运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用的制作方法
【专利摘要】构建CRISPR-Cas系统表达质粒pSUZM1a-Cas9，pSUZM2a-Cas9，pSUZM3a-Cas9，包含运动发酵单胞菌内源性基因启动子、筛选标记基因和CRISPR系统的Cas9基因。构建表达质粒pUC-T7sgRNA，含复制起点、筛选标记基因、T7基因启动子和终止子、BbsI识别序列和crRNA-tracrRNA序列。设计相应的靶序列，DNA模板经T7RNA聚合酶体外转录，经纯化后获得的sgRNA与Cas9基因表达质粒共电转化大肠杆菌和Z.mobilisZM4。结果表明，利用CRISPR技术能够成功敲除大肠杆菌DH5α的upp基因、有效地消除运动单胞菌中的天然质粒。在研究过程中所建立的Cas9基因表达质粒、sgRNA表达质粒以及成套研究方法可以广泛地用于运动发酵单胞菌基因组中基因的敲除，具有很好的市场应用前景。
【专利说明】运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9表达质粒pSUZMla-Cas9、 pSUZM2a-Cas9、pSUZM3a-Cas9、pUC-T7sgRNA 的构建以及 CRISPR-Cas9 系统在大肠杆菌和运 动发酵单胞菌中的应用，属于基因工程【技术领域】。 【背景技术】
[0002] 运动发酵单胞菌具有乙醇产率高，吸收糖效率高；酸和乙醇耐受性强；发酵时无 需控制加氧；耐高渗透压；基因组小（约2Mbp)，易于开展基因（组）工程（gene or genome engineering)育种等诸多优点。但是，目前运动发酵单胞菌未能大规模地、广泛应用于乙醇 发酵生产，主要限制因素为：其不能将纤维素、半纤维素和淀粉等复杂的碳水化合物多聚体 转化为乙醇；产生多种副产物，如山梨醇、3-羟基丁酮、甘油、乙醛及乙酸、胞外果聚糖等。 此外，运动发酵单胞菌含有的天然质粒较多，如ZM4中就有5个天然质粒，总长 度约为138kb，占该菌染色体长度的6. 7%。大量天然质粒的存在，使细菌在生长时浪费了大 量的能量和脱氧核苷酸用于质粒的复制，而质粒上存在的多个基因及其编码的蛋白质参与 了一些生化反应，其产物可能又会污染环境。
[0003] CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)称 为"成簇规则间隔的短回文重复序列"（简称为CRISPR)，是Janse等人于2002年在详细 比较和分析各种原核生物基因组后发现了这种重复序列，同时还发现在此重复序列的旁 侧经常伴随出现保守的基因。根据重复序列的排列特征，他们将这种独特的重复序列命 名为CRISPR，保守基因编码的蛋白质统称为CRISPR附属蛋白（Cas，CRISPR-association proteins)。研究发现在CRISPR位点的转录产物crRNA (CRISPR RNA)较基因序列短，是经 过核酸酶修饰加工后产生的，而Cas蛋白往往包含核酸结合、切割、修饰的功能域，所以人 们推断CRISPR-Cas系统可能与DNA复制、修复等DNA代谢有关。
[0004] CRISPR_Cas9编辑技术主要由两个部分组成：祀序列sgRNA (single-guide RNA) 和Cas9蛋白质。sgRNA分子是由两段序列构成：1)靶序列长度为20nt，它必须位于PAM序 列之前，需要自行设计；2) crRNA-tracrRNA，该序列实际上是把CRISPR基因中的同向重复 序列（directed repeat)和tracrRNA用4个碱基GAAA连接在一起，以便形成可以为Cas9 蛋白质识别的茎环结构。sgRNA分子可以通过体外或体内转录而成，Cas9基因则是用相应 的表达质粒导入细胞内产生。
[0005] 当把sgRNA和Cas9基因表达质粒共转化受体细胞后，sgRNA通过靶序列与基因对 应的互补序列配对，sgRNA中的其他序列则形成茎环结构，此结构能为Cas9所识别，然后在 PAM (Protospacer-Adjacent Motif)序列上游2-3碱基间将靶基因的DNA双链切断。断 裂的双链DNA可以经过两种修复机制产生Indel突变或基因编辑：在非同源末端连接NHEJ (Non-homologous End Joining)修复机制下，断裂的双链DNA经过DNA修复和重新连接， 从而产生随机的Indel突变。若突变发生在编码区内，会导致码组移动（frameshift)，造成 编码区提前出现终止密码子。如果在转化时同时导入新的DNA模板(质粒DNA，双链DNA，单 链寡聚核苷酸single strand oligonucleotide, ssODN)，断裂的双链DNA就可以通过HDR (homology-directed repair)途径进行准确的基因组重组。综上所述，细菌中内源性质粒 的消除也可采用CRISPR-Cas9编辑技术。常规的质粒消除方法有物理、化学等方法，这些方 法的效率并不高，而且实验过程比较复杂。CRISPR-Cas技术可以用于任何细菌内源质粒的 消除，具有极高的应用价值；敲除了天然质粒的运动发酵单胞菌，可以更好地用于燃料乙醇 发酵的研究和生产；此方法可以应用于运动发酵单胞菌染色体基因的敲出和敲入，建立各 种基因工程菌。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供运动发酵单胞菌中CRISPR-Cas9系统表达质粒 pSUZMla-Cas9、pSUZM2a-Cas9、pSUZM3a-Cas9 和 pUC-T7sgRNA 的构建。
[0007] 本发明提供的运动发酵单胞菌中CRISPR_Cas9系统表达质粒分别命名为 pSUZMla-Cas9、pSUZM2a-Cas9、pSUZM3a-Cas9、pUC-T7sgRNA。
[0008] 其中pSUZMla_Cas9包含运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、质粒pUC18上的 复制起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc， 来自于化胺性链球菌（Streptococcus) CICC10464的Cas9基因。
[0009] 其中pSUZM2a-Cas9包含运动发酵单胞菌内源性质粒PZZM401的复制蛋白序列、质 粒PUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的 启动子Ppdc，来自于化脓性链球菌CICC 10464的Cas9基因。
[0010] 其中pSUZM3a-Cas9包含运动发酵内源性质粒PZZM402上的复制蛋白序列、质粒 PUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启 动子Ppdc，来自于化脓性链球菌CICC10464的Cas9基因。
[0011] pUC-T7sgRNA包含质粒PUC19上的复制起点、氨苄青霉素筛选标记基因、T7基因启 动子和终止子识别序列和crRNA-tracrRNA序列。
[0012] 本发明所提供的 pSUZMla_Cas9、pSUZM2a_Cas9、pSUZM3a_Cas9 载体的构建方法， 包括如下步骤： 1) 以运动发酵单胞菌表达载体pSUZMla、pSUZM2a、pSUZM3a为模板，用以下引物5 '-CT AGGAGGTGACTGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3' 和 5 '-GAGTATTTCTTATCCATTGCTTACTCCATATAT-3' ， 进行PCR扩增，获得载体骨架片段A (pSUZMla)、B (pSUZM2a)和C (pSUZM3a). 2) 以化脓性链球菌CICC10464为模板，用以下引物5'-ATATATGGAGTAAGCAATGGATAAGA AATACTC-3 ' 和 5 ' -CCCACTGCAAGCTACCT TCAGTCACCTCCTAG-3 '，进行 PCR 扩增，获得基因片 段 Cas9。
[0013] 3)分别将载体骨架片段A、B、C和基因片段Cas9经电泳凝胶回收后等摩尔混合， 混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组载体 pSUZMla_Cas9、pSUZM2a_Cas9、pSUZM3a_Cas9。
[0014] 本发明目的提供运动发酵单胞菌表达质粒pUC-T7SgRNA构建方法： l)T7sgRNA基因的设计：人工合成一段双链DNA，全长为177bp，包含T7基因启动子和 终止子、助《si识别序列和crRNA-tracrRNA序列，序列两端分别为//ifldlll和价〇1?1位点。
[0015] T7sgRNA基因序列如下所不：
【权利要求】
1. 一类能在运动发酵单胞菌中表达CRISPR-Cas9系统的表达质粒pSUZMla-Cas9、 pSUZM2a- Cas9和pSUZM3a- Cas9,包含运动发酵单胞菌内源性基因启动子、筛选标记基因 和CRISPR系统的Cas9基因。
2. -类能够通过体外转录形成RNA分子的表达质粒pUC-T7sgRNA，包含复制起点、筛选 标记基因、T7基因启动子和终止子、说《I识别序列和crRNA-tracrRNA序列。
3. 根据权利1所述的质粒，其特征在于： 1. pSUZMla- Cas9包含运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、质粒pUC18上的复制 起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自 于化胺性链球菌（Streptococcus) CICC 10464的Cas9基因； 2. pSUZM2a-Cas9包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制蛋白序列、质粒 PUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启 动子Ppdc，来自于化脓性链球菌CICC 10464的Cas9基因； 3. pSUZM3a-Cas9包含运动发酵内源性质粒pZZM402上的复制蛋白序列、质粒pUC18 上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子 Ppdc，来自于化脓性链球菌CICC10464的Cas9基因。
4. 权利3所述的质粒的构建方法，包括如下步骤： 1) 分别以运动发酵单胞菌表达质粒pSUZMla (含有运动发酵单胞菌染色体上复制起点 oriC、质粒pUC18上的复制起点、运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc)、pSUZM2a (含 有运动发酵单胞菌内源性质粒PZZM401的复制起点和DNA复制酶基因序列、质粒pUC18上 的复制起点、运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc)、pSUZM3a(含有运动发酵单胞菌内 源性质粒PZZM402的复制起点和DNA复制酶基因序列、质粒pUC18上的复制起点、运动发酵 单胞菌的组成型基因启动子Ppdc)为模板，用以下引物5' -CTAGGAGGTGACTGAAGGTAGCTTGCA GTGGG-3' 和 5' - GAGTATTTCTTATCCATTGCTTACTCCATATAT-3'，进行 PCR 扩增，获得载体骨架 2) 以化脓性链球菌CICC10464为模板，用以下引物5' - ATATATGGAGTAAGCAATGGATAAG AAATACTC-3' 和 5' - CCCACTGCAAGCTACCT TCAGTCACCTCCTAG-3'，进行 PCR 扩增，获得基因 片段Cas9 ; (3)分别将载体骨架片段A、B和C与基因片段Cas9经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混 合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组质粒 pSUZMla_Cas9、pSUZM2a_Cas9 和 pSUZM3a_Cas9。
5. 根据权利2所述的质粒，其特征在于： pUC-T7sgRNA质粒包含质粒pUC19上的复制起点、氨苄青霉素筛选标记基因、T7基因启 动子和终止子识别序列和crRNA-tracrRNA序列。
6. 权利4所述的质粒的构建方法，包括如下步骤： l)T7sgRNA基因的设计：人工合成一段双链DNA，全长177bp，包含T7基因启动子和终 止子、助si识别序列和tracrRNA序列，序列两端分别为班/7dIII和feoRI位点； T7sgRNA基因序列如下所τκ :
2) 质粒pUC19和T7sgRNA基因片段分别采用历idlll和feoRI进行双酶切； 3) 酶切后产物进行T4 DNA ligase连接，转化大肠杆菌，获得表达质粒pUC-T7sgRNA。
【文档编号】C12N15/74GK104109687SQ201410332921
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】谭雪梅, 曹庆华, 张义正, 王海燕, 冯红 申请人:四川大学