专利名称：检测SLC26A4基因c.665G＞T突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因检测领域，具体涉及用于检测SLC26A4基因突变基因的试剂盒，本发明还涉及新的SLC26A4突变基因及其在诊断和/或治疗前庭导水管扩大疾病相关的应用。
背景技术：
SLC26A4基因位于7q31，其最初是由Everett等定位，并且发现该基因突变可以导致一种常染色体隐性遗传性疾病=Pendred综合征，临床表现为甲状腺肿，及合并前庭导水管扩大或Mondini畸形(前庭导水管扩大合并耳蜗发育不全)的感音神经性耳聋。后来，Usami等对6例单纯前庭导水管扩大家系的SLC26A4基因的筛查结果表明，该基因的突变还可以导致单纯前庭导水管扩大，其遗传模式也是隐性遗传.由此可见，SLC26A4基因突变可·以导致前庭导水管扩大——单纯性前庭导水管扩大或者是合并耳蜗畸形的前庭导水管扩大。前庭导水管扩大是内耳最常见的畸形，其在遗传性耳聋中占到I 8%。临床上主要表现为高频听力损失为主的感音神经性耳聋，听力损失程度多表现为重度或者是极重度聋。发病多在儿童时期，其发病前常有感冒、发烧、外伤等使颅内压增高的诱因。与前庭导水管扩大相关的SLC26A4基因mRNA全长4930bp，含21个外显子，开放阅读框架2343bp(如SEQ ID NO. I所示)，贯穿外显子2和外显子21。该基因编码的蛋白——Pendrin是一个分子量为86kD,含780个氨基酸的跨膜蛋白，属于离子转运子家族。Scott和Bidart等的研究发现，Pendrin主要表达于甲状腺滤泡细胞的顶膜及内淋巴管和内淋巴囊的主细胞，介导碘离子和氯离子的转运，在维持甲状腺组织和内淋巴的离子平衡上发挥作用。在甲状腺，当Pendrin功能障碍时，其不能把碘离子及时转运到滤泡胶质，使碘离子在滤泡细胞内积聚，从而不能有效有机化并与甲状腺球蛋白结合，从而导致Pendred综合征中甲状腺肿的发生。Qvortrup等认为，大鼠的内淋巴囊类似甲状腺滤泡，有平衡胶状物质填塞囊腔，内淋巴囊主细胞的功能类似于甲状腺滤泡细胞，可以合成、分泌、吸收、消化蛋白质。氯离子转运障碍使内淋巴液的成分改变，从而损伤感觉上皮细胞，导致感音神经性耳聋。并且由于渗透压改变和成分改变的毒性机制导致膜迷路结构改变。由于内淋巴管和内淋巴囊到4岁时才停止发育，因此它们的扩大可以导致周围骨性结构的改变，例如前庭导水管或耳蜗结构的改变。对于前庭导水管扩大患者SLC26A4基因突变的筛查，国外已经广泛开展，报道的致病突变位点超过100个，包括错义突变、框移突变、无义突变及剪接位点突变，分布于各个外显子。SLC26A4基因具有明显的异质性，不同种族其突变形式不完全相同。该基因突变后其编码的蛋白不能准确定位到细胞膜上，而是存在于内质网或者是高尔基体内，影响离子转运。前庭导水管扩大患者SLC26A4基因突变的发现，不仅会促进该病的发病机理等基础研究的发展，还将大大促进前庭导水管扩大的基因诊断和治疗的开展。通过产前诊断筛查及新生儿SLC26A4基因突变的普遍筛查，可以降低前庭导水管扩大患儿的出生率，并且实现症前诊断，从而指导携带致病基因的患儿的行为，预防疾病的发生，这将会大大减少耳聋患者的数量，减轻社会压力。未来的研究将致力于基因治疗方面，能够预见，基因治疗将会给包括耳聋在内的各种遗传性疾病的治疗带来质的飞跃。
发明内容
本发明的一个目的在于提供用于检测SLC26A4基因c. 665G>T突变的试剂盒，其技术方案为—种用于检测与前庭导水管扩大疾病相关的位于SLC26A4基因外显子6的c. 665G>T突变的试剂盒，所述试剂盒包括从待测样品中提取DNA的试剂；用于扩增样本DNA的PCR反应试剂；
对PCR扩增产物进行测序的试剂；其中，所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物，所述PCR弓丨物扩增的目标片段包含SLC26A4基因第665位碱基。具体地，上述PCR引物为选自SLC26A4-6F-1 (SEQ ID NO. 3) :5’ -GGTTTCTATCTCAGGCAAACAT-3’，SLC26A4-6R-1 (SEQ ID NO. 4) :5’ -ATTGTTTCTGGAATGAACAGTGACC-3’ ；SLC26A4-6F-2 (SEQ ID NO. 5) :5’ -AGGAAGGGGAGTGATAGGGT-3’，SLC26A4-6R-2 (SEQ ID NO. 6) :5，-GCCCAGACTCAGAGAATGAAT-3，；SLC26A4-6F-3 (SEQ ID NO. 7) :5’ -CTACCAGTATTTTTGTGCTAT-3’，SLC26A4-6R-3 (SEQ ID NO. 8) :5，-CAAAGTGCTGGGATTACAGG-3’ ;SLC26A4-6F-4 (SEQ ID NO. 9) :5’ -GGACCGAAAGCCACATAAAT-3’，SLC26A4-6R-4 (SEQ ID NO. 10) :5，-ACCACCACACCCAGCAAAT-3，;中一的对。本发明的另一个目的在于提供上述试剂盒用于检测位于SLC26A4基因外显子6的c. 665G>T突变的方法，包括以下步骤I)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA ；2)以该DNA为模板，以PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；其中，所述PCR引物扩增的目标片段包含SLC26A4基因第665位碱基；3)将得到的PCR反应产物进行直接测序，并将测序结果与SLC26A4正常基因的序列进行比较，确定是否存在SLC26A4基因的c. 665G>T突变位点。进一步地,上述方法还包括下述步骤4)按照正常阅读框架进行翻译以确定c. 665G>T突变使氨基酸序列于222位发生错义改变，并使第222位编码的氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸(p. G222V)，极性氨基酸变为了非极性氨基酸。本发明的又一个目的是提供上述试剂盒在用于检测前庭导水管扩大疾病中的用途，将为在前庭导水管扩大相关疾病患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法，便于易感基因在诊断和/或治疗前庭导水管扩大相关疾病中的应用；提供诊断前庭导水管扩大的方法，其通过检测来自患者的待测样本中是否存在具有本发明所述突变形式的SLC26A4突变基因而判断患者前庭导水管扩大症的发生和类型，进而为临床诊断和治疗提供参考；同时可以指导临床治疗，并为将来利用这一突变作为靶点开展耳聋的基因治疗提供坚实的基础。使用本发明的试剂盒的检测方法为通过检测来自于患者的待测样本中是否存在SLC26A4基因c. 665G>T突变，而判断该患者前庭导水管扩大相关疾病发生原因及类型。其中，SLC26A4基因的c. 665G>T碱基改变引起氨基酸编码过程中在222位发生错义改变，并使第222位编码的氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸(p. G222V)，图I给出SLC26A4编码区氨基酸与核酸碱基的对照图，并用红色方框示出突变位点所在位置。这一突变位点位于Pendrin的第五细胞外环袢，使222位极性亲水的甘氨酸变成了非极性疏水的缬氨酸，同时，其氨基酸序列与猕猴、大鼠、狗、鸡等同源序列的进化研究结果表明，该突变位点具有高度保守性，这一突变将导致SLC26A4基因编码的Pendrin蛋白功能异常。SLC26A4基因突变相关的前庭导水管扩大相关疾病以常染色体隐性遗传的方式传 递。发明人应用候选基因筛查的方法对272例前庭导水管扩大患者和100例听力正常且无家族史的对照进行筛查，在一例前庭导水管扩大患者发现SLC26A4基因杂合的c. 665G>T错义突变，除此之外患者还携带另一个位于外显子区域的杂合突变，SLC26A4基因突变与前庭导水管扩大表型共分离。同时100名正常人的筛查中未检测到该突变，说明这一突变位点与前庭导水管扩大密切相关。目前国际上报道与前庭导水管扩大相关的突变有100多种，尚无c. 665G>T突变的报道。图I给出SLC26A4编码区氨基酸与核酸碱基的对照图，并示出突变位点(方框标记处)，该突变使位于SLC26A4基因编码区的第665位中的一个G碱基变为T碱基，使得第222位编码的氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸(P. G222V)。突变发生后编码的氨基酸极性发生改变，导致SLC26A4基因编码的Pendrin蛋白功能异常。检测该突变可用本领域的任何检测点突变的方法来进行，例如PCR (聚合酶链反应)一测序法、采用标记的SLC26A4基因DNA探针杂交法或用限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等等。在本发明的一个实施方案中，采用PCR扩增-直接测序法来检测样本，具体包括下述步骤I)采集待测个体的样本，例如血液、体液或组织，提取基因组DNA ；2)以该DNA为模板，以针对SLC26A4基因或SLC26A4编码区第222位碱基附近设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物；3)将得到的PCR产物进行直接测序分析，将所得到的序列与SLC26A4正常基因的序列进行比较，确定是否存在SLC26A4突变位点。4)根据以上结果判断待测个体是否为SLC26A4基因突变c. 665G>T导致的前庭导水管扩大。进一步的，该方法可以选择性的包括如下步骤5)按正常阅读框进行翻译以确定氨基酸是否存在第222位编码的甘氨酸变为缬氨酸(P.G222V)。在发明人进行的实验中，通过聋病门诊及资源收集网络收集前庭导水管扩大患者，建立资源库。在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA，定量后入库，-20° C保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后，应用在线引物设计软件Primer3设计引物，包含SLC26A4整个编码区，应用PCR扩增。PCR产物直接测序测序引物与PCR扩增引物相同，正反向测序，应用ABI公司3700DNA测序仪。得到的序列与Genbank中的序列(登录号NC 000007. 13)比较确定SLC26A4突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定SLC26A4的突变位点。上述步骤2所得到的PCR反应产物还可以用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的SLC26A4核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针，也可用限制性酶切的方法筛查是否存在已被确定的突变。因此，检测PCR扩增产物的试剂选自测序检测试剂、限制性内切酶酶切检测试剂、限制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂和探针杂交检测试剂。在上述方法中使用的PCR引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通常为15 30个碱基，GC含量为45 50%左右，在适当的温度下与末端特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计。在本发 明的一个具体实施例中，应用在线引物设计软件primer 3. O设计了一对PCR引物，其序列为上游引物SLC26A4-6F-1:5，-GGTTTCTATCTCAGGCAAACAT-3’下游引物SLC26A4-6R-1:5’-ATTGTTTCTGGAATGAACAGTGACC-3，SLC26A4正常基因的标准序列可以参考例如Genbank NC_000007. 13。用于检测SLC26A4基因c. 665G>T突变的试剂盒中可以包含以下试剂用于扩增样本DNA中SLC26A4基因或SLC26A4基因编码区第665位碱基附近的PCR引物；以及以下一种或几种试剂的组合从待测样品中提取DNA的试剂；PCR反应试剂；对PCR扩增产物进行直接测序的试剂。例如，本发明的一个实施方案中提供一个检测SLC26A4基因c. 665G>T突变的试剂盒，容器内装有用以检测SLC26A4基因c. 665G>T突变的成分，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中SLC26A4基因c. 665G>T突变位点的试剂盒，可含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液、或测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以采用上述的一对SLC26A4-6F-1和SLC26A4-6R-1引物，所述用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。所述试剂盒的使用方法主要包括如下步骤(I)提取待测血样的DNA，利用上述的一对SLC26A4-6F-1和SLC26A4-6R-1引物，进行PCR反应，得到PCR反应产物；(2)PCR反应产物纯化后直接测序，将所得的序列与Genbank中的标准序列比较确定突变位点的存在；所述步骤还可进一步包括(3)按正常阅读框进行翻译以确定氨基酸是否存在第222位编码的甘氨酸变为缬氨酸(P.G222V)。
该试剂盒可简便快捷地检测SLC26A4突变位点，从而应用于前庭导水管扩大相关基因的检测及其诊断或治疗方法中。本发明也提供了 SLC26A4突变基因在诊断或治疗前庭导水管扩大中的应用。通过检测来自患者的待测样本中是否存在SLC26A4基因c. 665G>T突变而判断该患者的前庭导水管扩大发生原因及类型，进而为临床诊断和治疗提供依据；此外，在进一步的临床治疗方面，在检测为发生了 SLC26A4基因c.665G>T突变之后，可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达，它可与内源性突变基因发生重组，从而可以进行基因治疗。本发明提出了通过检测患者中是否存在SLC26A4基因新的突变而诊断前庭导水管扩大发生的原因和类型的检测方法，这将有利于为不同类型前庭导水管扩大患者确定个体化治疗方案。下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的说明，详细描述但不限制本发明。
图I为SLC26A4基因编码区核苷酸与氨基酸的对照突变位于SLC26A4基因第222位中一个G碱基，用方框圈起来的是突变的碱基和对应的氨基酸，突变后的碱基序列使氨基酸于222位发生错义突变(下划线部分的氨基酸)。图2为本发明方法中PCR反应过程示意图，示出了反应温度和时间，其中*表示每个循环降低0.5°C。图3为本发明方法中，对PCR产物进行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱，图中示出了定量Marker的片段位置。图4为不同物种Pendrin氨基酸序列进化研究，通过对不同物种氨基酸序列比对，可见不同物种的Pendrin在该位点均为甘氨酸(G)，说明p. G222V突变位于保守区域；在猕猴、大鼠、狗、鸡等物种间具有高度保守性。图5为Pendrin的结构示意图，星号示出第222位氨基酸所在位置，发生p. G222V突变的位置。
具体实施例方式本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。实施例I待测血样提取与SLC26A4基因编码区的PCR扩增一、待测对象血样DNA的制备I、研究对象对272例散发前庭导水管扩大患者和100名无家族史的听力正常对照按照下述方法进行SLC26A4基因的筛查。272例患者中，2例前庭导水管扩大患者的SLC26A4基因检测发现患者为c. 665G>T突变和另外一已知致病种突变(c. 235delC)的复合杂合子。对100名听力正常者的筛查中未发现c.665G>T突变者。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5 10ml。2、基因组DNA提取采用酚氯仿抽提法。
第一天I)抗凝血用PBS作I倍稀释。2)在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18° C 28° C)，上面铺一层I倍体积已稀释的血液，室温，IOOOXg,离心20分钟。3)吸弃上清液，小心吸出中间有核细胞层，转入5ml Ep管中，5000 X g，离心10分钟，然后用PBS洗一次。5000Xg,离心10分钟。4)将细胞悬于 2ml TE 缓冲液(IOmM Tris. HCl, ImM EDTA，ρΗ8· O)中，加 10% 的 SDS(十二烷基硫酸)至终浓度O. 5% (100 μ I )，蛋白激酶k 100 200yg/ml (10mg/ml )，50° C水浴3 5小时。5)用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，5000Xg，离心10分钟。 6)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚氯仿混合物，混匀，5000 Xg,离心10分钟。7)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿异戊醇混合物，混匀，5000 Xg,离心10分钟。8)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。9)加入2. 5倍体积的无水乙醇。10)-20。C 沉淀 DNA 过夜。第二天11)高速离心，10000Xg，10 分钟，4。C。12)弃上清液，加入75%乙醇2ml，高速离心10000 X g，5分钟13)弃上清液，吹干。14)用 TE 缓冲液溶解(200 μ I TE/5ml 全血，400TE/10ml 全血)。15)分装。1%琼脂糖电泳和分光光度计定量。二、SLC26A4基因编码区的PCR扩增I、引物序列上游引物SLC26A4-6F-1:5，-GGTTTCTATCTCAGGCAAACAT-3’下游引物SLC26A4-6R-1:5’-ATTGTTTCTGGAATGAACAGTGACC-3，注SLC26A4基因序列检索号NC_000007. 13。2、PCR反应体系的建立(表I)表1SLC26A4基因的PCR反应体系
权利要求
1.一种用于检测与前庭导水管扩大疾病相关的位于SLC26A4基因外显子6的c. 665G>T突变的试剂盒，所述试剂盒包括 从待测样品中提取DNA的试剂； 用于扩增样本DNA的PCR反应试剂； 对PCR扩增产物进行测序的试剂； 其中，所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物，所述PCR弓丨物扩增的目标片段包含SLC26A4基因第665位碱基。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其中所述PCR引物为选自下述引物中的一对 SLC26A4-6F-1:5’ -GGTTTCTATCTCAGGCAAACAT-3’，SLC26A4-6R-1:5’ -ATTGTTTCTGGAATGAACAGTGACC-3’ ；SLC26A4-6F-2:5， -AGGAAGGGGAGTGATAGGGT-3，，SLC26A4-6R-2:5’ -GCCCAGACTCAGAGAATGAAT—3’ ；SLC26A4-6F-3:5’ -CTACCAGTATTTTTGTGCTAT-3’ ， SLC26A4-6R-3:5，-CAAAGTGCTGGGATTACAGG-3，;SLC26A4-6F-4:5’ -GGACCGAAAGCCACATAAAT-3’ ，SLC26A4-6R-4:5，-ACCACCACACCCAGCAAAT-3，。
3.如权利要求I或2所述试剂盒，所述试剂盒用于检测位于SLC26A4基因外显子6的c. 665G>T突变的方法，包括以下步骤 1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA； 2)以该DNA为模板，以PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物； 其中，所述PCR引物扩增的目标片段包含SLC26A4基因第665位碱基； 3)将得到的PCR反应产物进行直接测序，并将测序结果与SLC26A4正常基因的序列进行比较，确定是否存在SLC26A4基因的c. 665G>T突变位点。
4.如权利要求3所述试剂盒，所述方法还进一步包括下述步骤 4)按照正常阅读框架进行翻译以确定c.665G>T突变使氨基酸序列于222位发生错义改变，并使第222位编码的氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸(p. G222V)，极性氨基酸变为了非极性氨基酸。
5.如权利要求I所述的试剂盒在用于检测前庭导水管扩大疾病中的用途。
全文摘要
本发明提供了检测SLC26A4基因c.665G>T突变的试剂盒，通过检测患者中是否存在该突变基因而诊断前庭导水管扩大发生的原因和类型。该突变基因和检测方法将有利于临床上开展前庭导水管扩大患者的SLC26A4突变筛查工作，为前庭导水管扩大患者的诊断和治疗提供依据。
文档编号C12Q1/68GK102851359SQ20121017176
公开日2013年1月2日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者王秋菊 申请人:王秋菊, 中国人民解放军总医院