专利名称：一种适应性广的蛋白酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白酶的制备方法，尤其是涉及一种适应性广的蛋白酶的制备方法。
背景技术：
蛋白酶是催化肽键水解的各种酶的总称，广泛来源于微生物、植物茎叶果实、动物内脏等。最早研究蛋白酶的典型代表是1908年的德国R hm等人，1911年美国华勒斯坦公 司首次以木瓜蛋白酶作为啤酒澄清剂使用，20世纪30年代以来，通过微生物工程技术提取 蛋白酶成为蛋白酶制剂的主要来源，目前，全世界酶制剂总产量在2000万吨以上，其中20% 左右是蛋白酶。已作成结晶或高纯度的蛋白酶有200多种，其一级结构甚至立体三级结构 也已阐明。蛋白酶用途极为广泛，在饲料工业、食品工业、纺织工业、造纸工业等领域的应用 产生了极为显著的经济效益和社会生态效益。目前我国酶制剂产量仅占世界总产量的2% 左右，主要是糖化酶、淀粉酶、碱性蛋白酶等酶类，国内碱性蛋白酶现在已达到1.4万吨左 右的年产量。根据蛋白酶活力PH值适宜范围，蛋白分可分为三类酸性蛋白酶，最适PH值 一般为4-5 ；中性蛋白酶，最适pH值一般为6-7 ；碱性蛋白酶，最适pH值一般为8-10。每类 蛋白酶只有在其适宜的酸碱度(即适宜的PH范围)环境中才能发挥其催化肽键水解的功效， 而实际生产应用中，往往不可能只有一种酸碱度环境。因此，目前不管以哪种方式生产的蛋白酶，其主要缺陷是1、应用pH适宜范围窄， 只能在某类产品中应用；2、生产成本相对较高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有蛋白酶制备方法存在的上述缺陷，提供一种适应性广 的蛋白酶的制备方法。本发明的目的通过以下技术方案予以实现其包括以下操作步骤
(1)枯草杆菌菌种复壮培养1)复壮培养基配制复壮培养基配方蛋白胨 0. 9-1. Iwt %，牛肉膏 0. 5-0. 7wt%, NaClO. 3-0. 5wt%，琼脂 2wt%, pH8. 5-10. 0，其余为水； 将所述配料混勻，分放于培养皿中，0. lMpal20-122°C灭菌30-35min，冷却到室温，制成复壮 培养基，备用；2)接种与培养将实验室保存的产蛋白酶的枯草杆菌环移取1-2环，接种到 所述复壮培养基，置于36°C 士 1°C恒温培养60-70h，得复壮菌种，取出低温保存；(2)枯草杆菌种子培养1)种子培养基配制种子培养基配方葡萄糖0.4-0. 6wt%，蛋 白胨 0. 4-0. 6wt%，酵母膏 0. 4-0. 6wt%，磷酸二氢钾 0. 05-0. 08wt%,硫酸镁 0. 01-0. 02wt%, 氯化钠0. 3-0. 5wt%,其余为水，ρΗ8· 5-10.0，将所述配料混勻，0. lMPal20_122 °C灭菌 30-35min，冷却到39-41°C，制成种子培养基，备用；2)种子培养方法取复壮的枯草杆菌 菌种接种，接种量按种子培养基重的l_2wt%计，接种到冷却至39-41 V的种子培养基， 360C 士 1°C恒温培养60-70小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300-320转/分 钟，通风量为1. 3-1. 4立方气体/升培养基/分钟，制成枯草杆菌种子培养液；
(3)液态深层发酵培养1)液态深层发酵培养基配方葡萄糖4.0-6.0wt%， MgS039-41. 01-0. 02wt %, Na2HP040. 20-0. 30wt %，蛋白胨 0. 15-0. 25wt % ,黄豆粉 2. 0-3. 0wt%, pH8. 5-10. 0，其余为水；将配料混勻后，0. lMPal20_122 °C 灭菌 30_35min，7令 却到39-41°C，制成液态深层发酵培养基，备用；2)液态深层发酵培养取枯草杆菌种子 培养液接种，种子培养液的接种量按液态深层发酵培养基重的2-3wt%计，接种到冷却到 39-41°C的液态深层培养基，36°C 士 1°C恒温培养60-70小时，恒温培养时，不断搅拌通风， 搅拌速度为300-320转/分钟，通风量为1. 3-1. 4立方气体/升培养基/分钟，制成枯草杆 菌液态深层发酵培养液；
(4)粗滤往枯草杆菌深层发酵培养液中添加相当于发酵培养液重3-5%的硅藻土，混 合均勻，板框压滤，得粗滤液；
(5)粗滤液膜浓缩以微滤膜将粗滤液过滤浓缩至其原重量的1/4-1/5，制得浓缩液；
(6)冷冻干燥将浓缩液在-30°C下冷冻，抽真空干燥成粉末，即成。所述枯草杆菌为公知常见微生物(参见《酶制剂工业》下册，张树政主编，科学出版 社1998年第三次印刷，395页)。蛋白酶酶活力检测方法采用紫外分光光度测定法(参见《酶制剂工业》下册，张树 政主编，科学出版社1998年第三次印刷，447页)。。按本发明方法生产的蛋白酶，酶活力可达250000-280000u/g。适宜在pH6_10的条 件下使用，PH适用范围广。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1
(1)枯草杆菌菌种复壮培养1)称取蛋白胨1.kg，牛肉膏0. 6kg，NaClO.4kg，琼脂2kg， 水96kg，混勻，调pH9. 0，分放于培养皿中，0. lMPal21°C灭菌33min，冷却到室温，制成复壮 培养基，备用；2)将实验室保存的产蛋白酶的枯草杆菌环移取2环，接种到所述复壮培养 基，置于36°C 士 1°C恒温培养65h，得复壮菌种，取出低温保存；
(2)枯草杆菌种子培养1)称取葡萄糖0.5kg，蛋白胨0. 5kg，酵母膏0. 5kg，磷酸二氢 钾 0. 06kg,硫酸镁 0. 02kg,氯化钠 0. 4kg，水 98. 02kg,混勻，调 ρΗ9· 0,0. lMPal21°C 灭菌 33min，冷却到40°C，制成种子培养基，备用；2)取复壮的枯草杆菌菌种接种，接种量按种子 培养基重的l-2wt%计，接种到冷却至40°C的种子培养基，36°C 士 1°C恒温培养65小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300转/分钟，通风量为1. 3立方气体/升培养基/ 分钟，制成枯草杆菌种子培养液；
(3)液态深层发酵培养1)称取葡萄糖5kg，MgS039-41.02kg, Na2HP040. 30kg，蛋白胨 0. 2kg,黄豆粉 3. 0kg，水 91. 48kg,混勻，调 pH9. 0，0. lMPal21°C灭菌 35min，冷却到 40°C，制 成液态深层发酵培养基，备用；2)取枯草杆菌种子培养液接种，种子培养液的接种量按液 态深层发酵培养基重的2-3wt%计，接种到冷却至40°C的液态深层培养基，36°C 士 1°C恒温 培养65小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300转/分钟，通风量为1. 3立方气 体/升培养基/分钟，制成枯草杆菌液态深层发酵培养液； (4)粗滤往枯草杆菌深层发酵培养液中添加相当于培养液重3-5%的硅藻土，混合均 勻，板框压滤，得粗滤液；
(5)粗滤液膜浓缩以微滤膜将粗滤液过滤浓缩至粗滤液原重量的1/4，制得浓缩液；
(6)冷冻干燥将步骤(5)所得浓缩液在-30°C下冷冻，抽真空干燥成粉末，即成。本实施例生产的蛋白酶，在pH6条件下测得酶活力达265000u/g ；在pHIO条件下 测得酶活力达276000u/g。实施例2
(1)枯草杆菌菌种复壮培养1)称取蛋白胨1.1kg，牛肉膏0. 5kg,NaClO. 5kg，琼脂2kg， 水95. 9kg，混勻，调pH为10. 0，分放于培养皿中，0. lMPal21°C灭菌35min，冷却到室温，制 成复壮培养基，备用；2)将实验室保存的产蛋白酶的枯草杆菌环移取1环，接种到所述复壮 培养基，置于36°C 士 1°C恒温培养70h，得复壮菌种，取出低温保存，备用；
(2)枯草杆菌种子培养1)称取葡萄糖0.4kg，蛋白胨0. 6kg，酵母膏0. 4kg，磷酸二氢 钾 0. 06kg,硫酸镁 0. Olkg,氯化钠 0. 5kg，水 98. 03kg，混勻，调 pH 为 10. 0,0. lMPal21°C灭 菌30-35min，冷却到40°C，制成种子培养基，备用；2)种子培养方法取复壮的枯草杆菌菌 种接种，接种量按种子培养基重的l_2wt%计，接种到冷却至40°C的种子培养基，36°C 士 1°C 恒温培养60-70小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为320转/分钟，通风量为1. 4 立方气体/升培养基/分钟，制成枯草杆菌种子培养液，备用；
(3)液态深层发酵培养1)称取葡萄糖6.0kg, MgS040. 02kg, Na2HP040. 30kg，蛋白 胨 0. 25kg,黄豆粉 3. 0kg,水 90. 43kg,混勻，调 pH 为 10. 0，0. lMPal21°C 灭菌 35min,冷却 到40°C，制成液态深层发酵培养基，备用；2)取枯草杆菌种子培养液接种，种子培养液的 接种量按液态深层发酵培养基重的3wt%计，接种到冷却至40°C的液态深层发酵培养基， 360C 士 1°C恒温培养70小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300转/分钟，通风量 为1. 4立方气体/升培养基/分钟，制成枯草杆菌液态深层发酵培养液；
(4)粗滤往枯草杆菌深层发酵培养液中添加相当于培养液重5%的硅藻土，混合均勻， 板框压滤，得粗滤液；
(5)粗滤液膜浓缩以微滤膜将粗滤液过滤浓缩其原重量的1/5，制得浓缩液；
(6)冷冻干燥将浓缩液在-30°C下冷冻，抽真空干燥成粉末，即成。本实施例生产的蛋白酶，在pH6条件下测得酶活力达263000u/g ；在pHIO条件下 测得酶活力达280000u/g。
权利要求
一种适应性广的蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)枯草杆菌菌种复壮培养1)复壮培养基配制复壮培养基配方蛋白胨0.9-1.1wt％，牛肉膏0.5-0.7wt％，NaCl0.3-0.5wt％，琼脂2wt%,pH8.5-10.0，其余为水；将所述配料混匀，分放于培养皿中，0.1Mpa120-122℃灭菌30-35min，冷却到室温，制成复壮培养基，备用；2)接种与培养将实验室保存的产蛋白酶的枯草杆菌环移取1-2环，接种到所述复壮培养基，置于36℃±1℃恒温培养60-70h，得复壮菌种，取出低温保存；(2)枯草杆菌种子培养1)种子培养基配制种子培养基配方葡萄糖0.4-0.6wt%，蛋白胨0.4-0.6wt％，酵母膏0.4-0.6wt％，磷酸二氢钾0.05-0.08wt%,硫酸镁0.01-0.02wt%,氯化钠0.3-0.5wt％，其余为水，pH8.5-10.0，将所述配料混匀，0.1MPa120-122℃灭菌30-35min，冷却到39-41℃，制成种子培养基，备用；2)种子培养方法取复壮的枯草杆菌菌种接种，接种量按种子培养基重的1-2wt%计，接种到冷却至39-41℃的种子培养基，36℃±1℃恒温培养60-70小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300-320转/分钟，通风量为1.3-1.4立方气体/升培养基/分钟，制成枯草杆菌种子培养液；(3)液态深层发酵培养1)液态深层发酵培养基配方葡萄糖4.0-6.0wt%，MgS04 0.01-0.02wt％，Na2HPO4 0.20-0.30wt％，蛋白胨0.15-0.25wt％,黄豆粉2.0-3.0wt%，pH8.5-10.0，其余为水；将所述配料混匀，0.1MPa120-122℃灭菌30-35min，冷却到39-41℃，制成液态深层发酵培养基，备用；(2)液态深层发酵培养取枯草杆菌种子培养液接种,种子培养液的接种量按液态深层发酵培养基重的2-3wt%计，接种到冷却到39-41℃的液态深层培养基，36℃±1℃恒温培养60-70小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300-320转/分钟，通风量为1.3-1.4立方气体/升培养基/分钟，制成枯草杆菌液态深层发酵培养液；(4)粗滤往枯草杆菌深层发酵培养液中添加相当于发酵培养液重3-5%的硅藻土，混合均匀，板框压滤，得粗滤液；(5)粗滤液膜浓缩以微滤膜将粗滤液过滤浓缩至其原重量的1/4-1/5，制得浓缩液；(6)冷冻干燥将浓缩液在-30℃下冷冻，抽真空干燥成粉末，即成。
全文摘要
一种适应性广的蛋白酶的制备方法，其包括如下步骤(1)将产蛋白酶的枯草杆菌菌种复壮培养，得枯草杆菌复壮菌种；(2)枯草杆菌种子培养，得枯草杆菌种子培养液；(3)液态深层发酵培养，得枯草杆菌液态深层发酵培养液；(4)将枯草杆菌液态深层发酵培养液加硅藻土板框压滤，得粗滤液；(5)粗滤液膜浓缩，制得浓缩液；(6)将浓缩液冷冻干燥，即成。按本发明方法生产的蛋白酶，酶活力可达250000-280000u/g。适宜在pH6-10的条件下使用。
文档编号C12R1/125GK101805727SQ20101018044
公开日2010年8月18日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者周文化, 周波, 喻凤香, 林亲录, 田蔚, 谭益民 申请人:湖南百能生化技术有限公司