14～207,15～207,16～207,17～207,18～207,19～207,20～207,21～207,22～207,23～207,24～207,25～207,26～207,27～207,28～207,29～207,30～207,31～207,32～207,33～207,34～207,35～207,36～207,37～207,38～207,39～207,40～207,41～207,42～207,43～207,44～207,45～207,46～207,47～207,48～207,49～207,50～207,51～207,52～207,53～207,54～207,55～207,56～207,57～207,58～207和59～207，也提供了编码这些多肽的多核苷酸。
相似地，已知许多C末端缺失突变蛋白的生物功能的实例。例如，γ-干扰素通过缺失蛋白质羧基末端8～10个氨基酸残基呈现活性提高接近10倍(Dobeli等，生物技术学杂志7:199-216(1988))。在本发明中，由于本发明的蛋白质是干扰素多肽家族成员，SEQ IDNO:2的C末端氨基酸直至183位的色氨酸残基缺失仍可保留一些生物活性如抗病毒活性或抑制骨髓增殖。具有包括SEQ ID NO:2的Ile-183的进一步C-末端缺失的多肽呈现不能保留这种生物活性，因为已知干扰素相关多肽中此残基在许多成员中是保守的，且被认为对受体结合和信号转导是重要的。另外，在181位半胱氨酸是高保守的且已知是干扰素家族成员抗病毒活性所需的。
然而，即使蛋白质C末端的一或多个氨基酸缺失导致一或多种生物活性丧失，但仍可保留其它生物活性。因此缩短的蛋白质诱导和/或结合识别完整蛋白质的抗体的能力。当少于半数的完整蛋白质的残基从C末端除去时一般被保留。缺失完整蛋白质C末端残基的特定多肽是否保留这种免疫活性通过本文所述常规方法及本领域已知其它方法可易于测定。
因此本发明还提供了具有缺失自SEQ ID NO:2所示KDI氨基酸序列的羧基末端直至Trp-183的一或多个氨基酸的多肽及编码这种多肽的多核苷酸。尤其地本发明提供了具有SEQ ID NO:2氨基酸序列1～m残基的氨基酸序列的多肽，其中m是183～207范围内的任何整数，且残基Trp-183是确信为KDI蛋白活性所需的完整KDI多肽(如SEQ ID NO:2所示)C末端的第一个残基位。
更为具体地，本发明提供了具有SEQ ID NO:2的以下残基的氨基酸序列的多肽1-183,1-184,1-185,1-186,1-187,1-188,1-189,1-190,1-191,1-192,1-193,1-194,1-195,1-196,1-197,1-198,1-199,1-200,1-201,1-202,1-203,1-204,1-205,1-206和1-207。还提供了编码这些多肽的多核苷酸。
本发明还提供了具有一或多个缺失自氨基和羧基末端的氨基酸的多肽，其通常被描述为具有SEQ ID NO:2的n-m残基，其中n和m是如上所述的整数。另外，本发明提供了任选地具有N末端甲硫氨酸的这些突变体多肽。此多肽因而也可用公式X-n-m代表，其中X是NH2或Met,n和m是如上述的整数。当然也提供了编码这些多肽的多核苷酸。
更为具体地，本发明优选提供了具有SEQ ID NO:2的以下残基的氨基酸序列的多肽20-183,21-183,22-183,23-183,24-183,25-183,26-183,27-183,28-183,29-183,30-183,31-183,32-183,33-183,34-183,35-183,36-183,37-183,38-183,39-183,40-183,41-183,42-183,43-183,44-183,45-183,46-183,47-183,48-183,49-183,50-183,51-183,52-183,53-183,54-183,55-183,56-183,57-183,58-183,59-183,20-184,21-184,22-184,23-184,24-184,25-184,26-184,27-184,28-184,29-184,30-184,31-184,32-184,33-184,34-184,35-184,36-184,37-184,38-184,39-184,40-184,41-184,42-184,43-184,44-184,45-184,46-184,47-184,48-184,49-184,50-184,51-184,52-184,53-184,54-184,55-184,56-184,57-184,58-184,59-184,20-185,21-185,22-185,23-185,24-185,25-185,26-185,27-185,28-185,29-185,30-185,31-185,32-185,33-185,34-185,35-185,36-185,37-185,38-185,39-185,40-185,41-185,42-185,43-185,44-185,45-185,46-185,47-185,48-185,49-185,50-185,51-185,52-185,53-185,54-185,55-185,56-185,57-185,58-185,59-185,20-186,21-186,22-186,23-186,24-186,25-186,26-186,27-186,28-186,29-186,30-186,31-186,32-186,33-186,34-186,35-186,36-186,37-186,38-186,39-186,40-186,41-186,42-186,43-186,44-186,45-186,46-186,47-186,48-186,49-186,50-186,51-186,52-186,53-186,54-186,55-186,56-186,57-186,58-186,59-186,20-187,21-187,22-187,23-187,24-187,25-187,26-187,27-187,28-187,29-187,30-187,31-187,32-187,33-187,34-187,35-187,36-187,37-187,38-187,39-187,40-187,41-187,42-187,43-187,44-187,45-187,46-187,47-187,48-187,49-187,50-187,51-187,52-187,53-187,54-187,55-187,56-187,57-187,58-187,59-187,20-188,21-188,22-188,23-188,24-188,25-188,26-188,27-188,28-188,29-188,30-188,31-188,32-188,33-188,34-188,35-188,36-188,37-188,38-188,39-188,40-188,41-188,42-188,43-188,44-188,45-188 46-188,47-188,48-188,49-188,50-188,51-188,52-188,53-188,54-188,55-188,56-188,57-188,58-188,59-188,20-189,21-189,22-189,23-189,24-189,25-189,26-189,27-189,28-189,29-189,30-189,31-189,32-189,33-189,34-189,35-189,36-189,37-189,38-189,39-189,40-189,41-189,42-189,43-189,44-189,45-189,46-189,47-189,48-189,49-189,50-189,51-189,52-189,53-189,54-189,55-189,56-189,57-189,58-189,59-189,20-190,21-190,22-190,23-190,24-190,25-190,26-190,27-190,28-190,29-190,30-190,31-190,32-190,33-190,34-190,35-190,36-190,37-190,38-190,39-190,40-190,41-190,42-190,43-190,44-190,45-190,46-190,47-190,48-190,49-190,50-190,51-190,52-190,53-190,54-190,55-190,56-190,57-190,58-190,59-190,20-191,21-191,22-191,23-191,24-191,25-191,26-191,27-191,28-191,29-191,30-191,31-191,32-191,33-191,34-191,35-191,36-191,37-191,38-191,39-191,40-191,41-191,42-191,43-191,44-191,45-191,46-191,47-191,48-191,49-191,50-191,51-191,52-191,53-191,54-191,55-191,56-191,57-191,58-191,59-191,20-192,21-192,22-192,23-192,24-192,25-192,26-192,27-192,28-192,29-192,30-192,31-192,32-192,33-192,34-192,35-192,36-192,37-192,38-192,39-192,40-192,41-192,42-192,43-192,44-192,45-192,46-192,47-192,48-192,49-192,50-192,51-192,52-192,53-192,54-192,55-192,56-192,57-192,58-192,59-192,20-193,21-193,22-193,23-193,24-193,25-193,26-193,27-193,28-193,29-193,30-193,31-193,32-193,33-193,34-193,35-193,36-193,37-193,38-193,39-193,40-193,41-193,42-193,43-193,44-193,45-193,46-193,47-193,48-193,49-193,50-193,51-193,52-193,53-193,54-193,55-193,56-193,57-193,58-193,59-193,20-194,21-194,22-194,23-194,24-194,25-194,26-194,27-194,28-194,29-194,30-194,31-194,32-194,33-194,34-194,35-194,36-194,37-194,38-194,39-194,40-194,41-194,42-194,43-194,44-194,45-194,46-194,47-194,48-194,49-194,50-194,51-194,52-194,53-194,54-194,55-194,56-194,57-194,58-194,59-194,20-195,21-195,22-195,23-195,24-195,25-195,26-195,27-195,28-195,29-195,30-195,31-195,32-195,33-195,34-195,35-195,36-195,37-195,38-195,39-195,40-195,41-195,42-195,43-195,44-195,45-195,46-195,47-195,48-195,49-195,50-195,51-195,52-195,53-195,54-195,55-195,56-195,57-195,58-195,59-195,20-196,21-196,22-196,23-196,24-196,25-196,26-196,27-196,28-196,29-196,30-196,31-196,32-196,33-196,34-196,35-196,36-196,37-196,38-196,39-196,40-196,41-196,42-196,43-196,44-196,45-196,46-196,47-196,48-196,49-196,50-196,51-196,52-196,53-196,54-196,55-196,56-196,57-196,58-196,59-196,20-197,21-197,22-197,23-197,24-197,25-197,26-197,27-197,28-197,29-197,30-197,31-197,32-197,33-197,34-197,35-197,36-197,37-197,38-197,39-197,40-197,41-197,42-197,43-197,44-197,45-197,46-197,47-197,48-197,49-197,50-197,51-197,52-197,53-197,54-197,55-197,56-197,57-197,58-197,59-197,20-198,21-198,22-198,23-198,24-198,25-198,26-198,27-198,28-198,29-198,30-198,31-198,32-198,33-198,34-198,35-198,36-198,37-198,38-198,39-198,40-198,41-198,42-198,43-198,44-198,45-198,46-198,47-198,48-198,49-198,50-198,51-198,52-198,53-198,54-198,55-198,56-198,57-198,58-198,59-198,20-199,21-199,22-199,23-199,24-199,25-199,26-199,27-199,28-199,29-199,30-199,31-199,32-199,33-199,34-199,35-199,36-199,37-199,38-199,39-199,40-199,41-199,42-199,43-199,44-199,45-199,46-199,47-199,48-199,49-199,50-199,51-199,52-199,53-199,54-199,55-199,56-199,57-199,58-199,59-199,20-200,21-200,22-200,23-200,24-200,25-200,26-200,27-200,28-200,29-200,30-200,31-200,32-200,33-200,34-200,35-200,36-200,37-200,38-200,39-200,40-200,41-200,42-200,43-200,44-200,45-200,46-200,47-200,48-200,49-200,50-200,51-200,52-200,53-200,54-200,55-200,56-200,57-200,58-200,59-200,20-201,21-201,22-201,23-201,24-201,25-201,26-201,27-201,28-201,29-201,30-201,31-201,32-201,33-201,34-201,35-201,36-201,37-201,38-201,39-201,40-201,41-201,42-201,43-201,44-201,45-201,46-201,47-201,48-201,49-201,50-201,51-201,52-201,53-201,54-201,55-201,56-201,57-201,58-201,59-201,20-202,21-202,22-202,23-202,24-202,25-202,26-202,27-202,28-202,29-202,30-202,31-202,32-202,33-202,34-202,35-202,36-202,37-202,38-202,39-202,40-202,41-202,42-202,43-202,44-202,45-202,46-202,47-202,48-202,49-202,50-202,51-202,52-202,53-202,54-202,55-202,56-202,57-202,58-202,59-202,20-203,21-203,22-203,23-203,24-203,25-203,26-203,27-203,28-203,29-203,30-203,31-203,32-203,33-203,34-203,35-203,36-203,37-203,38-203,39-203,40-203,41-203,42-203,43-203,44-203,45-203,46-203,47-203,48-203,49-203,50-203,51-203,52-203,53-203,54-203,55-203,56-203,57-203,58-203,59-203,20-204,21-204,22-204,23-204,24-204,25-204,26-204,27-204,28-204,29-204,30-204,31-204,32-204,33-204,34-204,35-204,36-204,37-204,38-204,39-204,40-204,41-204,42-204,43-204,44-204,45-204,46-204,47-204,48-204,49-204,50-204,51-204,52-204,53-204,54-204,55-204,56-204,57-204,58-204,59-204,20-205,21-205,22-205,23-205,24-205,25-205,26-205,27-205,28-205,29-205,30-205,31-205,32-205,33-205,34-205,35-205,36-205,37-205,38-205,39-205,40-205,41-205,42-205,43-205,44-205,45-205,46-205,47-205,48-205,49-205,50-205,51-205,52-205,53-205,54-205,55-205,56-205,57-205,58-205,59-205,20-206,21-206,22-206,23-206,24-206,25-206,26-206,27-206,28-206,29-206,30-206,31-206,32-206,33-206,34-206,35-206,36-206,37-206,38-206,39-206,40-206,41-206,42-206,43-206,44-206,45-206,46-206,47-206,48-206,49-206,50-206,51-206,52-206,53-206,54-206,55-206,56-206,57-206,58-206和59-206
前述每个多肽可另外包括N-末端甲硫氨酸残基。也提供了编码每个具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基的这些多肽的多核苷酸。
本发明还包括由克隆HKAPI15中人cDNA编码的完整KDI氨基酸序列的一部分组成的多肽，其中此部分不包括克隆HKAPI15中人cDNA编码的完整氨基酸序列氨基末端1～大约58位氨基酸，或羧基末端1～大约23位氨基酸，或克隆HKAPI15中人cDNA编码的完整氨基酸序列的上述氨基酸末端和羧基末端缺失的任何组合。本发明还提供了编码所有上述缺失突变体多肽的多核苷酸。其他突变体除上述蛋白质末端缺失形式之外，本领域技术也将意识到KDI多肽的一些氨基酸序列可不明显影响蛋白质结构或功能而加以改变。如果涉及这种序列中的差异，应记得在蛋白质上有确定活性的关键区。
因此，本发明还包括KDI多肽的变体，其呈现KDI多肽的活性，或其包括KDI蛋白质的如下所述部分的区域。这种突变体包括缺失，插入，倒位，重复及根据本领域已知一般规则选择的取代类型，对活性只有轻微影响。例如，Bowie,J.V.等在“译解蛋白质序列中信息对氨基酸取代的耐受性”，科学247:1306-1310(1990)中提供了关于怎样产生表型沉默氨基酸取代的指导，其中作者指明有两种主要方法研究氨基酸序列对改变的耐受性。第一种方法依赖于进化过程，其中通过自然选择接纳或排斥突变。第二种方法用遗传工程在克隆的基因的特殊位置进行氨基酸调换，并进行选择或筛选以鉴别保留功能的序列。
如作者所述，这些研究揭示蛋白质对氨基酸取代非常耐受。作者还指明氨基酸调换似乎在蛋白质的一定位置是允许的。例如，大多数隐蔽的氨基酸残基要求非极性侧链，而表面侧链的特征一般很少是保守的。其它这种表型沉默取代见于Bowie,J.U.等所述，并在此并入参考。典型的保守取代是脂肪族氨基酸Ala,Val,Leu和Ile之间的彼此置换；羟基残基Ser和Thr的互换，酸性残基Asp和Glu的置换，酰胺残基Asn和Gln间的取代，碱性残基Lys和Arg的置换，及芳香族残基Phe,Tyr间的置换。
因此，SEQ ID NO:2的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽的类似物或衍生物或片段可以是(ⅰ)其中一或多个氨基酸残基是用保守或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代的，且这种取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的，或(ⅱ)其中一或多个氨基酸残基包括取代基团，或(ⅲ)其中KDI多肽是与其它化合物如提高多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合的，或(ⅳ)其中额外氨基酸与以上形式的多肽融合的，如IgG Fc融合区肽或前导或分泌序列或用于纯化以上形式多肽的序列或蛋白原序列。这种片段，衍生物及类似物根据本文教导被本领域技术人员认为包括在本发明内。
因此，本发明的多肽可以包括通过自然突变或人为操作的一或多个氨基酸取代，缺失或加入。如上所述，氨基酸改变优选是较小的，如不明显影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸取代。
本发明KDI蛋白质中为功能所必需的氨基酸可以通过本领域已知方法鉴别，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244:1081～1085(1989)。后一种方法在分子中的每个残基引入单丙氨酸突变。然后测试所得突变体分子的生物活性，如受体结合或体外增殖活性。
特别感兴趣的是用可生产具有所需明显改良特性如较少聚集性的其它极性或中性氨基酸取代极性氨基酸。聚集在制备药物配方时不仅降低活性还会产生问题，因为聚集物可以是免疫原性的。(Pinckard等，Clin.Exp.Immunol,2:331-340(1967)；Robbins等，Diabetes 36:838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic DrugCarrier Systems 10:307-377(1993)。
氨基酸的置换也可改变配体对细胞表面受体结合的选择性。例如，Ostade等在自然361:266-268(1993)中阐述了导致TNF-α仅与两种已知TNF受体之一选择性结合的一些突变。配体-受体结合的临界位点也可通过结构分析确定，如结晶，核磁共振或光亲和标记。(Smith等，分子生物学杂志224:899-904(1992)及Vos等，科学255:306-312(1992))。
本文所述的每个KDI多肽的特别优选的取代是在192位的精氨酸残基用赖氨酸置换(后文有时称为“R192K”)，及在193位的半胱氨酸残基用丝氨酸置换(后文有时称为“C193S”)。这些取代可在单独的KDI多肽中发现，或者它们可在相同KDI多肽中发生。编码所有前述KDI多肽的多核苷酸均含有取代。
本发明的多肽优选是分离形式的且优选是基本纯化的。重组产生的KDI多肽可以通过Smith与Johnson在基因67:31-40(1988)中所述的一步法而基本纯化。本发明的多肽也可以通过本领域熟知的蛋白质纯化方法，用本发明的抗KDI抗体从天然或重组来源中纯化。
本发明还提供了含有选自由以下一组组成的氨基酸序列的分离的KDI多肽(a)具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列的全长KDI多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列除N-末端甲硫氨酸外的全长KDI多肽的氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的2～207位残基)；(c)SEQ ID NO:2所示28～207位残基所示成熟KDI多肽的氨基酸序列；(d)SEQ ID NO:2中165～183位残基所示氨基酸序列；(e)由克隆HKAPI15中包含的人cDNA编码的全长KDI多肽；(f)由克隆HKAPI15中包含的人cDNA编码的除N末端甲硫氨酸外全长KDI多肽；及(g)由克隆HKAPI15中包含的人cDNA编码的成熟KDI多肽。
本发明的多肽还包括与上述那些多肽至少90％，优选至少95％，更优选至少96％,97％,98％或99％相似的多肽。本发明的多肽还包括与由保藏的DNA编码的多肽或SEQ ID NO:2的多肽至少80％，优选至少90％或95％，更优选至少96％,97％,98％或99％相同的多肽，且也包括具有这种多肽至少10,20或30个氨基酸且更优选至少50个氨基酸的一部分。
本发明的另一实施方案涉及一种肽或多肽，其包括具有含有至少一个保守氨基酸取代，但不超过50个，优选不超过40个，更优选不超过30个，特别优选不超过20个保守氨基酸取代的氨基酸序列的KDI多肽的氨基酸序列。当然，这种肽或多肽最优选的是包括KDI多肽氨基酸序列的氨基酸序列，其含有至少一个，但不超过10,9,8,7,6,5,4,3,2或1个保守氨基酸序列。
两种多肽的“相似百分率”是指用Bestfit程序(Wisconsin SequenceAnalysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575,Science Drive,Madison,WI 53711)及确定相似性的默认设定，对比两种多肽的氨基酸序列产生的相似性值。Bestfit用Smith与Waterman的局部同源性算法(Advances inApplied Mathematics 2:482-489,1981)，以发现两序列间相似的最佳区段。
具有至少例如95％“相同于”参照的IL-20多肽的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽是指除了此多肽序列在参照的IL-20多肽的氨基酸序列的每100个氨基酸中包括至多5个氨基酸改变，此多肽的氨基酸序列相同于查询序列。换言之，为获得具有至少95％相同于查询氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，查询序列中至多5％的氨基酸残基可以缺失或用其它氨基酸取代，或占总氨基酸残基数5％的氨基酸可插入参照序列。参照序列的这些变化可发生在参照序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何地方，独立散在参照序列的残基间或在参照序列间的一或多个连续组中。
事实上，任何特殊多肽是否至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同于例如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或由保藏的cDNA克隆编码的氨基酸序列，通常可用已知计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Prive,Madison,W153711)确定。当用Bestfit或其它序列对比程序确定一特殊序列是否例如95％相同于本发明的参照序列时，当然要设立参数，如此在全长参照序列之上计算相同性百分率，且允许参照序列中有至多占总氨基酸残基数5％的同源缺口。一种优选的确定查询序列(本发明的序列)与样本序列间最佳总体配对的方法，也称作总体序列对比，可以用基本上如Brutlay等的算法的FASTDB计算机程序确定(Comp.App.Biosci(1990)6；237-245)。在序列对比中，查询和样本序列均是核苷酸序列或均是氨基酸序列。所述总体序列对比的结果以相同性百分率表示。用于FASTDB氨基酸序列对比中的优选参数是Matrix=PAM,k-tuple=2,Mismatch Penalty=1,JoiningPenalty=20,Randomization Group Length=0,Cutoff Score=1,WindowSize=序列长，Gap Penalty=5,Gap Size Penalty=0.05,Window Size=500或样本氨基酸序列的长度，取较短的。
如果样本序列由于N-或C-末端缺失而不是因为内部缺失而比查询序列短，必须对结果进行手工校正，这是因为FASTDB程序当计算总体相同性百分率时未考虑到样本序列N-和C-末端截短。对与查询序列相比在N端和C端截短的样本序列，相同性百分率通过计算样本序列N和C-端的未匹配/对比的查询序列残基数占查询序列总碱基百分率加以校正。残基是否配对/对比通过FASTDB序列对比结果可确定。然后将此百分数从相同性百分率中减去以得到最终相同性百分率范围，相同性百分率是用特殊参数通过以上FASTDB程序计算的。此最终相同性百分率即为本发明所用。只有未与查询序列配对/对比的样本序列的N和C端残基需要人为调节相同性百分率范围。即只有查询残基位在样本序列最远的N和C端残基之外。
例如，90个氨基酸残基的样本序列与100个残基的查询序列对比确定相同性百分率。缺失发生在样本序列的N端，因而FASTDB序列对比未示出N端头10个残基的配对/对比。这10个未配对的残基代表序列的10％(在N和C端未配对的残基数/查询序列中总残基数)，因此这10％从通过FASTDB程序计算的相同性百分率中减去。如果剩余的90个残基充分配对，则最终相同性百分率为90％。在另一实施例中，90个残基的样本序列与100个残基的查询序列相对比。这次缺失是内部缺失，因而在样本序列的N或C端没有不与查询序列配对/对比的残基。在这种情况中，通过FASTDB计算的相同性百分率不用手工校正。同样，只有样本序列N和C端外侧的残基位不与查询序列配对/对比时，通过FASTDB计算结果需要手工校正。本发明不需其它手工校正。
本发明的多肽可用本领域技术人员熟知的方法用作SDS-PAGE凝胶上或分子筛凝胶过滤柱上的分子量标记。
如下所述，本发明的多肽还可用于产生多克隆和单克隆抗体，其用于如下所述检测KDI蛋白质表达的分析中，或作为能增强或抑制KDI蛋白质功能的兴奋剂与拮抗剂。另外，这种多肽可用于酵母双重杂交系统以“捕捉”KDI蛋白结合蛋白，其也是根据本发明的候选兴奋剂和拮抗剂。此酵母双重杂交系统见于Fields和Song，自然340:245-246(1989)中所述。携带表位部分另一方面，本发明提供了包括本发明多肽携带表位部分的肽或多肽。此多肽部分的表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指当整个蛋白质是免疫原时激发抗体应答的蛋白质的一部分。另一方面，“抗原性表位”是指抗体能结合的蛋白质分子的一区域。蛋白质免疫原性表位数通常少于抗原性表位数。例如参见于Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1983)。
为选择具有抗原性表位的肽或多肽(即含有蛋白质分子的抗体能结合的区域)，本领域熟知模拟蛋白质序列部分的相对短的合成肽通常能激发与部分模拟的蛋白质反应的抗血清。例如见于Sutcliffe,J.G.Shinnick,T.M.,Green,N.and Learner,R.A.(1983)“与蛋白质上预确定位点反应的抗体”，科学219:660～666。能激发蛋白质反应性血清的肽通常以蛋白质的一级序列代表，能通过一系列简便化学规则定性，并被限定为既不是完整蛋白质的免疫优势区(即免疫原性表位)，也不是氨基或羧基端。本发明的具有抗原性表位的肽与多肽因而用于产生抗体，包括与本发明多肽特异结合的单克隆抗体。例如参见Wilson等，细胞37:767-778(1984)，在777页。
本发明的携带抗原性表位的肽和多肽优选含有至少7个，更优选至少9个，最优选大约15～30个包含于本发明多肽的氨基酸序列中的氨基酸的序列。可用于产生KDI特异抗体的抗原性多肽或肽的非限制性实例包括包含SEQ ID NO:2中大约Ser49～Ser54氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Cys59～Ala65氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Pro78～Tyr88氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Hisl01～Gln113氨基酸残基的多肽；包含SEQ IDNO:2中Glnl20～Glu123氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Cys128～Pro155氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Leu160～Arg168氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Asn171～Asp180氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Val186～Cys193氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Phe 204～Lys207氨基酸残基的多肽。这些多肽片段通过Jameson-Wolf抗原性指数分析已确定其携带KDI蛋白质的抗原性表位，如图3所示。
本发明的携带表位的肽和多肽可通过常规方式生产。例如见于Houghten,RA.(1985)“快速固相合成大量肽的常用方法在单独氨基酸水平抗原-抗体相互作用的特异性”Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5131～5135；此“同时大量肽合成(SMPS)”法还见于Houghten等(1986)在美国专利No.4631211中所述。
本发明的携带表位的肽与多肽根据本领域熟知方法用于诱导抗体。例如见于Sutcliffe等；前述，Wilson等；前述，Chow,M等Proc.Natl.Accd.Sci.USA 82:910-914；及F.J.等，J.Gen.Virol 66:2347-2354(1985)所述。本发明的携带免疫原性表位的肽，即当整个蛋白质是免疫原时，激发抗体应答的蛋白质的那些部分，根据本领域已知方法鉴别。例如见于Geysen等所述。另外，Geysen(1990)的美国专利No.5194392阐述了一种检测或确定是表位拓扑学等价物(即“mimotope”)的单体(氨基酸或其它化合物)序列的方法，该单体序列互补于相应抗体的特殊互补位(抗原结合位点)。Geysen(1989)的美国专利No.443092阐述了一种检测或确定是配体拓扑等价物的单体的序列的方法，该单体序列互补于相应特定受体的配体结合位点。相似地，Houghten,R.A.等(1996)关于过烷基化的寡肽混合物的美国专利No.5480971揭示了线性C1-C7-烷基过烷基化寡肽及这种肽的系列及文库，以及用这种寡肽系列及文库确定优先与相应受体分子结合的过烷基化的寡肽的序列的方法。因此，本发明携带表位的肽的非肽类似物也可通过这些方法常规生产。
融合蛋白质本领域技术人员将懂得本发明的KDI多肽和上述其携带表位的片段可与免疫球蛋白(IgG)的恒定区部分组合，产生嵌合多肽。这些融合蛋白促进纯化，并呈现体内半衰期延长。例如已经揭示由人CD4-多肽的头两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重或轻链恒定区的各个结构域组成的融合蛋白(EPA394827:Traunecker等；自然331:84-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫键二聚体结构的融合蛋白在结合及中和其它分子方面比单体KDI蛋白或蛋白质片段更有效(Fountoulakis等，生物化学杂志270:3958-3964(1995))。
抗体用于本发明的KDI蛋白质特异抗体可针对完整KDI蛋白或其抗原性多肽片段而产生，其可与载体蛋白如动物(如兔或鼠)的白蛋白一起呈递，或者如果其足够长(至少大约25个氨基酸)，则不用载体。
本文所用术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)包括能与KDI蛋白特异结合的完整分子以及抗体片段(例如Fab和F(ab’)2片段)。Fab和F(ab’)2片段缺少完整抗体的Fc片段，从循环中更快速清除，并可以具有低于完整抗体的非特异组织结合性(Wahl等，J.Nucl.Med 24:316-325(1983))。因此这些片段是优选的。
本发明的抗体可通过各种方法制备。例如，可将表达KDI蛋白质或其抗原性片段的细胞施用于动物，以诱导含有多克隆抗体的血清产生。在一优选方法中，预先制备KDI蛋白质并纯化以使其基本上没有天然污染物。然后将这种制备物导入动物以产生较高特异活性的多克隆抗血清。
在一更优选的方法中，本发明的抗体是单克隆抗体(或其KDI蛋白质结合片段)。这种单克隆抗体可用杂交瘤技术学制备(Kohler等，自然256:495(1975)；Kohler等，欧洲免疫学杂志6:511(1976)；Kohler等，欧洲免疫学杂志6:292(1976)；Hammerling等，单克隆抗体及T细胞杂交瘤，Elsevier,N.Y.,(1981)PP 563-681)。一般地，这种方法包括用KDI蛋白质抗原或优选地用表达KDI蛋白质的细胞接种动物(优选鼠)。通过其结合抗KDI蛋白质抗体的能力可识别适当的细胞。这种细胞可在任何适当组织培养基中培养；但优选在补加10％胎牛血清(在大约56℃灭活)，并补加大约10g/l非必需氨基酸，大约1000U/ml青霉素，及大约100μg/ml四环素的Earle改良的Eagle培养基中培养细胞。提取这种鼠的脾细胞并与适当骨髓瘤细胞系融合。根据本发明可使用任何适当的骨髓瘤细胞系，然而优选应用购自美国典型培养物保藏中心Rockville,Maryland的亲代骨髓瘤细胞系(SP20)。在融合后，所得杂交瘤细胞选择性地保持在HAT培养基中，然后如Wands等所述(Gastroenterology 80:225-232(1981))通过限制稀释克隆。然后分析通过这种选择获得的杂交瘤细胞以鉴别分泌能结合KDI蛋白质抗原的抗体的克隆。
或者，能结合KDI蛋白质抗原的其它抗体可通过用抗独特型抗体以二步方法生产。这种方法利用抗体本身也是抗原这一事实，且因而能获得结合第二种抗体的抗体。根据这种方法，KDI蛋白质特异抗体用于接种动物，优选鼠。然后将这种动物的脾细胞用于生产杂交瘤细胞，并筛选此杂交瘤细胞以鉴别能产生抗体的克隆，其结合KDI蛋白质特异抗体的能力可由KDI蛋白质抗原阻断。这种抗体包括KDI蛋白质特异抗体的抗独特型抗体，并能用于接种动物以诱导其它KDI蛋白特异抗体形成。
应意识到本发明的Fab和F(ab’)2及其它抗体片段可根据本文所示方法使用。这种片段典型地用酶如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab’)2片段)，通过蛋白酶解而产生。或者，KDI蛋白结合片段可通过应用重组DNA技术学或合成化学而产生。
对人体内应用抗KDI而言，可优选使用“人化的”嵌合单克隆抗体。这种抗体可用衍生自上述产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的遗传构建体产生。本领域已知生产嵌合抗体的方法。参见Morrison，科学229:1202(1985)；Oi等，生物技术4:214(1986)；Cabilly等，美国专利No.4816567；Taniguchi等，EP171496；Morrison等，EP173494；Neuberger等，WO 8601533；Robinson等，WO8702671；Boulianne等，自然312:643(1984)；Neuberger等，自然314:268(1985)。
免疫系统相关疾病治疗本领域熟练技术人员还意识到，由于本发明的KDI蛋白是干扰素家族的一成员，当KDI加入个体的细胞，组织或机体时，此蛋白质将对个体的靶细胞发挥生理作用。因而应意识到由于个体干扰素活性的标准或正常水平的降低导致的疾病，尤其免疫系统疾病，可通过施用KDI多肽治疗。因此，本发明还提供了治疗需要提高干扰素水平的个体的方法，包括给这种个体施用包含一定量的本发明分离的KDI多肽的药物组合物，所述的量能有效提高这种个体干扰素活性。
介导α-IFN和β-IFN生物活性的人工类IFN受体复合物除与KDI结合外也与Ω-IFN结合。由此，KDI能临床用于抗病毒治疗，例如治疗AIDS，病毒性肝炎包括慢性乙肝，丙肝，乳头瘤病毒，病毒性脑炎及预防鼻炎及呼吸道感染。
KDI还用于治疗各种癌症(例如多毛细胞白血病，急性骨髓瘤，骨肉瘤，基细胞癌，神经胶质瘤，肾细胞癌，多发骨髓瘤，黑色素细胞瘤，及Hodgkin病)。
KDI被认为可刺激天然杀伤细胞活性。由此，KDI可用于治疗寄生虫及细菌感染，例如治疗Cryptosporidium parvum感染及耐受多种药物的肺结核。
KDI还被认为可用作免疫治疗制剂，尤其用作免疫抑制剂。例如，据信KDI抑制用促细胞分裂原或同种异体细胞，骨髓样祖细胞及其它骨髓细胞刺激的淋巴细胞增殖。由此，KDI当在化疗前施用时用作防护剂，并另外可用于治疗淋巴细胞，骨髓样祖细胞及骨髓干细胞的过高增殖，例如治疗慢性多毛细胞白血病。KDI多肽也可用于防止移植物与宿主的排斥，或缩短自身免疫疾病的进程如关节炎，多发硬化，(2)或糖尿病(3)。KDI还用于治疗哺乳动物变态反应，例如通过抑制体液应答进行。
KDI可用作佐剂或共佐剂增强或刺激预防性或治疗性接种情况下的免疫应答。
另外，本发明还提供了治疗患者感染的方法，包括给需要抗感染治疗的患者施用有效量的本发明多肽。在一优选的实施方案中，感染是病毒，细菌或寄生虫感染。在一尤为优选的实施方案中，感染是病毒感染。
另外，本发明还提供了治疗癌症患者的方法，包括给需要抗癌治疗的患者施用有效量的本发明多肽。
另外，本发明还提供了免疫治疗癌症患者的方法，包括给需要抗癌治疗的患者施用有效量的本发明多肽。
另外，本发明还提供了免疫治疗患者的方法，包括给需要免疫治疗的患者施用有效量的本发明多肽。
配方KDI多肽组合物将以公认良好医学实践，考虑到个体患者的临床条件(尤其单用KDI多肽治疗的副作用)，KDI多肽组合物的释放位点，施用方法，施用程序及其它已知临床因素而加以配制。文中KDI多肽的“有效量”通过这种考虑加以确定。
一般而言，非肠道施用的每剂KDI多肽的药物有效量在大约1μg/每公斤体重/天～10mg/每公斤体重/天范围内，当然如上所述这要进行治疗性判断。优选地，剂量至少为0.01mg/每公斤体重/天，更优选对人而言在大约0.01～10mg激素/每公斤体重/天之间。如果连续提供，KDI多肽典型地以大约1μg/每公斤体重/小时～50μg/每公斤体重/小时的速度施用，每天注射1～4次或连续皮下灌注，例如用微泵。也可使用静脉袋溶液。治疗时间需根据所需效果观测治疗后发生的反应而加以变化。
含有本发明KDI的药物组合物可以口服，直肠，非肠道，脑池内，阴道内，腹膜内，局部(以粉末，软膏，滴剂或皮贴)，颊部施用或口服或鼻喷。“药物可接受载体”是指非毒性固体，半固体或液体充填剂，稀释剂，胶囊化物或任何类型的配方辅剂。文中术语“非肠道”是指施用模式包括静脉内，肌内，腹膜内，臀部内，皮下及关节内注射与灌注。
KDI多肽也适于通过持续释放系统施用。适当的持续释放组合物例如包括有形形式的半通透聚合物基质例如薄膜或微胶囊。适当的释放基质包括聚交酯(美国专利No.3773919,EP58481),L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman,U.等，生物聚合物22:547-556(1983))，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸)(R.Langer等，J.BiomedMater Res 15:167-277(1981)，及R.Langer Chem.Tech.12:98-105(1982))，乙烯乙烯基醋酸酯(R.Langer等，Id.)或聚-D-3-羟基丁酸(EP133988)。持续释放KDI多肽组合物也包括脂质截留的KDI多肽。含有KDI多肽的脂质体通过已知方法制备，参见DE3218121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)82:3688-3692(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)77:4030-4034(1980)；EP52322；EP36676；EP88046；EP143949；EP142641；日本专利公开83-118008；美国专利4485045和4544545；及EP102324。通常地，脂质体是小的均匀片形的〔大约200-800A(埃)〕，其中脂质含量高于大约30mol％胆固醇，选择调整的比例以使KDI多肽治疗最佳化。
在一实施方案中，对非肠道施用而言，KDI多肽通常通过以所需纯度，以单位剂量可注射形式(溶液，悬浮液或乳状液)与药物可接受载体混合而配制，该载体在所用剂量及浓度对受体无毒性，且可与配方其它中配料相容。例如，配方优选不包括氧化剂及其它已知对多肽有害的化合物。
通常地，通过将KDI多肽均匀及密切地与液体载体或细分散的固定载体或二者接触而制备配方。然后如果需要，将产物制成所需形状。优选地此载体是非肠道载体，更优选与受体血液等渗的溶液。这种载体例如包括水，生理盐水，Ringer’s液及葡萄糖液。本发明还使用非水相载体如固定的油及油酸乙酯，以及脂质体。
载体适当地含有微量添加剂如增强等渗性及化学稳定性的物质。这种物质在所用剂量及浓度对受体是无毒的，且包括缓冲剂如磷酸，柠檬酸，琥珀酸，乙酸，及其它有机盐及其盐；抗氧化剂如抗坏血酸(VC)；低分子量(少于10个残基)多肽，例如聚精氨酸或三肽；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；疏水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸及精氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡离子如钠离子；和/或非离子表面活性剂如Polysorbates,Poloxamers，或PEG。
KDI多肽典型地以大约0.1mg/ml～100mg/ml，优选1-10mg/ml浓度，pH大约为3～8条件配制在这种载体中。应知道使用前述的某些赋形剂，载体或稳定剂将导致KDI多肽盐产生。
用于治疗的KDI多肽必须是无菌的。通过无菌过滤膜(例如0.2微米膜)过滤很容易达到无菌。治疗性KDI多肽组合物通常置于具有便携无菌设备的容器中，如静脉内溶液包或具有可通过皮下注射针穿刺塞子的小瓶。
KDI多肽通常以单位剂量或多剂量含量贮存，例如封蜡安瓿或小瓶，以水溶液或冻干配方贮存以重配。冻干配方例如是在10ml小瓶中充填5ml过滤的无菌1％(w/v)KDI多肽水溶液，然后将所得混合物冻干。灌注液通过用无菌注射用水注入冻干的KDI多肽而制备。
本发明还提供了药物包或试剂盒，其包括一或多种本发明药物组合物的配料充填的一或多个容器，这种容器中还附有政府机构对药物或生物制品的生产，使用或销售调节的告示，该告示反映了政府机构对人施用的这些药物或生物制品的生产，使用及销售的认可。另外，本发明的多肽可与其它治疗性化合物联合应用。
兴奋剂及拮抗剂-分析和分子本发明还提供了筛选化合物的方法，以鉴别那些增强或破坏KDI对细胞的作用，如其与KDI结合分子如受体分子的相互作用的化合物。兴奋剂是一种提高KDI天然生物功能或与KDI功能相似的化合物，而拮抗剂降低或消除其功能。
本发明此实施方案另一方面提供了鉴别受体蛋白或其它与KDI多肽特异结合的配体结合蛋白的一种方法。例如，细胞区室，如细胞膜或其制备物可从表达结合KDI的分子中制备。将此制备物与标记的KDI保温。根据本领域已知常规方法分离并定性KDI和与受体或其它结合蛋白结合的KDI复合物。或者，KDI多肽可与固体支持物结合，由此从细胞中溶解的结合分子可与柱结合，然后根据常规方法洗脱及定性。
在本发明关于兴奋剂与拮抗剂的分析中，细胞区室如细胞膜或其制备物可从表达结合KDI的分子的细胞中制备，该分子如通过KDI调节的信号或调节途径的分子。此制备物用标记的KDI在没有或有可能是KDI拮抗剂或兴奋剂的候选分子情况下进行培养。候选分子与结合分子的结合能力通过标记配体结合降低而反映。无缘由结合的分子，即不诱导KDI对KDI结合分子的结合作用，是良好的拮抗剂。与KDI结合良好且激发与KDI相同或相近作用的分子是兴奋剂。
测定潜在的兴奋剂与拮抗剂的类KDI作用例如可通过在候选分子与细胞或适当的细胞制备物相互反应之后，确定第二信使系统活性，并对比KDI或分子激发同KDI相同作用的能力而进行。用于此目的的第二信使系统包括但非限于AMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌苷水解第二信使系统。
另一种对KDI拮抗剂的分析例如是竞争分析，其是在适当条件下组合KDI和潜在拮抗剂及膜结合的KDI受体分子或重组KDI受体分子，以进行竞争抑制分析。KDI可被标记如经放射标记，这样可准确确定与受体分子结合的KDI分子数目，以评价潜在拮抗剂的效力。
潜在拮抗剂包括与本发明多肽结合的小的有机分子，肽，多肽及抗体，从而抑制或消除其活性。潜在拮抗剂还可以是与结合分子上相同位点结合的小的有机分子，肽，多肽如密切相关的蛋白质或抗体，而不诱导KDI诱导的活性，从而通过使KDI不能结合阻止KDI功能。
其它潜在拮抗剂包括反义分子。反义技术通过反义DNA或RNA或通过三螺旋形成用于控制基因表达。反义技术例如由Okano,J.Neurochem.56:560(1990)“寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制物”CRC出版社，Boca Raton,FL(1988)所揭示。三螺旋形成例如见于Lee等，核酸研究6:3073(1979)；Coony等，科学241:456(1988)；及Dervan等，科学251:1360(1991)所揭示。这些方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。例如，编码本发明成熟多肽的多核苷酸的5’编码区可用于设计长度大约为10～40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。设计一与参与转录的基因区互补的DNA寡核苷酸，从而阻止转录和KDI产生。此反义RNA寡核苷酸与mRNA体内杂交并破坏mRNA分子翻译为KDI多肽。上述寡核苷酸也可输入细胞，这样反义RNA或DNA可在体内表达从而抑制KDI蛋白产生。
兴奋剂和拮抗剂可以与如上所述药物可接受载体组合应用。
拮抗剂例如可用于抑制干扰素活性，例如在化疗后刺激骨髓和造血原细胞增殖，任何上述拮抗剂均可与如后文所述药物可接受载体组合应用。
本发明参考以下例证非限制性的实施例将更易于理解。
实施例1在E.coli克隆和表达KDI新的pHE4系列细菌表达载体，尤其pHE4a载体在本实施例中用于细菌表达。(QIAGEN,Inc.9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA，91311)pHE4-5/KDI载体质粒DNA含有插入在单一限制酶位点NdeⅠ和Asp 718之间的编码图1所示多核苷酸的DNA。此构建体为本领域技术人员的方便于1998年2月25日保藏于ATCC，保藏号No.209645。
pHE4a细菌表达载体包括供选择的新霉素磷酸转移酶基因，E.coli复制起点，T5噬菌体启动子序列，2个lac操纵基因序列，Shine-Delgarno序列，及乳糖操纵子阻抑物基因(lacIq)。这些元件的排列使得编码多肽的插入DNA片段表达具有与多肽氨基端共价键连的6个His残基(即“6×His标记”)的多肽。
编码成熟KDI蛋白的DNA序列用PCR寡核苷酸引物扩增，引物与KDI蛋白所需部分的氨基端序列及保藏构建体中cDNA编码序列3’的序列退火。含有促进在pHE4a载体中克隆的限制位点的额外核苷酸分别加至5’和3’引物序列中。
为克隆KDI蛋白编码区，5’引物序列为5’GGCCGCATATGCTGGACTGTAACTTACTG3’(SEQ ID NO:6)，下划线处为NdeⅠ限制位点，本领域技术人员将意识到蛋白质编码序列中5’引物起始点可以变化，以扩增编码完整KDI蛋白任何所需部分的DNA区段。3’引物序列为5’GGCCGCGGTACCTTATTTCCTCCTGAATAGAGC3’(SEQ ID NO:17)，划线处为Asp 718限制位点。
扩增的KDI DNA片段用NdeⅠ和Asp 718酶切，并然后将与线性化质粒连接在一起。KDI DNA插入限制的pHE4a载体中使KDI蛋白编码区在IPTG可诱导的启动子的下游及在起始AUG和6个组氨酸密码子的框架内。
用如Sambrook等所述标准方法(分子克隆实验手册，2nd Ed；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989))，将连接混合物转化入感受态E.coli细胞中。本发明实施例中使用的是含有多拷贝的质粒pREP4的E.coli菌株M15/rep4，其表达lac阻抑物并赋予卡那霉素抗性(“Kanr”)。这个唯一适于表达KDI蛋白的菌株可以商购(QIAGEN.Inc，前述)。通过其在有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上的生长能力鉴别转化体。从抗性克隆中分离质粒DNA，并通过限制性分析，PCR及DNA测序确定克隆的DNA的正确性。
含有所需构建体的克隆在补加氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的液体LB培养基中生长过夜(O/N)。此O/N培养物以大约1∶25～1∶250的稀释度用于接种大培养基。细胞生长至600nm光密度(OD 600)为0.4和0.6之间。然后加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，通过灭活lacⅠ阻抑物，诱导从lac阻抑物敏感启动子转录。接着将细胞另外培养3～4小时。然后经离心收集细胞。
细胞然后在4℃，在6M盐酸胍pH8中搅拌3～4小时。经离心除去细胞碎片，并将含有KDI多肽的上清加样于镍-腈-三乙酸(“Ni-NTA”)亲和树脂柱中(QIAGEN,Inc.)。具有6×His标记的蛋白质与Ni-NTA树脂高亲和性结合，并可用简便的一步法纯化(详见The QIAexpressionist,1995,QIAGEN,Inc)。简而言之，上清在6M盐酸胍，pH8中加样于柱上，该柱首先用10体积的6M盐酸胍，pH8洗涤，然后用10体积的6M盐酸胍pH6洗涤，最后用6M盐酸胍pH5洗脱KDI。
然后通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或50mM乙酸钠缓冲液pH6，加上200mM NaCl将纯化的蛋白质透析复性。或者，此蛋白质当固定在Ni-NTA柱上时可被充分重折叠。建议条件如下在含有蛋白酶抑制剂的500mM NaCl,20％甘油，20mM Tris/HCl pH7.4中，以线性6M～1M尿素梯度复性。复性应进行1.5小时或更长。复性后，蛋白质可通过加入250mM咪唑洗脱。咪唑通过最后用PBS或50mM乙酸钠缓冲液pH6加上200mM NaCl透析而除去，纯化的蛋白质在4℃贮存或在-80℃冷冻。
当其以包涵体形式存在时，以下另一种方法可用于纯化在E.coli中表达的KDI，除非特别指出，以下步骤均在4～10℃进行。
在E.coli发酵生产阶段结束时，细胞培养物冷却至4～10℃，并通过以15000rpm持续离心收集细胞(Heraeus Sepatech)。基于每单位重细胞糊的蛋白质的期望产量及所需纯化的蛋白质量，将适量重的细胞糊悬浮于含有100mM Tris,50mM EDTA,pH7.4的缓冲液中，用高剪切混合仪将细胞分散为均匀悬浮液。
然后将此溶液在4000～6000psi两次流经显微流化仪(Microfluidics,Corp或APV Gaulin.Inc.)将细胞裂解。匀浆然后与NaCl液混合至终浓度为0.5M NaCl，随后以7000xg离心15分钟。所得沉淀再用0.5M NaCl,100mM Tris,50mM EDTA,pH7.4洗涤。
所得洗涤的包涵体用1.5M盐酸胍(GnHCl)溶解2～4小时，在7000xg离心15分钟后，弃去沉淀并将含KDI多肽的上清在4℃培养过夜，以进行下一步的GuHCl提取。
在高速离心(30000xg)除去不溶颗粒后，通过快速混合GnHCl提取物与20体积的含50mM乙酸钠，pH4.5,150mM NaCl,2mMEDTA的缓冲液，经强力搅拌，将GnHCl溶解的蛋白质重折叠。重折叠的稀释蛋白质溶液在进一步纯化之前，在4℃不混合保持12小时。
为澄清重折叠的KDI多肽溶液，使用具有适当表面积(如Filtron)的0.16μm膜滤器，用40mM乙酸钠，pH6.0平衡的提前制备的切向过滤装置。过滤的样品加样于阳离子交换树脂(如PorosHS-50,Perseptive Biosystems)上。该柱用40mM乙酸钠，pH6.0洗涤，并用含有250mM，500mM,1000mM和1500mM NaCl的相同缓冲液分步洗脱。连续监测流出物在280mm的吸光度。收集各级组分并进行进一步SDS-PAGE分析。
将含有KDI多肽的组分集中并与4体积的水混合。稀释的样品然后加样于提前制备的一系列强阴离子(Poros HQ-50,PerseptiveBiosystems)和弱阴离子(Poros CM-20,Perseptive Bio systems)交换树脂串联柱上。该柱用40mM乙酸钠pH6.0平衡。两个柱均用40mM乙酸钠，pH6.0,200mM NaCl洗涤。CM-20柱然后在0.2M NaCl,50mM乙酸钠，pH6.0至1.0M NaCl,50mM乙酸钠，pH6.5范围，用10柱体积线性梯度洗脱。在A280之下恒定监测流出物收集各级组分。然后集中含有KDI多肽的组分(例如通过16％SDS-PAGE确定)。
所得KDI多肽在上述重折叠及纯化步骤后呈95％以上的纯度。当加样5μg纯化的蛋白质时，在Commassie蓝染色的16％SDS-PAGE凝胶中未观测到主要污染带。纯化的蛋白质也进行内毒素/LPS污染测试，典型地根据LAL分析LPS污染物少于0.1ng/ml。
本发明人已产生了多个KDI表达构建体，以促进各种大小及各种系统中KDI多肽的生产。基于E.coli的构建体如下(1)pQE9:KDI.S27-K207(表达SEQ ID NO:2的27-207位氨基酸)；(2)pHE4:KDI.S27-K207(表达SEQ ID NO:2的27-207位氨基酸)；(3)pHE4:KDI.A23-K207(表达SEQ ID NO:2的23-207位氨基酸)；(4)pHE4.KDI.G24-K207(表达SEQ ID NO:2的24-207位氨基酸)；(5)pHE4.KDI.C30-K207(表达SEQ ID NO:2的30-207位氨基酸)。
实施例2在杆状病毒表达系统中克隆和表达KDI蛋白质在此实施例中，质粒穿梭载体pA2GP用于将编码KDI的克隆的DNA插入杆状病毒中，以表达KDI蛋白质，所用的杆状病毒前导序列及标准方法如Summer等，杆状病毒载体及昆虫细胞培养方法手册，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555(1987)所述。此表达载体含有苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，后接杆状病毒gp67蛋白的分泌性信号肽(前导序列)及常规限制位点如BamHⅠ,XbaⅠ和Asp718。猴病毒40(SV40)的聚腺苷酸化位点用于有效地聚腺苷酸化。为便于选择重组的病毒，此质粒含有在弱果蝇启动子控制下相同方向的E.coli β-半乳糖苷酶基因，后接多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。插入的基因位于与野生型病毒DNA经细胞介导的同源重组的病毒序列两侧翼，以产生表达克隆的多核苷酸的活病毒。
本领域技术人员充分意识到许多其它杆状病毒载体可代替以上载体而使用，如pAc373,pVL941和pAc IM1，只要此构建提供适当的转录，翻译，分泌等的定位信号，包括所需信号肽及框内AUG。这种载体例如由Luckow等，病毒学170:31-39(1989)所述。
编码保藏的克隆中的成熟KDI多肽的缺失AUG起始密码子及SEQ ID NO:2所示天然相关的前导序列的cDNA序列，用相应于基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增，5’引物序列为5’GGCCGGGATCCGCCATCATGAGCACCAAACCTGATATG3’(SEQ ID NO:18)，划线处为Bam HⅠ限制酶位点。3’引物序列为5’GGCCGCGGTACCTTATTTCCTCCTGAATAGAGC3’(SEQ IDNO:19)，划线处为Asp718限制酶位点。
扩增的片段用商购的试剂盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.,LaJolla,CA)从1％琼脂糖凝胶中分离出。该片段然后用BamHⅠ和Asp718酶切，并再在1％琼脂糖凝胶上纯化。
此质粒用限制酶BamHⅠ和Asp 718酶切，并任选地，用本领域已知常规方法，用牛肠磷酸酸去磷酸化。该DNA然后用商购试剂盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.,La Jolla,CA)从1％琼脂糖凝胶中分离。
片段和去磷酸化的质粒用T4DNA连接酶连在一起。用连接混合物转化E.coli HB 101或其它适当E.coli宿主如XL-1 Blue(Statagene Cloning Systems,La Jolla,CA)并涂布于培养平板上。用BamHⅠ和Asp 718酶切个各菌落的DNA，然后经凝胶电泳分析酶切产物，鉴定细菌含有具有人KDI基因的质粒。克隆的片段的序列通过DNA测序确定。此质粒在此称为pA2GPKDI。
用Felgner等，Proc Natl Acad Sci USA 84:7413-7417(1987)所述脂转染法，将5μg质粒pA2GPKDI与1.0μg商购线性化的杆状病毒DNA(“Baculo GoldTMbaculovirus DNA”,Pharmingen,San Diego,CA)共转染。将1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg质粒pA2GPKDI混合在含50μl无血清Grace’s培养基的微滴定平板的无菌孔中(Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)随后加入10μl Lipofectin和90μl Grace’s培养基，混合，并在室温培养15分钟。转染混合物然后滴加入Sf9昆虫细胞中(ATCC CRL 1711)，该细胞种植于具有1ml无血清Grace’s培养基的35mm组织培养平板中。此平板在27C培养5小时，然后从平板中除去转染溶液，并加入1ml补加10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基，在27℃持续培养4天。
四天后，收集上清，并如Summer和Smith(前述)所述进行噬斑分析。具有“Blue Gal”(Life Technoligies Inc.,Gaithersburg)的琼脂糖凝胶使产生兰染噬斑的gal表达克隆易于鉴别及分离。(关于此类“噬斑分析”可见于昆虫细胞培养使用手册及由LifeTechnologies Inc.,Gaithersburg,P 9-10所分类的杆状病毒学)。在适当培养后，用微量移液管的尖端(如Eppendorf)挑取兰染的噬斑。含有重组病毒的琼脂然后重悬浮于含200μl Grace’s培养基的微离心管中，并将含有重组杆状病毒的悬浮液施加于种植于35mm平皿中的昆虫Sf9细胞中。4天后收集这些培养平皿的上清，然后在4℃贮存。此重组病毒称为V-KDI。
为检定KDI基因的表达，Sf9细胞在补加10％热灭活的FBS的Grace’s培养基中生长。以感染复数(MOI)大约为2用重组杆状病毒V-KDI感染细胞，如果放射标记的蛋白质是所需的，6小时后除去培养基，并用减去甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900IⅡ培养基(可购自Life Technologies Inc.,Rockvile,MD)置换。42小时后，加入5μCi的35S-甲硫氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(可购自Amersham)。将细胞进一步培养16小时，然后经离心收集，上清中蛋白质以及细胞内蛋白质通过SDS-PAGE，随后经自动放射自显影(如果是放射标记的)分析。
纯化的蛋白质氨基端的氨基酸序列的微测序可用于确定KDI蛋白质氨基端序列。
其它杆状病毒表达构建体如下构建(1)pA2:KDI(表达SEQ IDNO:2的1-207位残基)；(2)pA2.KDI.M7-K207(表达SEQ IDNO:2的7-207位残基)；(3)pA2gp.KDI.L28-K207(表达SEQID NO:2的28-207位残基)；(4)pA2gp.KDI.C30-K207(表达SEQ ID NO:2的30-207位残基)；(5)pA2.KDI.M1-R192(表达SEQ ID NO:2的1-192位残基)。
实施例3在哺乳动物细胞中克隆和表达KDI典型的哺乳动物表达载体包括启动子元件，其引导mRNA转录开始，蛋白质编码序列，为转录终止和转录物聚腺苷酸化所需的信号。其它元件包括增强子，Kozak序列及侧翼于供体和受体RNA剪切位点的间插序列。用SV 40的早期和晚期启动子，反转录病毒如RSV,HTLVI,HIVI的长末端重复(LTRs)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子可实现高效转录。然而，也可使用细胞元件(例如人肌动蛋白启动子)。适用于本发明的表达载体例如包括pSVL和pMSG载体(Pharmacia，Uppsala,Sweden),pRSVcat(ATCC 37152),pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)。可用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela,293,H9和Jurkat细胞，鼠NIH3T3和C127细胞，Cos1,Cos7和CV1，鹌鹑QC1-3细胞，鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
或者，基因可在含有整合入染色体中的基因的稳定细胞系中表达。用选择标记如dhfr,gpt，新霉素，潮霉素，可鉴别共转染及分别转染的细胞。
转染的基因也可扩增以表达大量编码的蛋白质，DHFR(二氢叶酸还原酶)标记用于开发携带相应基因的几百个或者甚至几千个拷贝的细胞系。其它有效选择标记是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，生物化学杂志277:227-279(1991)；Bebbington等，生物/技术学10:169-175(1992))。使用这些标记，哺乳动物细胞在选择性培养基中生长，并选择最高抗性的细胞，这些细胞系含有整合入染色体中的扩增的基因，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和NSO细胞通常用于蛋白质的生产。
表达载体pC1和pC4含有Rous肉瘤病毒(Cullen等，分子和细胞生物学，438-447(1985,3))的强启动子(LTR)，加上CMV-增强子的片段(Boshart等，细胞41:521-530(1985))。例如具有BamHⅠ,XbaⅠ和Asp 718限制酶切位点的多克隆位点，促进相应基因的克隆。除3’内含子之外，载体还含有鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化及终止信号。
在CHO细胞中克隆及表达载体pC4-Sig用于表达KDI多肽，质粒pC4-Sig是质粒pSV2-dhfr(ATCC登录号No.37146)的衍生物。其含有位于多克隆位点上游的趋化因子β-8(见US95/09508)的分泌前导序列的编码区，且被设计在插入的异源DNA框内。此质粒含有在SV40早期启动子控制下的鼠DHFR基因。用这些质粒转染的，缺失二氢叶酸活性的CHO或其它细胞，可通过将细胞在补加化疗剂氨甲喋呤的选择性培养基(α减MEM,Life Technologies)生长加以选择。抗氨甲喋呤(MTX)细胞中的DHFR基因的扩增已被充分论证(参见如Alt,F.W.,Kellems,R.M.,Bertino,JR.和Schimke,R.T.1978，生物化学杂志253:1357-1370,Hamlin,J.L.和Ma,C 1990,Biochem,et BiophysActa,1097:107-143,Page,M.J.和Sydenham,M.A.1991，生物技术学9:64-68)。细胞在MTX浓度增高下生长，由于DHFR基因扩增，导致定向酶DHFR的过量产生，引发对药物的抗性。如果第二个基因连于DHFR基因，其通常同时被扩增及过表达。本领域已知此方法可用于开发携带1000以上拷贝的扩增基因的细胞系。随后，当除去氨甲喋呤时，可获得含有整合入宿主细胞一或多条染色体中的扩增的基因的细胞系。
质粒pC4含有表达相应基因的Rouse肉瘤病毒(Cullen等，分子和细胞生物学，1985.3.:438-447)的长末端重复序列(LTR)的强启动子，加上分离自人巨细胞病毒(CMV)(Boshart等，细胞41:521-530(1985))的立即早期基因增强子的片段。启动子的下游是下述使基因整合的单限制酶切位点BamHⅠ,XbaⅠ和Asp 718。除这些克隆位点外，质粒还含有3’内含子和鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也可用于表达，例如人β-肌动蛋白启动子，SV40早期或晚期启动子，或其它逆转录病毒的长末端重复序列，例如HIV和HTLVI。Clontech的Tet-off和Tet-on基因表达系统及相似系统可用于在哺乳动物细胞中以可调节的方式表达KDI多肽。(Gossen.M.,& Bujard,H.1992,Proc.Natl Acad Sci USA89:5547-5551)。为mRNA的聚腺苷酸化，其它例如人生长素或珠蛋白基因的信号也可使用。携带整合入染色体的相应基因的稳定细胞系也可在共转染后用选择标记如gpt,G418或潮霉素选择。在开始时使用一个以上选择标记例如G 418加上氨甲喋呤是有利的。
质粒pC4用限制酶BamHⅠ和Asp 718酶切，然后用牛肠磷酸酶经本领域已知方法去磷酸化。载体然后从1％琼脂糖凝胶中分离出。
编码KDI多肽的DNA序列用相当于基因所需部分的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增。5’引物含有下划线处的BamHⅠ位点，Kozak序列及AUG起始密码子，5’引物序列为5’-GGCCGGGATCCGCCATCATGAGCACCAAACCTGATATG3’(SEQ ID NO:18)。3’引物含有下划线处的Asp 718限制位点，其序列如下5’GGCCGCGGTACCTTATTTCCTCCCTGAATAGAGC3’(SEQ ID NO:19)。
扩增的片段用内切核酸酶BamHⅠ和Asp718酶切，然后再在1％琼脂糖凝胶上纯化。分离的片段与去磷酸化的载体然后用T4 DNA连接酶连接。然后转化E.coli HB101或XL-1 Blue细胞，并用例如限制酶分析鉴别含有插入质粒pC4中的片段的细菌。
缺失活性DHFR基因的CHO细胞用于转染。将5μg的表达质粒pC4与0.5μg的质粒pSVneo用脂转染法(Felgner等，前述)共转染。质粒pSV2-neo含有显性选择标记，Tn5的neo基因，其编码赋予包括G418的一组抗生素抗性的酶。将细胞种植于补加1mg/mlG418的α减MEM培养基中。2天后，细胞用胰蛋白酶消化，并种植于补加10,25或50ng/ml氨甲喋呤加上1mg/ml G418的α减MEM培养基中的杂交瘤克隆平板(Greiner，德国)中。10-14天后，将单个克隆用胰蛋白酶消化，并种植于具有不同氨甲喋呤浓度(50nM,100nM,200nM,400nM,800nM)的6孔培养皿或10ml烧瓶中。然后将在最高氨甲喋呤浓度生长的克隆移至含有更高浓度氨甲喋呤(1μM,2μM,5μM,10μM,20μM)的新6孔平板上。重复相同步骤直至获得在100～200μM浓度生长的克隆。所需基因产物的表达通过例如SDS-PAGE及Western印迹或反相HPLC分析进行分析。
其它哺乳动物表达载体构建如下(1)pC4:KDI(表达SEQ IDNO:2的1-207残基)；(2)pC4sp:KDI.C30-K207(表达后接SEQID NO:2的30-207位残基的异源信号肽(趋化因子β-8(MPIF-1)信号肽))；及(3)pC4sp:KDI.L28-K207(表达后接SEQ ID NO:2的28～207位残基的异源信号肽(趋化因子β-8(MPIF-1)信号肽))。
应清楚本发明除前述阐述及实施例外还可以其它方式实施。根据以上教导及在权利要求范围内可对本发明做各种修改及变化。
所有引证的出版物(包括专利，专利申请，杂志，实验手册，书或其它文件)均并入参考。
关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
序列表<110>人体基因组科学有限公司等<120>角质形成细胞衍生的干扰素<130>PF482<140>未给出<141>1999-07-21<150>60/093,643<151>1998-07-21<160>21<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1170<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(35)..(655)<400>1ccacgcgtcc gggatttttt agcttgcaaa aaaa atg agc acc aaa cct gat atg 55Met Ser Thr Lys Pro Asp Met1 5att caa aag tgt ttg tgg ctt gag atc ctt atg ggt ata ttc att gct 103Ile Gln Lys Cys Leu Trp Leu Glu Ile Leu Met Gly Ile Phe Ile Ala10 15 20ggc acc cta tcc ctg gac tgt aac tta ctg aac gtt cac ctg aga aga 151Gly Thr Leu Ser Leu Asp Cys Asn Leu Leu Asn Val His Leu Arg Arg25 30 35gtc acc tgg caa aat ctg aga cat ctg agt agt atg agc aat tca ttt 199Val Thr Trp Gln Asn Leu Arg His Leu Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe40 45 50 55cct gta gaa tgt cta cga gaa aac ata gct ttt gag ttg ccc caa gag 247Pro Val Glu Cys Leu Arg Glu Asn Ile Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu60 65 70ttt ctg caa tac acc caa cct atg aag agg gac atc aag aag gcc ttc 295Phe Leu Gln Tyr Thr Gln Pro Met Lys Arg Asp Ile Lys Lys Ala Phe75 80 85tat gaa atg tcc cta cag gcc ttc aac atc ttc agc caa cac acc ttc 343Tyr Glu Met Ser Leu Gln Ala Phe Asn Ile Phe Ser Gln His Thr Phe90 95 100aaa tat tgg aaa gag aga cac ctc aaa caa atc caa ata gga ctt gat 391Lys Tyr Trp Lys Glu Arg His Leu Lys Gln Ile Gln Ile Gly Leu Asp105 110 115cag caa gca gag tac ctg aac caa tgc ttg gag gaa gac gag aat gaa 439Gln Gln Ala Glu Tyr Leu Asn Gln Cys Leu Glu Glu Asp Glu Asn Glu120 125 130 135aat gaa gac atg aaa gaa atg aaa gag aat gag atg aaa ccc tca gaa 487Asn Glu Asp Met Lys Glu Met Lys Glu Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu140 145 150gcc agg gtc ccc cag ctg agc agc ctg gaa ctg agg aga tat ttc cac 535Ala Arg Val Pro Gln Leu Ser Ser Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His155 160 165agg ata gac aat ttc ctg aaa gaa aag aaa tac agt gac tgt gcc tgg 583Arg Ile Asp Asn Phe Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp170 175 180gag att gtc cga gtg gaa atc aga aga tgt ttg tat tac ttt tac aaa 631Glu Ile Val Arg Val Glu Ile Arg Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys185 190 195ttt aca gct cta ttc agg agg aaa taagaatcat ctaccttcaa gcaagaatta 685Phe Thr Ala Leu Phe Arg Arg Lys200 205acagagattg tggctacgca aatgcaccaa aaaagggtga aatatatctg aaatgtacct 745ggttctgccc ttggaagcca cttcctgctc atgccactaa cagcatgctg ccaaactgtt 805cagattcaag attattccaa gcgcagggcc caaatgttat agccaaagaa agtcttatga 865taaaagtgag gcaaatttca gccaagaagt tagaagagat gtttaaaaga acaagaacaa 925attgtggatc atggtatatg caggctatca gcagaaggat cagacaataa aatgagttag 985tgcaaaccat ttagtaaaaa taactatcag cagagttgtt ccagattaaa aatagtacta 1045caagcttgta aaggagttag gacatgcaag ctactgagca taaaatatat acttgctatt 1105tttcatgact ttctctaata aagtctttga ctgttctctc taataaaaaa aaaaaaaaaa 1165aaaaa 1170<210>2<211>207<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Ser Thr Lys Pro Asp Met Ile Gln Lys Cys Leu Trp Leu Glu Ile1 5 10 15Leu Met Gly Ile Phe Ile Ala Gly Thr Leu Ser Leu Asp Cys Asn Leu20 25 30Leu Asn Val His Leu Arg Arg Val Thr Trp Gln Asn Leu Arg His Leu35 40 45Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe Pro Val Glu Cys Leu Arg Glu Asn Ile50 55 60Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu Phe Leu Gln Tyr Thr Gln Pro Met Lys65 70 75 80Arg Asp Ile Lys Lys Ala Phe Tyr Glu Met Ser Leu Gln Ala Phe Asn85 90 95Ile Phe Ser Gln His Thr Phe Lys Tyr Trp Lys Glu Arg His Leu Lys100 105 110Gln Ile Gln Ile Gly Leu Asp Gln Gln Ala Glu Tyr Leu Asn Gln Cys115 120 125Leu Glu Glu Asp Glu Asn Glu Asn Glu Asp Met Lys Glu Met Lys Glu130 135 140Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu Ala Arg Val Pro Gln Leu Ser Ser Leu145 150 155 160Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp Asn Phe Leu Lys Glu Lys165 170 175Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Ile Arg Arg180 185 190Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala Leu Phe Arg Arg Lys195 200 205<210>3<211>238<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr1 5 10 15Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Asn His Gly Leu20 25 30Leu Ser Arg Asn Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser35 40 45Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu50 55 60Met Val Lys Gly Ser Gln Leu Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Glu Leu100 105 110His Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly115 120 125Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Val Pro Gln Leu Ser Ser
130 135 140Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp Asn Phe Leu Lys Glu145 150 155 160Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Ile Arg165 170 175Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala Leu Pro Ala Leu Thr180 185 190Leu Arg Arg Tyr Phe Gln Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys195 200 205Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys Ser210 215 220Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys225 230 235<210>4<211>187<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser1 5 10 15Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg20 25 30Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Ash Gly Arg35 40 45Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Ash Phe Asp Ile Pro Glu Glu50 55 60Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile65 70 75 80Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser85 90 95Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val100 105 110Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu115 120 125Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys130 135 140Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser145 150 155 160His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr165 170 175Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn180 185<210>5<211>194<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Phe Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu20 25 30Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser35 40 45Pro His Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu50 55 60Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Pro Cys Arg Thr Gly Leu100 105 110His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly115 120 125Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Leu Ala Leu Lys Arg130 135 140Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp145 150 155 160Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser165 170 175Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser180 185 190Ser Pro<210>6<211>245<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr1 5 10 15Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Asn His Gly Leu
20 25 30Leu Ser Arg Asn Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser35 40 45Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu50 55 60Met Val Lys Gly Ser Gln Leu Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Glu Leu100 105 110His Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly115 120 125Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Val Pro Gln Leu Ser Ser130 135 140Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp Asn Phe Leu Lys Glu145 150 155 160Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Ile Arg165 170 175Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala Leu Pro Ala Leu Thr180 185 190Leu Arg Arg Tyr Phe Gln Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys195 200 205Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys Ser210 215 220Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Asp Arg225 230 235 240Asp Leu Gly Ser Ser245<210>7<211>189<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7Met Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr1 5 10 15Lys Ser Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu20 25 30Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Gly Gln Met Gly Arg Ile Ser35 40 45Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Arg Ile Pro Gln Glu50 55 60Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Asp Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu100 105 110Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly115 120 125Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg130 135 140Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Tyr Ser145 150 155 160Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser165 170 175Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg Leu Arg Arg Lys Asp180 185<210>8<211>189<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Met Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr1 5 10 15Lys Ser Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu20 25 30Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser35 40 45Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu50 55 60Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Glu Cln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu100 105 110Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly115 120 125Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys130 135 140Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser145 150 155 160Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser165 170 175Leu Ser Lys Ile Phe Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu180 185<210>9<211>195<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr1 5 10 15Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Asn His Gly Leu20 25 30Leu Ser Arg Asn Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser35 40 45Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu50 55 60Met Val Lys Gly Ser Gln Leu Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Glu Leu100 105 110His Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly115 120 125Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu Arg130 135 140Arg Tyr Phe Gln Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser145 150 155 160Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys Ser Leu Phe165 170 175Leu Ser Thr Asn Met Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Asp Arg Asp Leu180 185 190Gly Ser Ser195<210>10<211>378<212>PRT<213>Homo sapiens<400>10Met Pro Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr1 5 10 15Lys Ser Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu20 25 30Gly Asn Arg Arg Ala Trp Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser35 40 45His Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu50 55 60Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe65 70 75 80His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu100 105 110Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly115 120 125Val Glu Glu Ile Ala Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg130 135 140Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser145 150 155 160Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser165 170 175Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys Gly Leu Arg Arg Lys Asp Met Pro Leu180 185 190Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr Lys Ser Ile195 200 205Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg210 215 220Arg Ala Trp Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser225 230 235 240Cys Leu Lys Asp Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp245 250 255Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met260 265 270Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala275 280 285Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln290 295 300Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu305 310 315 320Ile Ala Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe325 330 335Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala340 345 350Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr355 360 365Asn Leu Gln Lys Gly Leu Arg Arg Lys Asp370 375<210>11<211>195<212>PRT<213>Homo sapiens<400>11Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Gly Arg Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Glu Asp His Met Leu20 25 30Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser35 40 45Pro His Pro Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu50 55 60Met Val Glu Gly Asn Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Cys Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu100 105 110Gln Gln Gln Leu Glu Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Pro Val Met Gly115 120 125Glu Lys Asp Ser Asp Met Gly Arg Met Gly Pro Ile Leu Thr Val Lys130 135 140Lys Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Glu Tyr Ser145 150 155 160Asp Cys Ala Trp Glu Ile Ile Arg Met Glu Met Met Arg Ala Leu Ser165 170 175Ser Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Arg Lys Met Gly Gly Asp Leu180 185 190Asn Ser Leu195<210>12<211>196<212>PRT<213>Homo sapiens<400>12Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu20 25 30Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Glu Pro Met Asn Arg Leu Ser35 40 45Pro His Ser Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu50 55 60Met Val Glu Gly Asp Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu65 70 75 80Tyr Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu100 105 110Gln Gln Gln Leu Glu Asp Leu Asp Thr Cys Cys Arg Gly Gln Val Met115 120 125Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val130 135 140Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr145 150 155 160Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu165 170 175Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp180 185 190Leu Asn Ser Pro195<210>13<211>170<212>PRT<213>Homo sapiens<400>13Met Ala Gln Ile Tyr Leu Val Met Ala Gly Val Met Leu Cys Ser Ile1 5 10 15Ser Val Cys Phe Leu Asp Gln Asn Leu Ser Ala Val His Cys Val Glu20 25 30Lys Arg Glu Ile Phe Lys His Leu Gln Glu Ile Lys Lys Ile Pro Ser35 40 45Gln Leu Cys Leu Lys Asp Arg Ile Asp Phe Lys Phe Pro Trp Lys Arg50 55 60Glu Ser Ile Thr Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr65 70 75 80Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser85 90 95Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Asp Gln Leu Leu Ser Ser Leu Asp100 105 110Leu Gly Leu Arg Arg Leu Glu His Met Lys Lys Asp Asn Met Asp Cys115 120 125Pro His Val Gly Ser Ala Leu Arg Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Gly Leu130 135 140Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg145 150 155 160Val Glu Ile Glu Arg Cys Phe Ser Leu Thr165 170<210>14<211>212<212>PRT<213>Homo sapiens<400>14Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu1 5 10 15Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro20 25 30Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr35 40 45Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile50 55 60Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser65 70 75 80Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala85 90 95Lys Glu Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu100 105 110Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr115 120 125Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln130 135 140Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn145 150 155 160Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu165 170 175Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His180 185 190Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala195 200 205Leu Arg Gln Met210<210>15<211>186<212>PRT<213>Homo sapiens<400>15Met Thr His Arg Cys Leu Leu Gln Met Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser1 5 10 15Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ser Tyr Ser Leu Leu Arg Phe Gln Gln Arg20 25 30Arg Ser Leu Ala Leu Cys Gln Lys Leu Leu Arg Gln Leu Pro Ser Thr35 40 45Pro Gln His Cys Leu Glu Ala Arg Met Asp Phe Gln Met Pro Glu Glu50 55 60Met Lys Gln Ala Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ile Leu Val Ile65 70 75 80Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ash Ile Leu Thr Arg Asp Phe Ser85 90 95Ser Thr Gly Trp Ser Glu Thr Ile Ile Glu Asp Leu Leu Glu Glu Leu100 105 110Tyr Glu Gln Met Asn His Leu Glu Pro Ile Gln Lys Glu Ile Met Gln115 120 125Lys Gln Ash Ser Thr Met Gly Asp Thr Thr Val Leu His Leu Arg Lys130 135 140Tyr Tyr Phe Asn Leu Val Gln Tyr Leu Lys Ser Lys Glu Tyr Asn Arg145 150 155 160Cys Ala Trp Thr Val Val Arg Val Gln Ile Leu Arg Asn Phe Ser Phe165 170 175Leu Thr Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Glu180 185<210>16<21l>29<212>DNA<213>Homo sapiens<400>16ggccgcatat gctggactgt aacttactg 29<210>17<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<400>17ggccgcggta ccttatttcc tcctgaatag agc 33<210>18<21l>38<212>DNA<213>Homo sapiens<400>18ggccgggatc cgccatcatg agcaccaaac ctgatatg 38<210>19<21l>33<212>DNA<213>Homo sapiens<400>19ggccgcggta ccttatttcc tcctgaatag agc 33<210>20<211>156<212>PRT<213>Homo sapiens<400>20Met Thr Tyr Arg Cys Leu Leu Gln Met Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser1 5 10 15Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ser Tyr Ser Leu Leu Arg Phe Gln Gln Arg20 25 30Gln Ser Leu Lys Glu Cys Gln Lys Leu Leu Gly Gln Leu Pro Ser Thr35 40 45Ser Gln His Cys Leu Glu Ala Arg Met Asp Phe Gln Met Pro Glu Glu50 55 60Met Lys Gln Glu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ile Leu Val Met65 70 75 80Tyr Glu Val Leu Gln His Ile Phe Gly Ile Leu Thr Arg Asp Phe Ser85 90 95Ser Thr Gly Trp Asn Ser Thr Thr Glu Asp Thr Ile Val Pro His Leu100 105 110Gly Lys Tyr Tyr Phe Ash Leu Met Gln Tyr Leu Glu Ser Lys Glu Tyr115 120 125Asp Arg Cys Ala Trp Thr Val Val Gln Val Gln Ile Leu Thr Asn Val130 135 140Ser Phe Leu Met Arg Leu Thr Gly Tyr Val Arg Asp145 150 155<210>21<211>166<212>PRT<213>Homo sapiens<400>21Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1 5 10 15Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu20 25 30Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln35 40 45Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln50 55 60Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn65 70 75 80Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn85 90 95His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr100 105 110Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg115 120 125Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr130 135 140Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145 150 155 160Thr Gly Tyr Leu Gly Asn16权利要求
1.一种分离的多核苷酸，其包含至少95％相同于选自以下一组的成员的核酸序列(a)编码SEQ ID NO:2的1～207位残基所示多肽的核苷酸序列；(b)编码SEQ ID NO:2的2～207位残基所示多肽的核苷酸序列；(c)编码SEQ ID NO:2的28～207位残基所示多肽的核苷酸序列；(d)编码SEQ ID NO:2的30～207位残基所示多肽的核苷酸序列；(e)编码SEQ ID NO:2的165～183位残基所示多肽的核苷酸序列；(f)编码由包含于克隆HKAPI15中人cDNA编码的完整多肽的核苷酸序列；(g)编码由包含于克隆HKAPI15中人cDNA编码的除N端甲硫氨酸外完整多肽的核苷酸序列；(h)编码由包含于克隆HKAPI15中人cDNA编码的成熟多肽的核苷酸序列；(i)与以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)或(h)中任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.一种分离的多核苷酸，其包含选自以下一组的核酸序列(a)编码SEQ ID NO:2的1～207位残基所示多肽的生物学活性片段的核苷酸序列；及(b)与(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列。
3.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有编码具有SEQID NO:2的165～183位氨基酸序列的KDI多肽的核苷酸序列，如图1(SEQ ID NO:1)所示。
4.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有编码具有SEQID NO:2的28～207位氨基酸序列的KDI多肽的核苷酸序列，如图1(SEQ ID NO:1)所示。
5.一种分离的核酸分子，其包含具有至少95％相同于选自以下一组的序列的核苷酸序列的多核苷酸(a)编码包含SEQ ID NO:2的n～207位残基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n是1～59范围内的一整数；(b)编码包含SEQ ID NO:2的1～m位残基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中m是183～207范围内的一整数；(c)编码具有由SEQ ID NO:2的n～m位残基组成的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n和m是分别在(a)和(b)中限定的整数；(d)编码由包含于HKPI15中人cDNA编码的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽N端缺失1～58之间的氨基酸；(e)编码由包含于HKAPI15中人cDNA编码的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽C端缺失1～23之间的氨基酸；(f)编码由包含于HKAPI15中人cDNA编码的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有(d)和(e)中所述N及C端缺失的任意组合。
6.一种分离的核酸分子，其包含在严格杂交条件下，与具有相同于权利要求1(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)或(h)中核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，其中所述多核苷酸在严格杂交条件下与具有只由A残基或T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸不杂交。
7.一种分离的核酸分子，其包含编码具有权利要求1的(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中氨基酸序列的KDI多肽携带表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
8.权利要求7的分离的核酸分子，其包含编码选自以下一组的KDI多肽携带表位部分的核酸序列包含SEQ ID NO:2中大约Ser49～Ser54氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Cys59～Ala65氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Pro78～Tyr88氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约His101～Gln113氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Gln120～Glu123氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Cys128～Pro155氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Leu160～Arg168氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Asn171～Asp180氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Val186～Cys193氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Phe204～Lys207氨基酸残基的多肽。
9.一种生产重组载体的方法，包括将权利要求1的分离的核酸分子插入载体。
10.一种通过权利要求9的方法生产的重组载体。
11.一种生产重组宿主细胞的方法，包括将权利要求10的重组载体导入宿主细胞。
12.一种通过权利要求11的方法生产的重组宿主细胞。
13.一种生产KDI多肽的重组方法，包括在所述多肽被表达的条件下培养权利要求12的重组宿主细胞，并回收所述多肽。
14.一种分离的KDI多肽，其包含至少95％相同于选自以下一组的成员的氨基酸序列(a)SEQ ID NO:2的1～207位残基所示多肽；(b)SEQ ID NO:2的2～207位残基所示多肽；(c)SEQ ID NO:2的28～207位残基所示多肽；(d)SEQ ID NO:2的165～183位残基所示多肽；(e)由包含于克隆HKAPI15中人cDNA编码的完整多肽；(f)由包含于克隆HKAPI15中人cDNA编码的除N端甲硫氨酸外的完整多肽；(g)由包含于克隆HKAPI15中人cDNA编码的成熟多肽。
15.一种分离的多肽，其包含KDI蛋白携带表位部分，其中所述部分选自以下一组包含SEQ ID NO:2中大约Ser49-Ser54氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Cys59-Ala65氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Pro78-Tyr88氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约His101-Gln113氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Gln120-Glu123氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Cys128-Pro155氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Leu160-Arg168氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Asn171-Asp180氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Val186-Cys193氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大约Phe204-Lys207氨基酸残基的多肽。
16.一种分离的抗体，其与权利要求14的KDI多肽特异结合。
17.一种分离的核酸分子，其包含具有至少95％相同于SEQ IDNO:1的至少50个连续核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸。
18.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:2的1～207位残基所示多肽生物学活性片段的氨基酸序列。
19.一种药物组合物，其包含在药物可接受载体中的权利要求14的多肽。
20.一种治疗患者病毒感染的方法，包括给患者施用权利要求19的组合物。
全文摘要
本发明涉及是干扰素家族成员的新KDI蛋白。具体地,提供了编码称为“KDI”的人干扰素多肽的分离的核酸分子,还提供了KDI多肽,用于产生该多肽的载体,宿主细胞和重组方法。本发明进一步涉及鉴别KDI活性的兴奋剂和拮抗剂的筛选方法。本发明还提供了治疗免疫系统相关疾病的治疗方法。
文档编号C12N15/09GK1319137SQ99811157
公开日2001年10月24日 申请日期1999年7月21日 优先权日1998年7月21日
发明者史蒂文·M·鲁宾, 保罗·A·穆尔, 戴维·W·拉弗勒 申请人:人体基因组科学有限公司