专利名称：检测SLC26A4基因c.232T＞C突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测基因突变的试剂盒，尤其涉及检测SLC26A4基因c. 232T > C(p.Y78H)突变的试剂盒。
背景技术：
SLC26A4基因位于7q31，其最初是由Everett等定位，并且发现该基因突变可以导 致一种常染色体隐性遗传性疾病=Pendred综合征，临床表现为甲状腺肿，及合并前庭导水 管扩大或Mondini畸形(前庭导水管扩大合并耳蜗发育不全)的感音神经性耳聋。后来， Usami等对6例单纯前庭导水管扩大家系的SLC26A4基因的筛查结果表明，该基因的突变还 可以导致单纯前庭导水管扩大，其遗传模式也是隐性遗传。由此可见，SLC26A4基因突变可 以导致前庭导水管扩大——单纯性前庭导水管扩大或者是合并耳蜗畸形的前庭导水管扩 大。前庭导水管扩大是内耳最常见的畸形，其在遗传性耳聋中占到1 8%。临床上主要 表现为高频听力损失为主的感音神经性耳聋，听力损失程度多表现为重度或者是极重度耳 聋，发病多在儿童时期，其发病前常有感冒、发烧、外伤等使颅内压增高的诱因。与前庭导水管扩大相关的SLC26A4基因mRNA全长4930bp，含21个外显子，开放 阅读框架2343bp，贯穿外显子2和外显子21。该基因编码的蛋白——Pendrin是一个分子 量为86kD，含780个氨基酸的跨膜蛋白，属于离子转运子家族。Scott和Bidart等的研究 发现，Pendrin主要表达于甲状腺滤泡细胞的顶膜及内淋巴管和内淋巴囊的主细胞，介导碘 离子和氯离子的转运，在维持甲状腺组织和内淋巴的离子平衡上发挥作用。在甲状腺，当 Pendrin功能障碍时，其不能把碘离子及时转运到滤泡胶质，使碘离子在滤泡细胞内积聚， 从而不能有效有机化并与甲状腺球蛋白结合，从而导致Pendred综合征中甲状腺肿的发 生。Qvortrup等认为，大鼠的内淋巴囊类似甲状腺滤泡，有平衡胶状物质填塞囊腔，内淋巴 囊主细胞的功能类似于甲状腺滤泡细胞，可以合成、分泌、吸收、消化蛋白质。氯离子转运障 碍使内淋巴液的成分改变，从而损伤感觉上皮细胞，导致感音神经性耳聋，并且由于渗透压 改变和成分改变的毒性机制导致膜迷路结构改变。由于内淋巴管和内淋巴囊到4岁时才停 止发育，因此它们的扩大可以导致周围骨性结构的改变，例如前庭导水管或耳蜗结构的改 变。对于前庭导水管扩大患者SLC26A4基因突变的筛查，国外已经广泛开展，报道的 致病突变位点超过200个，包括错义突变、框移突变、无义突变及剪接位点突变，分布于各 个外显子。SLC26A4基因具有明显的异质性，不同种族其突变形式不完全相同。该基因突变 后其编码的蛋白不能准确定位到细胞膜上，而是存在于内质网或者是高尔基体内，影响离 子转运。但目前尚无c.232T>C突变的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种判定待测个体的样本是否存在SLC26A4 基因突变的检测SLC26A4基因c. 232T > C突变的试剂盒。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供该试剂盒在检测前庭导水管扩大相关 的位于SLC26A4基因的232位突变中的应用。为解决上述问题，本发明所述的一种检测SLC26A4基因c. 232T > C突变的试剂 盒，包括——针对SLC26A4基因或SLC26A4基因编码区第232位碱基附近设计的PCR弓丨 物；——PCR反应试剂；——检测PCR扩增产物的试剂。 所述PCR引物为15 30个碱基，GC含量为45 50%。所述PCR引物中上游引物为SLC26A4-3F :5，-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，；下游引物为SLC26A4-3R :5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3，。所述PCR 反应试剂为 2. 5μ 1、含 15ml MgCl2 的 10XPCR 缓冲液，2. 0 μ 1、2. 5mM 的 dNTP，0. 3μ 1、5υ/μ 1 的耐热聚合酶，0. 25 μ 1 荧光染料(Big-Dye mix)。所述检测PCR扩增产物的试剂为测序检测试剂、限制性内切酶酶切检测试剂、限 制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂或杂交探针检测试剂中的任意一种。如上所述的检测SLC26A4基因c. 232T > C突变的试剂盒在检测前庭导水管扩大 相关的位于SLC26A4基因的232位突变中的应用，包括以下步骤(1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取基因组DNA ；(2)以所述DNA为模板，采用所述PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物SLC26A4-3F :5，-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，SLC26A4-3R :5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3，；(3)将所述PCR扩增产物纯化后进行直接测序，并将测序结果与SLC26A4基因标准 序列进行比较，确定是否存在SLC26A4基因的c. 232T > C突变位点；(4)判断待测个体是否为SLC26A4基因突变c. 232T > C导致的前庭导水管扩大。该应用还包括按照正常阅读框架进行翻译以确定c. 232T > C突变，使得位于 Pendrin氨基端的第78位极性中性酪氨酸变为碱性组氨酸。本发明与现有技术相比具有以下优点1、由于本发明中设有针对SLC26A4基因或SLC26A4基因编码区第232位碱基附近 设计的PCR引物，因此，利用该引物并配合PCR反应试剂和检测试剂，可有效地判断来自于 患者的待测样本中是否存在SLC26A4基因c. 232T > C突变，从而为判断该患者前庭导水管 扩大发生原因提供依据。2、由于本发明在实际应用时，以基因组DNA为模板，利用针对SLC26A4基因或 SLC26A4基因编码区第232位碱基附近设计的PCR引物进行扩增、检测，因此，本发明具有快 速、灵敏度高、特异性强的特点。
具体实施例方式检测SLC26A4基因c. 232T > C突变的试剂盒，包括——针对SLC26A4基因或SLC26A4基因编码区第232位碱基附近设计的PCR引物； ——PCR反应试剂； ——检测PCR扩增产物的试剂。 其中PCR引物依据已知的核苷酸序列设计为15 30个碱基，GC含量为45 50%。本 发明应用在线引物设计软件primer 3. 0设计了一对PCR引物，其序列为上游引物SLC26A4-3F :5，-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，(Nt2898_Nt2917)；下游引物SLC26A4-3R :5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3，(Nt3277_Nt3297)。所述PCR 反应试剂为 2. 5μ 1、含 15ml MgCl2 的 10XPCR 缓冲液，2. 0 μ 1、2. 5mM 的 dNTP，0. 3μ 1、5υ/μ 1 的耐热聚合酶，0. 25 μ 1 荧光染料(Big-Dye mix)。检测PCR扩增产物的试剂为测序检测试剂、限制性内切酶酶切检测试剂、限制性 长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂或探针杂交检测试剂中的任意一种。检测SLC26A4基因c. 232T > C突变的试剂盒在检测前庭导水管扩大相关的位于 SLC26A4基因的232位突变中的应用时，可采用本领域的任何检测点突变的方法来进行，例 如PCR(聚合酶链反应)_测序法、采用标记的SLC26A4基因DNA杂交探针法或用限制性片 段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等。检测SLC26A4基因c. 232T > C突变的试剂盒在检测前庭导水管扩大相关的位于 SLC26A4基因的232位突变中的应用时，采用PCR扩增-直接测序法，该法包括以下步骤(1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取基因组DNA ；(2)以DNA为模板，采用PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物SLC26A4-3F :5，-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3‘SLC26A4-3R :5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3‘；(3)将PCR扩增产物纯化后应用ABI公司3730DNA测序仪进行直接测序，正反 向测序，并将测序结果与美国国立生物技术信息中心(NCBI)上的SLC26A4基因标准序列 (NT_007933)进行比较，确定是否存在SLC26A4基因的c. 232T > C突变位点；(4)判断待测个体是否为SLC26A4基因突变c. 232T > C导致的前庭导水管扩大。进一步地，该应用可以选择性地包括按照正常阅读框架进行翻译以确定c. 232T > C突变，使得位于Pendrin氨基端的第78位极性中性酪氨酸变为碱性组氨酸(参见核苷 酸或氨基酸序列表)，该突变使位于SLC26A4基因编码区的第232位碱基由T变成C，使得 编码的蛋白Pendrin氨基端的第78位极性中性酪氨酸(Y)变为碱性组氨酸(H)。实施例1待测血样提取与SLC26A4基因编码区的PCR扩增一、待测对象血样DNA的制备1、研究对象对8例散发非综合征型前庭导水管扩大患者和150名无家族史的听力正常对照， 按照下述方法进行SLC26A4基因的筛查。8例患者中，1例患者表现为前庭导水管扩大的 异常听功能特征，颞骨CT扫描证实双侧前庭导水管扩大。对这例前庭导水管扩大患者的 SLC26A4基因检测发现患者为c. 232T > C突变和另外一种突变的复合杂合子。患者的母亲为单纯C. 232T > C突变的携带者，父亲为另一种突变的携带者。对150名听力正常者的筛 查中未发现c. 232T > C突变者。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括 耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5 10ml。2、基因组DNA提取 采用盐析法提取DNA。第一天1)取柠檬酸钠或EDTANa2抗凝全血3 5ml，置于50ml有盖离心管。2)按全血体积的5 8倍加入(将离心管加满即可)冷蒸馏水，反复颠倒混勻，在 4°C下以3600rpm的速率离心20min。3)缓慢倾倒上清液，在沉淀中加入预冷的体积浓度为0. 的聚乙二醇辛基苯基 醚(Triton-X 100)，将离心管加满即可；轻柔混勻沉淀，在4°C下以3600rpm的速率离心 20min，弃上清，得到沉淀物。4)在沉淀物中加入2.0ml裂解液，彻底打碎沉淀，然后加入体积浓度为10%的 十二烷基硫酸钠(SDS) 150 μ 1 (至终浓度为0. 5% )，混勻。5)加入10mg/ml蛋白酶K 50 μ 1，混勻，50 55°C加热3小时；或36. 5 37. 5°C 加热，过夜消化。第二天6)加入 6. OMNaCl 750ml，剧烈振荡。7)在4°C下以3600rpm的速率离心40min，将上清液移至另一有盖离心管中。8)加入上清液2倍体积的无水乙醇或体积浓度为95%的乙醇，反复颠倒混勻至出 现絮状DNA沉淀，挑出DNA至一艾本德管(Eppendorf管)中。9)用体积浓度为80 %的乙醇洗涤DNA 2遍。将DNA保存在体积浓度为80 %的乙 醇中，放置于冰箱中备用。10)若需要请置于真空抽干或在空气中晾干，注意不要过于干燥。11)加入TE缓冲液溶解DNA (需要3 4天)，放于冰箱冷藏中存放。二、SLC26A4基因编码区的PCR扩增1、引物序列应用在线引物设计软件primer 3. O设计了一对PCR引物，其序列为上游引物SLC26A4-3F 5，-GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，下游引物SLC26A4-3R:5，-AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3，；SLC26A4正常基因的标准序列可以参考例如NCBI :ID:NT_007933。2、PCR反应体系的建立(参见表1)表1SLC26A4基因的PCR反应体系 其中缓冲液、普通Taq酶从宝生物基因公司购得，dNTP从宝生物公司购得，引物 invitrogen反应过程PCR反应在ABI公司9700热循环仪上进行，95°C预变性5分钟，95°C变 性45秒，61V退火45秒，72 0C延伸45秒，16个循环，每循环下降0. 5 °C，再95 °C变性45秒， 54°C退火45秒，72°C延伸45秒，进行28个循环，再72°C延伸10分钟，4°C保存。实施例2SLC26A4基因编码区PCR扩增产物的纯化和定量
一、PCR产物的纯化——96孔板法1、向装有PCR产物的96孔板中加入50 μ 1无菌水，混勻。2、将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤3 4分钟，看到纯化板中 没有水即可。3、向纯化板中再次加入50 μ 1的去离子水，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。4、将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20 μ 1的去离子水，静止15分钟，再震荡 15分钟，然后吸到一新96孔板内。5、保存在-20 V冰箱中。二、电泳定量1、样品准备取一 96孔点样板，每孔先加上样缓冲液6 μ 1，在从装有PCR产物的腔板中，每孔用 排枪移出PCR产物(2μ 1)，转移到点样板上、混勻、离心(腔板孔号要与96孔点样板一一对 应)。2、流程1)配胶(0. 8%琼脂糖)称取2. 4g琼脂糖，悬浮于300ml 0. 5 X TBE中(500ml锥
形瓶)。2)溶胶微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混 勻。3)凉胶待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60°C，加入10 μ 1 (10mg/ml)溴化乙 锭(EB)，摇勻。4)铺胶平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。5)上胶将平板放入已盛有电泳液(0. 5 X TBE,液面距胶面1至2mm)的电泳槽中， 拔下梳尺。
6)加样用排枪按规定格式加样，最后用单枪加入DNA标准品。7)走胶盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。
8)定量当溴酚蓝走离加样孔1. 5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪 照相，进行定量。定量marker为DL 2000，经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是2000bp、 IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp，DL2000 的总浓度是 300ng/5 μ 1。电泳时取 5μ 1 DL2000，因此每条带的含量为50ng。PCR产物电泳时取3 μ 1 (PCR产物)+5 μ 1 (上样缓冲 液)进行电泳。根据PCR产物电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR产物的含量。实施例3纯化的SLC26A4基因编码区PCR扩增产物的直接测序一、PCR产物DNA模板的纯度与用量要求DNA 纯度0D26。/0D28。= 1. 6 2. 0。DNA 浓度PCR 产物 IOng/ μ 1。PCR产物DNA用量100 200bp1 3ng200 500bp 3 IOng500 IOOObp 5 20ng1000 2000bp 10 40ng> 2000bp40 IOOng二、测序反应1、测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使 用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。2、为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。3、目前的反应体系为5 μ 1，各种试剂加入量如表2所示。表2SLC26A4基因PCR扩增产物的测序反应体系 *BigDye 3. 1为美国应用生物系统公司(ABI)生产的一种用于测序反应的荧光染 料。4、样品放于PCR仪上，所作反应的过程见表3。
表3SLC26A4基因PCR扩增产物的测序反应过程 5、反应完的样品要及时从PCR仪上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4°C 冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20°C冰箱冷冻。三、测序反应物的纯化和测序1、向每孔中加入20 μ 1 80%乙醇，以4000rpm的速率离心30min ；将样品板放在折 好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过IOOOrpm ；2、在每孔中加入30 μ 1 70%乙醇，以4000rpm的速率离心IOmindgjM ；3、重复第2步的操作；4、重复第2步的操作；5、将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min ；6、加入5μ 1甲酰胺，封膜，离心后置于_20°C冰箱中；7、上ABI PRISM 3730DNA序列分析仪前95°C变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后 上样。将所得到的测序图谱进行分析，与ID:NT_007933的标准序列比较以确定突变位点是
否存在。上述实施例1 3中的试验材料均为市售购买产品。以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出 各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。
权利要求
一种检测SLC26A4基因c.232T＞C突变的试剂盒，包括——针对SLC26A4基因或SLC26A4基因编码区第232位碱基附近设计的PCR引物；——PCR反应试剂；——检测PCR扩增产物的试剂。
2.如权利要求1所述的检测SLC26A4基因c.232T > C突变的试剂盒，其特征在于所 述PCR引物为15 30个碱基，GC含量为45 50%。
3.如权利要求2所述的检测SLC26A4基因c.232T > C突变的试剂盒，其特征在于所 述PCR引物中上游引物为 SLC26A4-3F :5’ -GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，；下游引物为 SLC26A4-3R :5’ -AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3，。
4.如权利要求1所述的检测SLC26A4基因c.232T > C突变的试剂盒，其特征在于 所述 PCR 反应试剂为 2. 5iil、含 15ml MgCl2 的 10XPCR 缓冲液，2. 0 iU、2. 5mM 的 dNTP， 0. 3u l,5U/u 1的耐热聚合酶，0. 25 u 1荧光染料。
5.如权利要求1所述的检测SLC26A4基因c.232T > C突变的试剂盒，其特征在于所 述检测PCR扩增产物的试剂为测序检测试剂、限制性内切酶酶切检测试剂、限制性长度多 态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂或杂交探针检测试剂中的任意一种。
6.如权利要求1所述的检测SLC26A4基因c.232T > C突变的试剂盒在检测前庭导水 管扩大相关的位于SLC26A4基因的232位突变中的应用，包括以下步骤(1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取基因组DNA；(2)以所述DNA为模板，采用所述PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物SLC26A4-3F :5’ -GGCAAAAGCATGGTAAGCAC-3，SLC26A4-3R :5’ -AGGGTAAGCAACCATCTGTCA-3’ ；(3)将所述PCR扩增产物纯化后进行直接测序，并将测序结果与SLC26A4基因标准序列 进行比较，确定是否存在SLC26A4基因的c. 232T > C突变位点；(4)判断待测个体是否为SLC26A4基因突变c.232T > C导致的前庭导水管扩大。
7.如权利要求6所述的检测SLC26A4基因c.232T > C突变的试剂盒在检测前庭导水 管扩大相关的位于SLC26A4基因的232位突变中的应用，其特征在于该应用还包括按照正 常阅读框架进行翻译以确定c. 232T > C突变，使得位于Pendrin氨基端的第78位极性中 性酪氨酸变为碱性组氨酸。
全文摘要
本发明涉及一种检测SLC26A4基因c.232T＞C突变的试剂盒，该试剂盒包括针对SLC26A4基因或SLC26A4基因编码区第232位碱基附近设计的PCR引物、PCR反应试剂和检测PCR扩增产物的试剂。本发明具有快速、灵敏度高、特异性强的特点，有效地判断来自于患者的待测样本中是否存在SLC26A4基因c.232T＞C突变，从而为判断该患者前庭导水管扩大发生原因提供依据。
文档编号C12Q1/68GK101838698SQ201010180608
公开日2010年9月22日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者王艳莉, 郭玉芬 申请人:兰州大学