专利名称：检测细菌所用的基因和使用该基因检测细菌的方法
技术领域：
本发明涉及检测已知为啤酒-酸败菌的梳状菌属细菌福瑞森加梳状菌(Pectinatus frisingensis)或嗜啤酒梳状菌(Pectinatuscerevisiiphilus)所用的基因，以及使用该基因检测细菌的方法。
已知梳状菌属的细菌是啤酒-酸败菌。该属中的两种细菌，即福瑞森加梳状菌和嗜啤酒梳状菌是已知的。为了检测梳状菌属的细菌，在增殖培养和分离培养之后必须分离细菌。这至少需要7天的时间。然后，需增殖分离的细菌，并通过多个定性试验，如形态学观察，革兰氏染色，过氧化氢酶试验，对多种碳源的利用等进行检测以鉴定该细菌。
这些试验非常麻烦，既耗时，花费也大。除了这些一般性的鉴定试验外，还有一种方法可以鉴定这类细菌，即提取分离细菌的DNA，将DNA固定于膜上，使用标准的细菌DNA为探针进行杂交试验。然而，这也需要花几天的时间，而且难以得到必需的检测敏感性和选择性。
最近公开了一种检测梳状菌属细菌的方法，所述方法使用了与嗜啤酒梳状菌特异性反应的单克隆抗体(ASBC Journal:51(4)158-163,1993)。然而，该方法的检测敏感性不高。该方法存在的问题是无法检测福瑞森加梳状菌。
也有人报道过其它的检测方法，该方法可通过核糖定型(Ribotyping)法检测福瑞森加梳状菌和嗜啤酒梳状菌，所述核糖定型法能检测核糖体RNA基因的多态性(J.Am.Soc.Chem,56(1)19-23,1998)。然而，由于该方法需要分离细菌，因而会出现检测敏感性和速度问题。
考虑到这些问题，已研究出更加快速的检测方法。WO97/20071公开了检测梳状菌的方法，所述方法包括提取受试微生物的DNA并以该DNA的互补寡核苷酸为引物进行PCR。然而，该技术中所用16S rRNA基因的碱基序列有时与其它属微生物的相类似，因此，会带来以下问题，即除了检测到特定微生物外，还能检测到其它微生物。
位于16S rRNA基因和23S rRNA基因之间的间隔区内的基因具有特定的基因序列。尽管使用该基因序列检测微生物的方法已公开于日本Jozo Ronbunshu 50,22-31(1995),应用环境微生物学，vol.62,No.5,1683-1688(1996),FEMS MICROBIOL LETT,vol.84,No.3,307-312(1991)，日本专利特许公开6-98800等，但目前仍未发现梳状菌属间隔区的基因序列。
本发明的目的是提供与啤酒-酸败相关的梳状菌属所特有的位于16S rRNA基因和23S rRNA基因之间的间隔区的基因序列，本发明还提供了通过使用该序列敏感而快速地检测梳状菌属细菌的方法。
(1)第一项发明是位于福瑞森加梳状菌16S rRNA编码基因和23SrRNA编码基因之间的间隔区的基因序列，该序列含有SEQ ID NO:1所示的部分或全部碱基序列。
(2)第二项发明是位于福瑞森加梳状菌16S rRNA编码基因和23SrRNA编码基因之间的间隔区的基因序列，该序列含有SEQ ID NO:2所示的部分或全部碱基序列。
(3)第三项发明是位于嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23SrRNA编码基因之间的间隔区的基因序列，该序列含有SEQ ID NO:3所示的部分或全部碱基序列。
(4)第四项发明是位于嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23SrRNA编码基因之间的间隔区的基因序列，该序列含有SEQ ID NO:4所示的部分或全部碱基序列。
(5)第五项发明是寡核苷酸，其特征在于位于福瑞森加梳状菌16SrRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列具有至少一个下列序列组或相应的互补序列5’-CCATCCTCTTGAAAATCTC-3’①5’-TCTCRTCTCACAAGTTTGGC-3’②(6)第六项发明是寡核苷酸，其特征在于位于嗜啤酒梳状菌16SrRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列具有至少一个下列序列组或相应的互补序列5’-CACTCTTACAAGTATCTAC-3’③5’-CCACAATATTTCCGACCAGC-3’④5’-AGTCTTCTCTACTGCCATGC-3’⑤(7)第七项发明是检测福瑞森加梳状菌的方法，其中由(1)或(2)所述的基因序列制成的寡核苷酸被用作引物以合成核酸，并通过基因扩增处理核酸以检测细菌。
(8)第八项发明是检测嗜啤酒梳状菌的方法，其中由(3)或(4)所述的基因序列制成的寡核苷酸被用作引物以合成核酸，并通过基因扩增处理核酸以检测细菌。
(9)第九项发明是检测福瑞森加梳状菌的方法，其中由(1)或(2)所述的基因序列制成的寡核苷酸，或由(5)所述的基因序列制成的寡核苷酸和编码福瑞森加梳状菌16S rRNA基因的核苷酸序列被用作引物以合成核酸，并通过基因扩增处理核酸以检测细菌。
(10)第十项发明是检测嗜啤酒梳状菌的方法，其中由(3)或(4)所述的基因序列制成的寡核苷酸，或由(6)所述的基因序列制成的寡核苷酸和编码嗜啤酒梳状菌16S rRNA基因的核苷酸序列被用作引物以合成核酸，并通过基因扩增处理核酸以检测细菌。
(11)第十一项发明是如(9)所述的方法，其中编码福瑞森加梳状菌16S rRNA基因的核苷酸序列具有下列序列5’-CGTATCCAGAGATGGATATT-3’⑥(12)第十二项发明是如(10)所述的方法，其中编码嗜啤酒梳状菌16S rRNA基因的核苷酸序列具有下列序列5’-CGTATGCAGAGATGCATATT-3’⑦
图1显示出实施例3中的电泳图。
图2显示出实施例5中的电泳图。
基因扩增技术是众所周知的技术，它是通过Saiki等发展起来的聚合酶链反应法(下文简称为PCR法；科学230,1350,1985)进行的。
通过特定基因序列的扩增反应实施该方法。由于该方法显示出反应快速，敏感性和特异性高，便于操作的优点，已尝试在医学领域使用该方法快速判断病毒，或在食品领域使用该方法快速检测有害细菌。通过使用PCR法，即使受试样品中仅存在少量核苷酸序列，也能将两个引物之间的靶核苷酸序列扩增几百倍，并产生大量拷贝以供检测。为了进行PCR法，应从受试样品中的细菌内释放核酸成分。然而，在PCR法中，当靶序列中存在几个或多个分子时，扩增反应就能继续进行。因此，用裂解酶或表面活性剂简单地预处理细菌即可提供PCR法的样品。为此，检测细菌的方法优于常规的方法。
本发明提供了位于福瑞森加梳状菌或嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列。通过在PCR法中使用编码16S rRNA基因的核苷酸序列或选自该序列的寡核苷酸作为核酸合成所用的探针，并通过基因扩增处理，本发明人研究出一种快速而高度敏感的方法，可用于判断样品中福瑞森加梳状菌或嗜啤酒梳状菌的存在。
受试样品可以是啤酒或啤酒的半成品，或提取自污水的样品等等。寡核苷酸引物可以是化学合成的或天然产物。
如下文所述，在本发明的方法中，可通过PCR法检测福瑞森加梳状菌或嗜啤酒梳状菌。PCR法中使用的碱基序列是，但不限于例如上述(5),(6),(11)和(12)。PCR法中使用的引物长度是，但不限于19-20个碱基长(对上述(5),(6),(11)和(12)而言)，优选为10-50个碱基长。
当通过PCR法检测福瑞森加梳状菌时，如果联合使用①和⑥为引物扩增的DNA片断约为700个碱基对和约为900个碱基对，联合使用②和⑥为引物扩增的DNA片断约为700个碱基对和约为900个碱基对的话，即可判定细菌的存在。当通过电泳检测到这些带时，可以判定存在福瑞森加梳状菌。由于在任何情况下，引物的组合特异于福瑞森加梳状菌，因此可检测到属。通过平行使用两种组合，可以进行更精确的测定。通过改变PCR法所用引物的碱基序列，可以改变扩增的核苷酸序列的长度。
另一方面，当通过PCR法检测嗜啤酒梳状菌时，如果联合使用③和⑦为引物扩增的DNA片断约为600个碱基对，联合使用④和⑦为引物扩增的DNA片断约为650个碱基对，联合使用⑤和⑦为引物扩增的DNA片断约为700个碱基对的话，即可判定细菌的存在。当通过电泳检测到这些带时，可以判定存在嗜啤酒梳状菌。由于在任何情况下，引物的组合特异于嗜啤酒梳状菌，因此可检测到属。通过平行使用两种或更多种组合，可以进行更精确的测定。通过改变PCR法所用引物的碱基序列，可以改变扩增的核苷酸序列的长度。
在PCR法中，一个循环的温度条件是90-98℃热变性反应，其中双链DNA变为单链DNA,37-65℃退火反应，其中DNA与引物模板DNA杂交，和50-75℃链延伸反应，其中DNA聚合酶参与反应。通过几十个循环即可扩增靶序列。PCR反应之后，通过电泳分离反应产物，用溴化乙锭等染色核酸。当扩增的核苷酸序列碱基长度等于上述靶序列的碱基长度时，可以判定受试样品中存在细菌。为了检测扩增的核苷酸序列，可以使用层析。
本发明的序列描述如下SEQ ID NO:1序列长度为624，序列类型为核酸，链型为双链，拓扑结构为线形，分子类型为基因组DNA，来源为福瑞森加梳状菌DSM6306。
SEQ ID NO:2序列长度为442，序列类型为核酸，链型为双链，拓扑结构为线形，分子类型为基因组DNA，来源为福瑞森加梳状菌DSM6306。
SEQ ID NO:3序列长度为724，序列类型为核酸，链型为双链，拓扑结构为线形，分子类型为基因组DNA，来源为嗜啤酒梳状菌DSM20467。
SEQ ID NO:4序列长度为399，序列类型为核酸，链型为双链，拓扑结构为线形，分子类型为基因组DNA，来源为嗜啤酒梳状菌DSM20467。
SEQ ID NO:5序列长度为19，序列类型为核酸，链型为单链，拓扑结构为线形，分子类型为基因组DNA，来源为福瑞森加梳状菌DSM6306。
SEQ ID NO:6序列长度为20，序列类型为核酸，链型为单链，拓扑结构为线形，分子类型为基因组DNA，来源为福瑞森加梳状菌DSM6306。
SEQ ID NO:7序列长度为19，序列类型为核酸，链型为单链，拓扑结构为线形，分子类型为基因组DNA，来源为嗜啤酒梳状菌DSM20467。
SEQ ID NO:8序列长度为20，序列类型为核酸，链型为单链，拓扑结构为线形，分子类型为基因组DNA，来源为嗜啤酒梳状菌DSM20467。
SEQ ID NO:9序列长度为20，序列类型为核酸，链型为单链，拓扑结构为线形，分子类型为基因组DNA，来源为嗜啤酒梳状菌DSM20467。
SEQ ID NO:10序列长度为20，序列类型为核酸，链型为单链，拓扑结构为线形，分子类型为基因组DNA，来源为福瑞森加梳状菌DSM6306。
SEQ ID NO:11序列长度为20，序列类型为核酸，链型为单链，拓扑结构为线形，分子类型为基因组DNA，来源为嗜啤酒梳状菌DSM20467。
下列工作实施例将描述本发明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1制备受试样品将福瑞森加梳状菌DSM6306和嗜啤酒梳状菌DSM20467用作梳状菌属的细菌菌株。为了证实本发明SEQ ID NO:5,6,7,8,9,10和11所示的福瑞森加梳状菌和嗜啤酒梳状菌引物的特异性，使用了表1所示的其它细菌。在适当培养基上培养这些细菌，离心收集菌株。根据SHIN-SEIKAGAKU-JIKKEN-KOZA2，核酸I，分离和纯化，p20-21(日本生物化学学会编，Tokyo-Kagaku-Dojin)的描述提取菌株的DNA，得到DNA溶液。
表1
实施例2克隆位于福瑞森加梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区，并测定其碱基序列(1)选择并合成寡核苷酸引物以通过PCR法扩增16S/23S rRNA间隔区由于福瑞森加梳状菌16S核糖体RNA基因的碱基序列是已知的(国际系统细菌学杂志，Vol.40,p19-27(1990))，因此可在第557-576位碱基序列的基础上选择引物。
由于福瑞森加梳状菌23S核糖体RNA基因的碱基序列是已知的(系统应用微生物学，Vol.15,p487-501(1990),EMBL登记号为X48423)，因此可在第1-20位碱基序列的基础上选择引物以得到相应的互补序列。委托Sawady Technology有限公司合成这些引物。
(2)通过PCR法扩增16S/23S rRNA间隔区将实施例1中制备的0.1μg福瑞森加梳状菌DNA溶液置于0.2ml试管(Perkin-Elmer制备)中，在溶液中加入5μl 10×缓冲液(得自rTaqDNA聚合酶试剂盒，Toyobo有限公司)，3μl 25mM MgCl2,5μl 2mM dNTP混合溶液(dATP,dGTP,dCTP和dTTP),0.5μl 5个单位/μl的rTaq聚合酶和各为0.5μl的按实施例2-(1)制备的100mM引物，然后加入无菌蒸馏水至终体积为50μl。将试管置于自动基因扩增装置(PerkinElmer)的热循环仪上进行扩增反应。将反应重复30个循环，每个循环的条件如下94℃变性2.5分钟；94℃变性30秒；55℃退火引物30秒；72℃合成反应30秒。反应之后，使用5μl溶液，通过琼脂糖凝胶进行电泳。用溴化乙锭染色DNA，观察到扩增的DNA。结果表明扩增出约1600bp(下文简称为“长”)的DNA和约1400bp(下文简称为“短”)的DNA。
(3)克隆并测序间隔区“长”DNA使用高纯度的PCR产物纯化试剂盒(Baringer Manhaim)，PCR反应之后从溶液中除去未反应的dNTP。在所得100ng扩增的DNA中加入2μl质粒pCR2.1(包含在TA克隆试剂盒中，INVITROGEN)，1μl连接酶和1μl缓冲液，然后加入无菌水至总体积为10μl。将溶液置于14℃反应4小时之后，在大肠杆菌INVα’F感受态细胞中加入2μl溶液和2μl 0.5M β-巯基乙醇，置于冰上30分钟。然后将溶液加热至42℃达30秒，对细菌进行质粒转化。在经转化的细菌中加入250μl SOC培养基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl，10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃将混合物振荡60分钟，然后转移至含有50μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml X-Gal的LB平板培养基中，37℃培养过夜。将显出的白色菌落转移至3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。
培养之后，用微量质粒提取试剂盒(QIAGEN)从细菌中提取质粒。取出部分所得质粒，于37℃与限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)反应60分钟，通过琼脂糖电泳进行分离。用溴化乙锭染色DNA，证实“长”DNA片断的插入。于30℃，将500ng其余质粒与限制性酶SmaI(TOYOBO有限公司制备)反应60分钟。在反应产物中加入2μl3M醋酸钠和500μl100％乙醇，将混合物置于冰上15分钟，以15000rpm离心15分钟，除去上清液。在沉淀物中加入500μl70％乙醇，以15000rpm离心混合物15分钟，除去上清液，减压干燥10分钟。加入无菌水以溶解沉淀物，于37℃将混合物与限制性酶XbaI(Baringer Manhaim)反应60分钟。在反应产物中加入等量苯酚/氯仿(等量混合的液体)，轻柔混合，以15000rpm离心混合物15分钟，回收水层(上层)。
在回收的液体中加入等量水-饱和醚，轻柔混合，以15000rpm离心混合物15分钟以除去醚层(上层)。在残留的水层中加入2μl 3M醋酸钠和500μl 100％乙醇，将混合物置于冰上15分钟，以15000rpm离心15分钟，除去上清液。在沉淀物中加入500μl 70％乙醇，以15000rpm离心混合物15分钟，除去上清液，减压干燥残留物10分钟。加入20μl无菌蒸馏水。在5μl溶液中加入1μl包含在平端试剂盒(Takara Shuzo有限公司)中的10×缓冲液和3μl无菌蒸馏水，将混合物在70℃维持5分钟，加入1μl T4 DNA聚合酶，将混合物在37℃维持5分钟以得到平端。经搅拌灭活T4 DNA聚合酶之后，加入40μl连接溶液A和10μl连接溶液B，将混合物在16℃维持30分钟以进行内部连接。
在大肠杆菌INVα’F感受态细胞中加入2μl所得溶液和2μl 0.5Mβ-巯基乙醇，将混合物置于冰上30分钟。然后加热至42℃达30秒，用质粒转化大肠杆菌。在经转化的大肠杆菌中加入250μl SOC培养基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃将混合物振荡60分钟，然后铺于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基中，37℃培养过夜。将显出的白色菌落接种于3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。培养之后，用微量质粒提取试剂盒(QIAGEN公司)从大肠杆菌中提取质粒。
使用所得质粒为模板，进行测序反应。所用测序引物是IRD41Infrared染料标记的M13正向引物和IRD41 Infrared染料标记的M13反向引物(由Nisshinbo制备，Aroka有限公司出售)。所用反应液体是SequiTherm(商标)Long-Read(商标)循环测序试剂盒-LC(由EPICENTRE TECHNOLOGIES制备)。使用4000L Long ReadIR(商标)DNA测序系统(由LI-COR制备)测定碱基序列。
位于福瑞森加梳状菌DSM6306的16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区！“长”DNA的基因序列示于SEQ ID NO:1。
(4)克隆并测序间隔区“短”DNA使用高纯度的PCR产物纯化试剂盒(Baringer Manhaim)，按实施例2-(2)所述进行PCR反应之后，从溶液中除去未反应的dNTP。在所得100ng扩增的DNA中加入2μl质粒pCR2.1(包含在TA克隆试剂盒中，INVITROGEN),1μl连接酶和1μl缓冲液，然后加入无菌水至总体积为10μl。将溶液置于14℃反应4小时之后，在大肠杆菌INVα’F感受态细胞中加入2μ1溶液和2μl0.5Mβ-巯基乙醇，置于冰上30分钟。然后将溶液加热至42℃达30秒，对细菌进行质粒转化。在经转化的细菌中加入250μl SOC培养基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃将混合物振荡60分钟，然后转移至含有50μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml X-Gal的LB平板培养基中，37℃培养过夜。将显出的白色菌落转移至3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。培养之后，用微量质粒提取试剂盒(QIAGEN)从细菌中提取质粒。
取出部分所得质粒，于37℃与限制性酶EeoRI(Takara Shuzo)反应60分钟，通过琼脂糖电泳进行分离。用溴化乙锭染色DNA，证实“短”DNA片断的插入。于30℃，将500ng其余质粒与限制性酶SmaI(TOYOBO有限公司制备)反应60分钟。在反应产物中加入2μl3M醋酸钠和500μl100％乙醇，将混合物置于冰上15分钟，以15000rpm离心15分钟，除去上清液。在沉淀物中加入500μl 70％乙醇，以15000rpm离心混合物15分钟，除去上清液，减压干燥10分钟。加入无菌水以溶解沉淀物，于37℃将混合物与限制性酶XbaI(Baringer Manhaim)反应60分钟。在反应产物中加入等量苯酚/氯仿(等量混合的液体)，轻柔混合，以15000rpm离心混合物15分钟，回收水层(上层)。在回收的液体中加入等量水-饱和醚，轻柔混合，以15000rpm离心混合物15分钟以除去醚层(上层)。
在残留的水层中加入2μl3M醋酸钠和500μl 100％乙醇，将混合物置于冰上15分钟，以15000rpm离心15分钟，除去上清液。在沉淀物中加入500μl 70％乙醇，以15000rpm离心混合物15分钟，除去上清液，减压干燥残留物10分钟。加入20μl无菌蒸馏水。在5μl溶液中加入1μl包含在平端试剂盒(Takara Shuzo有限公司)中的10×缓冲液和3μl无菌蒸馏水，将混合物在70℃维持5分钟，加入1μl T4 DNA聚合酶，将混合物在37℃维持5分钟以得到平端。经搅拌灭活T4 DNA聚合酶之后，加入40μl连接溶液A和10μl连接溶液B，将混合物在16℃维持30分钟以进行内部连接。在大肠杆菌INVα’F感受态细胞中加入2μl所得溶液和2μl 0.5M β-巯基乙醇，将混合物置于冰上30分钟。然后加热至42℃达30秒，用质粒转化大肠杆菌。
在经转化的大肠杆菌中加入250μl SOC培养基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃将混合物振荡60分钟，然后铺于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基中，37℃培养过夜。将显出的白色菌落接种于3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。培养之后，用微量质粒提取试剂盒(QIAGEN公司)从大肠杆菌中提取质粒。
使用所得质粒为模板，进行测序反应。所用测序引物是IRD41Infrared染料标记的M13正向引物和IRD41 Infrared染料标记的M13反向引物(由Nisshinbo制备，Aroka有限公司出售)。所用反应液体是SequiTherm(商标)Long-Read(商标)循环测序试剂盒-LC(由EPICENTRE TECHNOLOGIES制备)。使用4000L Long ReadIR(商标)DNA测序系统(由LI-COR制备)测定碱基序列。
位于福瑞森加梳状菌DSM6306的16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区“短”DNA的基因序列示于SEQ ID NO:2。
实施例3通过PCR法检测福瑞森加梳状菌(1)选择并合成福瑞森加梳状菌所用引物在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的基础上，使用DNASIS(商标，Hitachi Soft Engineering有限公司)分析福瑞森加梳状菌的特定序列。结果选定SEQ ID NO:1所示的位于福瑞森加梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列第377至395位的序列，和SEQ ID NO:2所示的位于福瑞森加梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列第195至213位的序列(SEQ ID NO:5)。
另外，类似的分析选定了SEQ ID NO:1所示的位于福瑞森加梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列第361至380位的序列，和SEQ ID NO:2所示的位于福瑞森加梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列第179至198位的序列(SEQ ID NO:6)。
另外，通过编码福瑞森加梳状菌16S rRNA的基因序列选定SEQ IDNO:10所示的特异性引物。通过与实施例2-(1)相同的方法化学合成寡核苷酸。
(2)通过具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10之序列的引物检测和鉴定福瑞森加梳状菌通过PCR，用实施例3中合成的引物(SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10)处理实施例1中制备的细菌DNA溶液。PCR的温度条件如下热变性94℃，30秒退火55℃，30秒链延伸反应72℃，30秒将一个条件循环重复35次。PCR之后，以恒压l00V对所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳30分钟。同时也电泳pHY标记以作为分子量标记。电泳之后，在约0.5μg/ml溴化乙锭溶液中染色琼脂糖凝胶20分钟，用紫外线观察凝胶并摄制凝胶照片。通过观察或凝胶照片，由分子量标记的相对迁移距离测定扩增产物的碱基长度。
如图1所示，仅在福瑞森加梳状菌中检测到约700bp和约900bp的带。
由此结果看，当SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10的寡核苷酸用作PCR引物时，仅在福瑞森加梳状菌中检测到具有目的长度的带。由此可以证明，本发明的各个寡核苷酸正确地识别了位于福瑞森加梳状菌16SrRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列，和靶向16S rRNA编码基因的碱基序列。另外，在相同属的嗜啤酒梳状菌，和相对严格厌氧的细菌和革兰氏阳性细菌中未观察到具有目的长度的带。因此，本发明可以特异性地检测到福瑞森加梳状菌，同时测定该细菌。
实施例4克隆位于嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区，并测定其碱基序列(1)选择并合成寡核苷酸引物以通过PCR法扩增16S/23S rRNA间隔区由于嗜啤酒梳状菌16S核糖体RNA基因的碱基序列已公开于国际系统细菌学杂志，Vol.40,p19-27(1990)，因此可在第557-576位碱基序列的基础上选择引物。
由于嗜啤酒梳状菌23S核糖体RNA基因的碱基序列仍未公开，但福瑞森加梳状菌23S核糖体RNA基因的碱基序列已公开于系统应用微生物学，Vol.15,p487-501(1990),EMBL登记号为X48423，因此可选择引物以得到对应于福瑞森加梳状菌23S核糖体RNA基因第1-20位碱基序列的互补序列。委托Sawady Technology有限公司合成这些引物。
(2)通过PCR法扩增16S/23S rRNA间隔区将实施例1中制备的0.1μg嗜啤酒梳状菌DNA溶液置于0.2ml试管(Perkin-Elmer制备)中，在溶液中加入5μl 10×缓冲液(得自rTaqDNA聚合酶试剂盒，Toyobo有限公司)，3μl 25mM MgCl2,5μl 2mM dNTP混合溶液(dATP,dGTP,dCTP和dTTP),0.5μl5个单位/μl的rTaq聚合酶和各为0.5μl的按实施例2-(1)制备的100mM引物，然后加入无菌水至终体积为50μl。将试管置于自动基因扩增装置(Perkin Elmer)的热循环仪上进行扩增反应。将反应重复30个循环，每个循环的条件如下94℃变性2.5分钟；94℃变性30秒；55℃退火引物30秒；72℃合成反应30秒。反应之后，使用5μl反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。用溴化乙锭染色DNA，观察到扩增的DNA。结果表明扩增出约1700bp(下文简称为“长”)的DNA和约1400bp(下文简称为“短”)的DNA。
(3)克隆并测序间隔区“长”DNA使用高纯度的PCR产物纯化试剂盒(Baringer Manhaim)，PCR反应之后从溶液中除去未反应的dNTP。在所得10ng扩增的DNA中加入2μl质粒pCR2.1(包含在TA克隆试剂盒中，INVITROGEN)，1μl连接酶和1μl缓冲液，然后加入无菌水至总体积为10μl。将溶液置于14℃反应4小时之后，在大肠杆菌INVα’F感受态细胞中加入2μl溶液和2μl 0.5Mβ-巯基乙醇，置于冰上30分钟。然后将溶液加热至42℃达30秒，对细菌进行质粒转化。在经转化的细菌中加入250μl SOC培养基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃将混合物振荡60分钟，然后转移至含有50μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml X-Gal的LB平板培养基中，37℃培养过夜。将显出的白色菌落转移至3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。
培养之后，用微量质粒提取试剂盒(QIAGEN)从细菌中提取质粒。取出部分所得质粒，于37℃与限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)反应60分钟，通过琼脂糖电泳进行分离。用溴化乙锭染色DNA，证实“长”DNA片断的插入。于30℃，将500ng其余质粒与限制性酶SmaI(TOYOBO有限公司制备)反应60分钟。在反应产物中加入2μl3M醋酸钠和500μl100％乙醇，将混合物置于冰上15分钟，以15000rpm离心15分钟，除去上清液。在沉淀物中加入500μl70％乙醇，以15000rpm离心混合物15分钟，除去上清液，减压干燥残留物10分钟。加入无菌水以溶解沉淀物，于37℃将混合物与限制性酶XbaI(Baringer Manhaim)反应60分钟。在反应产物中加入等量苯酚/氯仿(等量混合的液体)，轻柔混合，以15000rpm离心混合物15分钟，回收水层(上层)。在回收的液体中加入等量水-饱和醚，轻柔混合，以15000rpm离心混合物15分钟以除去醚层(上层)。在残留的水层中加入2μl3M醋酸钠和500μl100％乙醇，将混合物置于冰上15分钟，以15000rpm离心15分钟，除去上清液。
在沉淀物中加入500μl 70％乙醇，以15000rpm离心混合物15分钟，除去上清液，减压干燥残留物10分钟。加入20μl无菌蒸馏水。在5μl溶液中加入1μl包含在平端试剂盒(Takara Shuzo有限公司)中的10×缓冲液和3μl无菌蒸馏水，将混合物在70℃维持5分钟，加入1μl T4 DNA聚合酶，将混合物在37℃维持5分钟以得到平端。经搅拌灭活T4 DNA聚合酶之后，加入40μl连接溶液A和10μl连接溶液B，将混合物在16℃维持30分钟以进行内部连接。在大肠杆菌INVα’F感受态细胞中加入2μl所得溶液和2μl 0.5M β-巯基乙醇，将混合物置于冰上30分钟。然后加热至42℃达30秒，用质粒转化大肠杆菌。
在经转化的大肠杆菌中加入250μl SOC培养基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃将混合物振荡60分钟，然后铺于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基中，37℃培养过夜。将显出的白色菌落接种于3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。培养之后，用微量质粒提取试剂盒(QIAGEN公司)从大肠杆菌中提取质粒。
使用所得质粒为模板，进行测序反应。所用测序引物是IDRD41Infrared染料标记的M13正向引物和IRD41 Infrared染料标记的M13反向引物(由Nisshinbo制备，Aroka有限公司出售)。所用反应液体是SequiTherm(商标)Long-Read(商标)循环测序试剂盒-LC(由EPICENTRE TECHNOLOGIES制备)。使用4000L Long ReadIR(商标)DNA测序系统(由LI-COR制备)测定碱基序列。
位于嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区“长”DNA的基因序列示于SEQ ID NO:3。
(4)克隆并测序间隔区“短”DNA使用高纯度的PCR产物纯化试剂盒(Baringer Manhaim)，按实施例4-(2)所述进行PCR反应之后，从溶液中除去未反应的dNTP。在所得100ng扩增的DNA中加入2μl质粒pCR2.1(包含在TA克隆试剂盒中，INVITROGEN),1μl连接酶和1μl缓冲液，然后加入无菌水至总体积为10μl。将溶液置于14℃反应4小时之后，在大肠杆菌INVα’F感受态细胞中加入2μl溶液和2μl 0.5Mβ-巯基乙醇，置于冰上30分钟。然后将溶液加热至42℃达30秒，对细菌进行质粒转化。在经转化的细菌中加入250μl SOC培养基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃将混合物振荡60分钟，然后转移至含有50μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml X-Gal的LB平板培养基中，37℃培养过夜。将显出的白色菌落转移至3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。培养之后，用微量质粒提取试剂盒(QIAGEN)从细菌中提取质粒。
取出部分所得质粒，于37℃与限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)反应60分钟，通过琼脂糖电泳分离反应产物。用溴化乙锭染色DNA，证实“短”DNA片断的插入。于30℃，将500ng其余质粒与限制性酶SmaI(TOYOBO有限公司制备)反应60分钟。在反应产物中加入2μl 3M醋酸钠和500μl 100％乙醇，将混合物置于冰上15分钟，以15000rpm离心15分钟，除去上清液。在沉淀物中加入500μ;70％乙醇，以15000rpm离心混合物15分钟，除去上清液，减压干燥残留物10分钟。加入无菌水以溶解沉淀物，于37℃将混合物与限制性酶BamHI(TakaraShuzo公司)反应60分钟。在反应产物中加入等量苯酚/氯仿(等量混合的液体)，轻柔混合，以15000rpm离心混合物15分钟，回收水层(上层)。在回收的液体中加入等量水-饱和醚，轻柔混合，以15000rpm离心混合物15分钟以除去醚层(上层)。在残留的水层中加入2μl 3M醋酸钠和500μl 100％乙醇，将混合物置于冰上15分钟，以15000rpm离心15分钟，除去上清液。
在沉淀物中加入500μl 70％乙醇，以15000rpm离心混合物15分钟，除去上清液，减压干燥残留物10分钟。加入20μl无菌蒸馏水。在5μl溶液中加入1μl包含在平端试剂盒(Takara Shuzo有限公司)中的10×缓冲液和3μl无菌蒸馏水，将混合物在70℃维持5分钟，加入1μl T4 DNA聚合酶，将混合物在37℃维持5分钟以得到平端。经搅拌灭活T4 DNA聚合酶之后，加入40μl连接溶液A和10μl连接溶液B，将混合物在16℃维持30分钟以进行内部连接。在大肠杆菌INVα’F感受态细胞中加入2μl所得溶液和2μl0.5Mβ-巯基乙醇，将混合物置于冰上30分钟。然后加热至42℃达30秒，用质粒转化大肠杆菌。在经转化的大肠杆菌中加入250μl SOC培养基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃将混合物振荡60分钟，然后铺于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基中，37℃培养过夜。将显出的白色菌落接种于3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。培养之后，用微量质粒提取试剂盒(QIAGEN公司)从大肠杆菌中提取质粒。
使用所得质粒为模板，进行测序反应。所用测序引物是IRD41Infrared染料标记的M13正向引物和IRD41Infrared染料标记的M13反向引物(由Nisshinbo制备，Aroka有限公司出售)。所用反应液体是SequiTherm(商标)Long-Read(商标)循环测序试剂盒-LC(由EPICENTRE TECHNOLOGIES制备)。使用4000L Long ReadIR(商标)DNA测序系统(由LI-COR制备)测定碱基序列。
位于嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区“短”DNA的基因序列示于SEQ ID NO:4。
实施例5通过PCR法检测嗜啤酒梳状菌(1)选择并合成嗜啤酒梳状菌所用引物在SEQ ID NO:3的基础上，使用DNASIS(商标，Hitachi SoftEngineering有限公司)分析嗜啤酒梳状菌的特定序列。结果选定SEQID NO:3所示的位于嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列第135至153位的序列(SEQ ID NO:7)。
另外，类似的分析选定了SEQ ID NO:3所示的位于嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列第172至191位的序列(SEQ ID NO:8)。
另外，类似的分析选定了SEQ ID NO:3所示的位于嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列第203至222位的序列(SEQ ID NO:9)。
另外，通过编码嗜啤酒梳状菌16S rRNA的基因序列选定SEQ IDNO:11所示的特异性引物。通过与实施例2-(1)相同的方法化学合成寡核苷酸。
(2)通过具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11之序列的引物检测和鉴定嗜啤酒梳状菌通过PCR，用实施例5-(1)中合成的引物(SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:11)处理实施例1中制备的细菌DNA溶液。PCR的温度条件如下热变性94℃，30秒退火55℃，30秒链延伸反应72℃，30秒将一个条件循环重复35次。PCR之后，以恒压100V对所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳30分钟。同时也电泳pHY标记以作为分子量标记。电泳之后，在约5μg/ml溴化乙锭溶液中染色凝胶20分钟，用紫外线观察凝胶并摄制凝胶照片。通过观察或凝胶照片，由分子量标记的相对迁移距离测定扩增产物的碱基长度。
如图2所示，仅在嗜啤酒梳状菌中检测到约600bp的带。
由此结果看，当SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11的寡核苷酸用作PCR引物时，仅在嗜啤酒梳状菌中检测到具有目的长度的带。由此可以证明，本发明的各个寡核苷酸正确地识别了位于嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列，和靶向16SrRNA编码基因的碱基序列。另外，在相同属的福瑞森加梳状菌，和相对严格厌氧的细菌和革兰氏阳性细菌中未观察到具有目的长度的带。因此，本发明可以特异性地检测到嗜啤酒梳状菌，同时测定该细菌。
通过本发明，证实了福瑞森加梳状菌和嗜啤酒梳状菌16S rRNA基因和23S rRNA基因之间构成的间隔区基因，通过使用部分或全部基因序列提供了快速而可靠地检测福瑞森加梳状菌和嗜啤酒梳状菌的方法。
27Sequence Listing<110>Asahi Breweries,Ltd.<120>检测细菌所用的基因和使用该基因检测细菌的方法<130>98T3-10<160>11<210>1<211>624<212>DNA<213>福瑞森加梳状菌<400>1gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctaaggat 60taaaacaatc cgtcgagcac atccggaaca tgtattgttt ggttttgagg gtttctccct 120caaaaaaata gatagaacta atgggggcgt agctcagctg ggagagcacc tgccttgcaa 180gcagggggtc aggagttcaa atctcctcgt ctccaccaga agagaaatgg gcctatagct 240cagctggtta gagcgcacgc ctgataagcg tgaggtcagt agttcaagtc tacttaggcc 300caccataatt gcacattgaa aactacacag aagaaaagca aagaacaatt aatcaccaat 360gccaaacttg tgagaggaga ttttcaagag gatggcgggg aatagttgga ccaagcacaa 420ttaggaaact aaaaacaagc taagacaaaa catataaact taagctaaag gtgatattct 480ggaggagact cgagaatata ataaacttac cagaagcgtt cagatgcaag gaagcatgaa 540agcgaatgaa gaaggcgtat tagtatacgc cgatgagtga gctgaaatga tgacgaagca 600gatgagcggt tatggaaagt ttaa624<210>2<211>442<212>DNA<213>福瑞森加梳状菌<400>2gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctaaggat 60taaaacaatc cgtcgagcac atccggaaca tgtattgttt ggttttgagg gtttctccct 120caaatattgc acattgaaaa ctacacagaa gaaaagcaaa gaacaattaa tcaccaatgc 180caaacttgtg agaagagatt ttcaagagga tggcggggaa tagttggacc aagcacaatt 240aggaaactaa aaacaagcta agacaaaaca tataaactta agctaaaggt gatattctgg 300
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30<212>DNA<213>嗜啤酒梳状菌<400>9agtcttctct actgccatgc 20<210>10<211>20<212>DNA<213>福瑞森加梳状菌<400>10cgtatccaga gatggatatt 20<210>11<211>20<212>DNA<213>嗜啤酒梳状菌<400>11cgtatccaga gatggatatt 20
权利要求
1．位于福瑞森加梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列，该序列含有SEQ ID NO:1所示的部分或全部碱基序列。
2．位于福瑞森加梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列，该序列含有SEQ ID NO:2所示的部分或全部碱基序列。
3．位于嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列，该序列含有SEQ ID NO:3所示的部分或全部碱基序列。
4．位于嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列，该序列含有SEQ ID NO:4所示的部分或全部碱基序列。
5．寡核苷酸，其特征在于位于福瑞森加梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列具有至少一个下列序列组或相应的互补序列5’-CCATCCTCTTGAAAATCTC-3’①5’-TCTCRTCTCACAAGTTTGGC-3’②
6．寡核苷酸，其特征在于位于嗜啤酒梳状菌16S rRNA编码基因和23S rRNA编码基因之间的间隔区的基因序列具有至少一个下列序列组或相应的互补序列5’-CACTCTTACAAGTATCTAC-3’③5’-CCACAATATTTCCGACCAGC-3’④5’-AGTCTTCTCTACTGCCATGC-3’⑤
7．检测福瑞森加梳状菌的方法，所述方法包括将由权利要求1或2所述的基因序列制成的寡核苷酸用作引物以合成核酸，并通过基因扩增处理核酸以检测细菌。
8．检测嗜啤酒梳状菌的方法，所述方法包括将由权利要求3或4所述的基因序列制成的寡核苷酸用作引物以合成核酸，并通过基因扩增处理核酸以检测细菌。
9．检测福瑞森加梳状菌的方法，所述方法包括将由权利要求1或2所述的基因序列制成的寡核苷酸，或由权利要求5所述的基因序列制成的寡核苷酸和编码福瑞森加梳状菌16S rRNA基因的核苷酸序列用作引物以合成核酸，并通过基因扩增处理核酸以检测细菌。
10．检测嗜啤酒梳状菌的方法，所述方法包括将由权利要求3或4所述的基因序列制成的寡核苷酸，或由权利要求6所述的基因序列制成的寡核苷酸和编码嗜啤酒梳状菌16S rRNA基因的核苷酸序列用作引物以合成核酸，并通过基因扩增处理核酸以检测细菌。
11．如权利要求9所述的方法，其中编码福瑞森加梳状菌16S rRNA基因的核苷酸序列具有下列序列5’-CGTATCCAGAGATGGATATT-3’⑥
12．如权利要求10所述的方法，其中编码嗜啤酒梳状菌16S rRNA基因的核苷酸序列具有下列序列5’-CGTATGCAGAGATGCATATT-3’⑦
全文摘要
本发明涉及检测已知为啤酒－酸败菌的梳状菌属细菌福瑞森加梳状菌或嗜啤酒梳状菌所用的基因,以及使用该基因检测细菌的方法。本发明提供了与啤酒－酸败相关的梳状菌属所特有的位于16SrRNA基因和23SrRNA基因之间的间隔区的基因序列,以及使用该序列快速而敏感地检测细菌的方法。
文档编号C12Q1/68GK1319136SQ99811321
公开日2001年10月24日 申请日期1999年8月11日 优先权日1998年8月11日
发明者本山靖朗, 尾形智夫, 坂井和久 申请人:朝日啤酒株式会社