专利名称：检测酒精代谢相关基因突变的方法及其引物与TaqMan-MGB探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及用分子生物学方法对突变碱基进行定性、定量检测的引物和探针。特别是涉及用实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantificationPCR)技术对酒精代谢相关基因突变进行定性、定量检测的引物和TaqMan-MGB探针。
背景技术：
饮酒会导致多种疾病，包括慢性胃炎，中毒性肝炎，心肌肥大，尿路结石，不可逆转的脑损害以及酒精中毒，精神障碍和人格改变等。饮酒的健康危害主要由酒精(乙醇)及其中间代谢产物乙醛引起，两者在体内的有效剂量水平和作用时间长短除与酒精摄入量， 饮酒频率相关外，还与体内的代谢酶活性相关。一般情况下，乙醇在人体代谢过程中主要受肝脏中的乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)和细胞色素P450(CYP2E1)所制约。乙醇在肝脏内转化成乙醛，乙醛再氧化为乙酸，分解成二氧化碳和水排出体外。人群中发现有7种多态性的ADH(ADH1-ADH7)，其中ADHlB和ADHlC在乙醇代谢过
程中有很重要的作用。ADHlB由ADHlB基因编码产生，不同的基因型影响ADHlB的活性，从而对体内乙醛浓度产生影响。ADHlB基因存在A/G多态性。G等位基因是野生型，携带这一等位基因的人群体内ADHlB的活性相对于携带A等位基因的人群来说较低。A等位基因使ADHlB具有较高的活性，携带这一等位基因的人能迅速将吸收的乙醇催化反应形成乙醛。AA基因型的个体酶活很高，属于快代谢型，能够将乙醇很快地转化成乙醛。ADHlC基因编码一种醇脱氢酶ADH的、亚基。乙醇随血液循环到达肝细胞，分解代谢被激活。ADHlC基因存在一个A/G多态性，此多态性可导致其编码的二聚体ADH具有不同的活性，进而导致不同个体对酒精代谢的速度不同。其中A型等位基因的ADHlC酶活性约为G型等位基因的2. 5倍。AA基因型其ADHlC酶具有很高的催化活性，属于快代谢型，能够加速体内酒精的代谢。人体器官和组织中至少有12种不同基因编码的ALDH，常见的有ALDH1-ALDH4四种，是人体肝脏内的主要同工酶。在12种ALDH中只有ALDH2表现出遗传多态性。ALDH2位于线粒体内，而ALDH1，ALDH3，ALDH4位于胞液内。ALDH2催化酒精代谢过程中从乙醛到乙酸的代谢过程。ALDH2基因型与饮酒者对乙醇的敏感性、耐受性、酒后反应、饮酒行为、以及引发疾病密切相关。该多态性位点形成G/A多态性，可造成ALDH2氨基酸序列中的一个谷氨酸转化为赖氨酸，导致ALDH2酶活性的改变。ALDH2是四聚化合物酶，突变影响了四聚体结构的稳定性，进而会影响酶的活性，进而对乙醇代谢过程的效率造成不同的影响。A等位基因造成ALDH2酶活性的急剧下降，G等位基因则保持其正常活性细胞色素P450家族成员CYP2E1，与药物代谢和脂类合成等功能相关。它对一些内源和外源的化学物质具有代谢功能，例如酒精、丙酮等等。CYP2E1是乙醇代谢中起主要作用的关键酶之一，它受乙醇诱导并参与乙醇的代谢。这一基因存在一个C/G多态性，该多态性位于CYP2E1的转录调节区域，C等位基因可能直接影响下游外显子的表达，从而影响 CYP2E1酶的活性，使个体对酒精等物质的代谢能力发生改变。它与肝损伤、肝硬化及多种肿瘤等疾病的易感性具有关联。通过检测ADH1B、ADH1C、ALDH2和CYP2E1这4个基因的多态性特点，可以得知相应酶代谢活性高低，判断个体酒精代谢能力和特点，从而为筛选高位敏感个体和采取预防措施以减少乙醇相关性疾病的发生提供理论基础。目前，已报道的用于酒精代谢相关基因突变的方法主要包括PCR直接测序和定性 PCR等，这些方法普遍存在灵敏度低，特异性不高，费时费力且易污染等缺点，使应用受到一定限制。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针，探针只与模板特异结合，其结合位点位于两条引物之间，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。目前常用的TaqMan荧光探针为寡核苷酸，其5’端标记有报告荧光基团，如FAM，VIC等，3’端标记有淬灭荧光基团，如TAMRA等。探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光，当探针与靶序列配对时，PCR延伸反应聚合酶的5’ 一 3’外切酶活性将探针酶切降解，是报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及未知模板的扩增曲线可对未知模板进行定量分析。但是，实际上，探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，而且，荧光基团也会产生不同波长的荧光，都会使得本底偏高。针对TaqMan探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新 TaqMan-MGB (TaqMan Minor Groove Binder Probe, TaqMan-MGB ), TaqMa-MGB ^ 针是带有一个小沟结合物基团的寡核昔酸探针，工作原理与TaqMan探针相同，报告荧光基团连接在探针的5’端(如FAM、VIC等)，3’端标记有淬灭基团，不同的是淬灭基团为不发光的淬灭基团(Non-FluorescentQuenohenNFQ)，淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光， 大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3’端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide，DPI3)，DPI3 可折叠进由探针末端 5_6bp 核营酸形成的小沟内。DPI3呈新月行，与B型DNA螺旋的浅深小沟一样螺旋，主要通过范德华力稳定。TaqMan-MGB探针显示了更强的序列特异性。可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm值一而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高。总之，与传统的TaqMan探针比较，TaqMan-MGB探针有以下优势MGB增加了探针熔点温度(Tm)，这样可使探针较短，尤其适合富含A/T的序列，并且提高配对与非配对模板间的Tm值差异，可进行更多重的PCR ；提高信噪比，由于在探针的3 ‘端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近，实验的结果更精确，分辨率更高；且实验步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提高。目前尚没有专门用于检测乙醇代谢相关基因突变的实时荧光定量PCR检测技术。
发明内容
本发明的目的是提供针对皮肤老化相关基因突变进行定性、定量检测的引物。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案用于检测ADHlB突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2组成的引物对。用于检测ADHlC突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4组成的引物对。用于检测ALDH2突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6组成的引物对。用于检测CYP2E1突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO :7和SEQ ID N0:8组成的引物对。本发明还提供了针对皮肤健康相关基因突变进行定性、定量检测的TaqMan-MGB 探针。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案用于检测突变的ADHlB TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO 9和SEQID NO 10的DNA序列。用于检测突变的ADHlC TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:11和SEQID NO: 12的DNA序列。用于检测突变的ALDH2 TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:13和SEQID NO: 14的DNA序列。用于检测突变的CYP2E1 TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO: 15禾口 SEQ ID NO 16 的 DNA 序歹Ij。
具体实施例方式本发明结合具体实施例做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用限制本发明范围。实施例1、用于酒精代谢相关基因突变检测的引物和TaqMan-MGB探针的设计根据基因序列的突变位点，用Primer Express Software 2. 0软件设计PCR引物，同时根据野生型基因及突变型基因的反向互补序列设计2条TaqMan-MGB探针，将2条 TaqMan-MGB探针的5’端分别标记报告荧光基因FAM(红色荧光)和VIC(绿色荧光)，3’端标记不发光淬灭基团，并连接DIP3。引物及TaqMan-MGB探针序列为检测ADHlB突变的引物5' -agagtgttggagaaggggtgacta-3‘5， -aaatgtatttgagggttttgctac-3，检测ADHlB 突变的 iTaciMan-MGB 探针5， -VIC-gtcatctgtgtgacagattcc-MGB-3，5， -FAM-gtcatctgtgcgacagattcc-MGB-3，检测ADHlC突变的引物
5' -aaagtttagaaaaagtgctgcatt-3‘5' -tagcagagaatgaaaaggtggaag-3‘检测ADHlC 突变的 iTaciMan-MGB 探针5， -VIC-aaaaggtaaaacatttgttatt-MGB-3，5， -FAM-aaaaggtaaaatatttgttatt-MGB-3，检测ALDH2突变的引物5， -ctgctggtggctcggagcctgctg-3，5' -aaagacgttagagcaaagtttaat-3‘检测ALDH2 突变的 iTaciMan-MGB 探针5， -VIC-gttttcactttagtgtatgcc-MGB-3，5， -FAM-gttttcacttcagtgtatgcc-MGB-3，检测CYP2E1突变的引物5' -agtgatttggctggattgtaaatg-3‘5， -ctgccgcctcctcctctctttcct-3，检测CYP2E1 突变的 iTaciMan-MGB 探针5' -VIC-ttcaggagaggtgcagtgtta-MGB-3'5' -FAM-ttcaggagagctgcagtgtta-MGB-3'实施例2、酒精代谢相关基因突变的检测1)样本基因组DNA的获取用细胞裂解法提取口腔粘膜脱落细胞中的DNA，悬浮于Iml生理盐水中，2000Xg 离心IOmin ；弃上清，每管加Iml生理盐水重复洗涤一次，再2000 X g离心IOmin ；弃上清，每管加 400 μ 1 细胞裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl, PH 8. 0 ；0. Imol EDTA, PH 8. 0 ；0. 5% SDS)，放在50°C水浴中温育30分钟；然后冷却至室温，加等体积的酚一氯仿一异戊醇(体积比25 24 1)，混勻，5000Xg离心IOmin ；转移上层水相到另一 Eppendorf管中，重复抽提一次；再转移上层水相到另一 Eppendorf管中，加1/10体积的3M NaAc (pH5. 2)，混勻； 加入2. 5倍体积的95%冷乙醇，混勻，-20°C沉淀DNA 30分钟；10000 Xg离心15分钟，弃上清；加lml70%冷乙醇清洗沉淀，IOOOOXg离心分钟，弃上清；37°C温箱30分钟烘干；将DNA 沉淀溶于20 μ 1 TE缓冲液中，加1 μ 1 RNA酶，37°C 30分钟，置于_20°C保存。2) PCR 扩增以步骤1)提取的DNA为模板，在实施例1所述引物及TaqMan-MGB探针的引导下， 用ABI 7900实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)进行PCR扩增，并按等位基因鉴别实验操作步骤完成并分析，即依次进行读取等位基因鉴别实验PCR扩增前信号、执行扩增程序及读取、分析扩增后信号。其中，PCR反应体系为2XTaqMan通用PCR扩增预混试剂 (购自美国应用生物系统公司)，引物各900nM，荧光标记的2条I1aqMan-MGB探针各200nM， 150ng DNA。PCR反应条件为先95°C 10分钟；然后95°C 15秒，60°C 1分钟，共40个循环。3)得出结果用SDS软件(美国应用生物系统公司)分析实验结果。本次实验共取3名受试者
样本进行实验，最终的基因型分布见下表。
6快代谢型快代谢型快代谢型慢代谢型慢代谢型慢代谢型
■试ADHlB ADHlC CYP2E1 ALDH2乙醇-乙_谢盒乙酸⑶乙酸
ADHlB ADHlC CYP2E1 ALDH2
销谓 镇代代代快型慢型慢型
谢谢 谢代代代 5型则型斷型
权利要求
1.用于检测ADHlB突变的引物，是由序列表中SEQID NO :1和SEQ ID NO :2组成的引物对。
2.用于检测ADHlC突变的引物，是由序列表中SEQIDNO :3和SEQ ID NO :4组成的引物对。
3.用于检测ALDH2突变的引物，是由序列表中SEQID NO :5和SEQ ID NO :6组成的引物对。
4.用于检测CYP2E1突变的引物，是由序列表中SEQID NO :7和SEQ IDNO :8组成的引物对。
5.用于检测突变的ADHlBTaciMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO :9禾口 SEQID NO 10 的DNA序列。
6.用于检测突变的ADHlCTaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:11和SEQ ID NO: 12的DNA序列。
7.用于检测突变的ALDH2TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14的DNA序列。
8.用于检测突变的CYP2EITaqMan-MGB探针，是序列表中SEQIDNO 15和SEQ ID NO 16的DNA序列。
9.根据权利要求5-8所述的DNA序列，其特征在于5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端不仅标记有不发光的淬灭集团，还连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽。
10.根据权利要求5-8所述的TaqMan-MGB探针，其特征在于所述报告荧光基团为FAM 或VIC，不发光的淬灭基团为NFQ。
11.一种检测酒精代谢相关基因突变的试剂盒，包括权利要求1-4所述的引物以及权利要求5-8所述的TaqMan探针。
全文摘要
本发明公开了用于检测酒精代谢相关基因突变的方法及其引物与TaqMan-MGB探针。用于检测酒精代谢相关基因突变的引物，是由序列表中SEQID1～SEQ ID8共8条DNA序列组成。该TaqMan-MGB探针是序列表中SEQ ID9～SEQ ID16共8条DNA序列所述DNA序列5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端不仅标记有不发光的淬灭集团，还连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽。本发明为酒精代谢的检测、测试、分析、评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，从而为筛选高位敏感个体和采取预防措施以减少酒精相关性疾病的发生提供理论基础。
文档编号C12Q1/68GK102251023SQ201010180530
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者毛裕民 申请人:联合基因生物技术(上海)有限公司