一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法，构建方法为：①将拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因AtCPR1的5’端的前138个碱基切除，得到SEQ ID NO.2所示序列；②将以SEQ ID NO.3所示的人参中原人参二醇合酶基因PPDS的3’端终止密码子TAA去除，与SEQ ID NO.2所示序列的5’端用编码多肽GGG的碱基序列连接，构建出融合蛋白质的基因元件；③将融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子和终止子连接，构建融合蛋白质基因表达盒，并转化进入酿酒酵母细胞表达。本发明的融合蛋白质，能使达玛烯二醇到原人参二醇的转化效率提高。
【专利说明】一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白 质及构建方法。
【背景技术】
[0002] 人参皂苷是中药人参的主要活性成分，具有保护心血管，抗疲劳，抗衰老和抗癌的 药理作用。传统的人参栽培、组织培养和下游的植物组织提取已很难满足市场对人参皂苷 的需求。
[0003] 作为一种三萜类化合物，酿酒酵母内源代谢途径可为人参皂苷的合成提供前体 2, 3-氧化鲨烯。随后的环氧化、氧化以及糖基添加分别由达玛烯二醇合成酶、原人参二醇合 成酶和糖基转移酶完成。达玛烯二醇合成酶基因于2006年被发现。Tansakul等报道PNA 是催化达玛烯二醇合成的基因。Han等报道了另外一个DDS (DDBJ/EMBL/GenBanK数据库，序 号AB122080)。2011年，Jung-Yeon Han等通过对茉莉酸甲酯诱导的人参不定根进行cDNA 建库，对转录组测序后经过一系列筛选，确定PPDS基因（cyp716a47)编码原人参二醇合成 酶。2014年，GT的筛选也取得一定的进展，周志华等综合已发表的人参转录组的信息，筛选 出能将原人参二醇转化为人参皂苷compound K(CK)的糖基转移酶。
[0004] 基于以上人参皂苷合成途径中相关基因的挖掘，张学礼对酿酒酵母进行工程化， 引入DS、PPDS和拟南芥中的AtCPRl，并对酿酒酵母甲羟戊酸途径限速过程进行过表达，构 建了产原人参二醇的人工酿酒酵母细胞。周志华将筛选到的GT基因植入酿酒酵母中，得到 了能产CK的酿酒酵母细胞。
[0005] PPDS是一种细胞色素 P450单加氧酶。前期的研宄发现，在人工构建的原人参二醇 酿酒酵母合成途径中，PPDS是一个限速的步骤，单纯的增加 PPDS及其还原酶的拷贝并不能 解决问题，致使达玛烯二醇的转化效率相对较低。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种能提高达玛烯二醇转化效率的 融合蛋白质。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构 建方法。
[0008] 本发明的第三个目的是提供一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质在酿 酒酵母中合成人参皂苷中的应用。
[0009] 本发明的技术方案概述如下：
[0010] 一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建方法，包括如下步骤：
[0011] ①将拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因 AtCPRl的5'端的前138个碱基切 除，得到SEQ ID NO. 2所示序列，所述拟南芥中AtCPRl基因以SEQ ID NO. 1所示；
[0012] ②将以SEQ ID NO. 3所示的人参中原人参二醇合酶基因 PPDS的3'端终止密码 子TAA去除，与SEQ ID NO. 2所示序列的5'端用编码多肽GGG的碱基序列连接，构建出 PPDS-I inker3-AtCPRl融合蛋白质的基因元件；
[0013] ③将PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子 和终止子连接，构建PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白质基因表达盒，并转化进入酿酒酵母 细胞表达。
[0014] 上述方法构建的能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质。
[0015] 具体构建过程见实施例3。
[0016] 所述GGG的碱基序列如5' -GGTGGTGGT-3'，但不仅限于此序列。
[0017] 所述酿酒酵母内源启动子如PGKlp(磷酸甘油酸激酶1启动子），序列SEQ ID NO. 7 〇
[0018] 所述酿酒酵母内源终止子如ADH3t (乙醇脱氢酶3)序列SEQ ID NO. 12.
[0019] SEQ ID NO. 1所示的AtCPRl基因序列为拟南芥NADPH-细胞色素 P450还原酶1的 基因针对酿酒酵母的密码子的优化序列。
[0020] SEQ ID NO. 2所示的基因序列为序列SEQ ID NO. 1去除前138bp后得到。
[0021] SEQ ID NO. 3所示的PPDS基因序列为人参中原人参二醇合成酶的基因针对酿酒酵 母的密码子的优化序列。
[0022] 上述融合蛋白质在酿酒酵母中合成人参皂苷中的应用。
[0023] 本发明的优点：
[0024] 实验证明，本发明构建的能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质 PPDS-I inker3-AtCPRl在酿酒酵母中比单独存在的PPDS和AtCPRl催化效率高。这种构建 方法得到的融合蛋白提高了达玛烯二醇的转化效率，有利于人参皂苷在微生物中的高效合 成。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图 I. PGKlp-PPDS-linker3-AtCPRl-ADH3t 融合模块电泳图。
[0026] 图2. PPDS和AtCPRl蛋白质在酿酒酵母细胞内的示意图。图2A为自然条件下两 种蛋白质在酿酒酵母细胞内的示意图；图2B为本发明所构建的PPDS-linker3-AtCPRl融合 蛋白质在酿酒酵母细胞内的不意图。
[0027] 图3.达玛烯二醇和原人参二醇LC-MS分析。
[0028] 图4.自然条件下PPDS和AtCPRl与PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白催化能力对 比。
[0029] 图5.各菌株达玛烯二醇和原人参二醇的产量对比。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0031] 下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 实施例1
[0034] 合成达玛烯二醇酿酒酵母细胞的构建
[0035] 一、模块构建
[0036] 根据达玛烯二醇合酶的氨基酸序列，进行针对酿酒酵母的密码子优化，然后通过 化学合成的方法（金唯智生物科技有限公司合成）得到编码达玛烯二醇合成酶的基因 DS 为 SEQ ID NO. 4;酿酒酵母内源的 tHMGl(SEQ ID NO. 5)，ergl(SEQ ID NO. 6)，以及启动子 PGKlp(SEQ ID N0.7)，TEFlp(SEQ ID N0.8)，TDH3p(SEQ ID N0.9)和终止子 CYClt(SEQ ID NO. 10)，ADHlt(SEQ ID NO. ll)，ADH3t(SEQ ID NO. 12)均来自酿酒酵母 w303-la基因组；筛 选标记基因 leu2来自质粒prs405 (美国ATCC)，his3来自质粒pxp320 (购自Addgene, Inc. WWW. addgene. org) 〇
[0037] 以酿酒酵母 W303-la(美国，ATCC)基因组为模板，以 PGKlp-DS-F (SEQ ID NO. 13) (和 PGKlp-DS-R (SEQ ID NO. 14)以及 DS-CYClt-F (SEQ ID NO. 17)和 DS-CYClt-R (SEQ ID NO. 18)为引物，分别扩增PGKlp启动子和CYClt终止子。
[0038] 以人参中达玛烯二醇合成酶基因 DS(SEQ ID NO. 4)为模板，以DS-F(SEQ ID NO. 15)和DS-R(SEQ ID NO. 16)为引物扩增DS基因。将PGKlp启动子、DS基因和CYClt 终止子用融合PCR的方法融合成DS的表达模块PGKlp-DS-CYClt ;以酿酒酵母W303-la 基因组为模板，以TEFlp-ergl-F(SEQIDN0·19)和TEFlp-ergl-R(SEQIDN0·20)以及 ergl-ADHlt-F(SEQIDN0·23)和ergl-ADHlt-R(SEQIDN0·24)为引物，分别扩增TEFlp启 动子和ADHlt终止子。
[0039] 以 W303-la 基因组为模板，以 ergl-F(SEQ ID NO. 21)和 ergl-R(SEQ ID NO. 22) 为引物扩增ergl基因片段。将TEFlp启动子、ergl基因片段和ADHlt终止子用融合PCR的 方法融合成ergl的表达模块TEFlp-ergl-ADHlt，所用序列见序列表。
[0040] 以酿酒酵母W303-la基因组为模板，以TDH3p-tHMGl-F(SEQ ID NO. 25)和 TDH3-tHMGl-R(SEQ ID N0.26)以及 tHMGl-ADH3t-F(SEQ ID N0.29)*tHMGl-ADH3t-R(SEQ ID NO. 30)为引物，分别扩增TDH3p启动子和ADH3t终止子。
[0041] 以 W303-la基因组为模板，以 tHMGl-F(SEQ ID NO. 27)和 tHMGl-R(SEQ ID NO. 28) 为引物扩增tHMGl基因片段。将TDH3p启动子、tHMGl基因片段和ADH3t终止子用融合PCR 的方法融合成tHMGl的表达模块TDH3p-tHMGl-ADH3t，所用序列见序列表。
[0042] 另外，以 prs405 为模板，以 leu-F(SEQ ID NO. 33)和 leu-R(SEQ ID NO. 34)为 引物扩增leu2标记基因，以酿酒酵母W303-la基因组为模板，以S1-F(SEQ ID NO. 39) 和δ 1-R(SEQ ID NO. 40)为引物，扩增δ位点部分片段，并采用融合PCR的方法构建 leu2- δ 1 转化元件；以 ρχρ320 为模板，以 his-F(SEQ ID NO. 31)和 his-R(SEQ ID NO. 32) 为引物扩增his3标记基因，以酿酒酵母W303-la基因组为模板，以rDNAl-F(SEQ ID NO. 35)和rDNAl-R(SEQ ID NO. 36)为引物扩增rDNA部分片段，并采用融合PCR的方法 构建his3-rDNAl转化元件。模块的自组装转化还需要以酿酒酵母基因组为模板，分别以 rDNA2-F(SEQIDN0.37)、rDNA2-R(SEQIDN0.38)*S2-F(SEQIDN0.41)、S2-R(SEQID NO. 42)为引物扩增rDNA2和δ 2片段。模块构建完成后PCR扩增各模块，并用胶回收的方 法纯化各转化模块。
[0043] 本发明所用PCR酶为北京全式金生物技术有限公司的pfu聚合酶，50 μ L的PCR 扩增体系如下：DNA模板，IyL;前引（10 μ Μ)和后引（10 μ Μ)各lyL;dNTP (2. 5mM)，5 yL; 10XBuffer，10 μ L ;Pfu聚合酶，1 μ L ;最后用双蒸水补齐50 μ L。在PCR仪上设置扩增程 序。扩增条件为98°C预变性2分钟（1个循环）；98°C变性10秒、退火10秒、72°C延伸1分 钟（32个循环）；72°C延伸8分钟（1个循环）。
[0044] 本发明所用融合PCR体系如下：DNA片段总量800ng，摩尔比1:1 ;dNTP(2. 5mM)， 5yL ;10XBuffer，10yL ;Pfu聚合酶，I yL ;最后用双蒸水补齐50yL。在PCR仪上设置扩 增程序。扩增条件为95°C预变性2分钟（1个循环）；95°C变性10秒、退火55°C 30秒、72°C 延伸1分钟（11个循环），72°C延伸5分钟（1个循环）。
[0045] 二、酿酒酵母转化
[0046] 上述模块的转化分两组进行。出发酿酒酵母W303_la在YH)培养基中培养12小 时后取200 μ L加入2mL新鲜的YH)培养基中，培养4-5小时。3000转常温下离心5min收 集菌体，弃去上清后用灭菌的CldH 2O冲洗菌体，在3000转常温下离心5min收集菌体，弃去上 清。然后将ImL IOOmM的醋酸锂加入菌体中，室温下放置5min后在3000转常温下离心5min 收集菌体，制备酿酒酵母感受态细胞。转化混合体系包括240 μ L PEG (50 % W/V)，36 μ L I. OM 醋酸锂，10 μ L ss-DNA，转化片段 PGKlp-DS-CYClt，TEFlp-ergl-ADHlt，his3-rDNAl 和 rDNA2片段各200ng，最后用ddH20补齐至360 μ L。按上述顺序将各项依次加入刚制备的感 受态细胞中，离心漩涡lmin，在42°C水浴30min，4000转常温下离心2min，移去上清后加入 ImLYH)培养基，30°C 150rpm培养2h。4000转常温下离心5min，弃去上清，无菌水洗涤2次， 并用100 μ L无菌水重悬细胞，涂缺失组氨酸的平板进行筛选。筛选培养条件为30°C，培养 48h以上。得到转化DS和过表达ergl的酿酒酵母菌W1。
[0047] 以Wl为出发菌株，过表达DS和tHMGl。以PGKlp-DS-CYClt为模板，以 leu-PGKp-F(SEQ ID NO. 71)和 DS-CYClt-R(SEQ ID NO. 18)为引物，扩增 PGKlp-DS-CYClt 表达盒。酿酒酵母感受态细胞的制备方法同上所述，转化片段PGKlp-DS-CYClt， TDH3p-tHMGl-ADH3t，leu2- δ 1，和δ 2各200ng，转化方法和筛选方法如上所述。然后进行 菌落PCR验证后，得到过表达DS和tHMGl的酿酒酵母菌株W2。
[0048] 实施例2、合成原人参二醇酿酒酵母细胞W3和W3plus的构建
[0049] 根据原人参二醇合酶和拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1的氨基酸序列，进行 针对酿酒酵母的密码子优化，然后通过化学合成的方法（金唯智生物科技有限公司合成） 得到编码人参中原人参二醇合成酶的基因 PPDS基因为序列表中SEQ ID NO. 3和拟南芥中 AtCPRl基因为序列表中的基因序列SEQ ID N0.1。TDH3p，PGKlp和终止子CYClt，ADH3t均 来自酿酒酵母w303_la基因组；筛选标记基因 ura3来自质粒pxp218 (Addgene, Inc. WWW· addgene. org) 〇
[0050] 以酿酒酵母 W303-la 基因组为模板，以 TDH3p-AtCPRl-F(SEQ ID NO. 43) 和 TDH3p-AtCPRl-R(SEQ ID N0.44)以及 AtCPRl-ADH3T-F(SEQ ID N0.47)和 AtCPRl-ADH3T-R(SEQ ID NO. 48)为引物，分别扩增TDH3p启动子和ADH3t终止子。以 AtCPRl(SEQ ID NO. 1)为模板，以 AtCPRl-F (SEQ ID NO. 45)和 AtCPRl-R (SEQ ID NO. 46)为 引物扩增AtCPRl基因片段。将TDH3p启动子、AtCPRl基因片段和ADH3t终止子用融合PCR 的方法融合成AtCPRl的表达模块TDH3p-AtCPRl-ADH3t，PCR和融合PCR的方法同实施例1.
[0051] 以酿酒酵母W303-la基因组为模板，以PGKlp-PPDS-F(SEQ ID NO. 49)和 PGKlp-PPDS-R(SEQ ID NO. 50)以及 PPDS-CYClt-F (SEQ ID NO. 53)和 PPDS-CYClt-R(SEQ ID NO. 54)为引物，分别扩增PGKlp启动子和CYClt终止子。以PPDS(SEQ ID NO. 3)为模 板，以 PPDS-F(SEQ ID NO. 51)和 PPDS-R(SEQ ID NO. 52)为引物扩增 PPDS 基因片段。将 PGKlp启动子、PPDS基因片段和CYClt终止子用融合PCR的方法融合成PPDS的表达模块 PGKlp-ProS-CYClt，PCR和融合PCR的方法同实施例1.
[0052] 另外，以 pxp218 为模板，以 ura-F(SEQ ID NO. 55)和 ura-R(SEQ ID NO. 56)为 引物扩增ura3标记基因，以酿酒酵母W303-la基因组为模板，以S1-F2(SEQ ID NO. 57) 和δ 1-R2(SEQ ID NO. 58)为引物扩增δ位点部分片段，并采用融合PCR的方法构建 ura3-Sl 转化元件；以 W303-la 基因组为模板，以 S2-F(SEQ ID NO. 59)和 S2-R(SEQ ID NO. 60)为引物，扩增转化元件δ2。采用实施例1的转化方法，将PGKlp-ProS-CYClt， TDH3p-AtCPRl-ADH3t，ura3- δ 1和δ 2转化片段以酿酒酵母自组装的方式整合到酿酒酵母 基因组上δ位点上，得到转化子后进行菌落PCR验证，得到合成原人参二醇的酿酒酵母菌 株W3〇
[0053] 在W3的基础上，增加 PPDS和AtCPRl表达模块的拷贝，主要方法如下。以酿酒 酵母 BY4742(美国 ATCC)基因组为模板，以 Ade2-F(SEQ ID NO. 63)和 Ade2-R(SEQ ID NO. 64)为引物扩增ade2标记基因表达元件，以prs405质粒为模板，以leul-F2(SEQ ID NO. 65)和leul-R2(SEQ ID NO. 66)为引物扩增leu2位点部分片段，并采用融合PCR的 方法构建ade2-leul转化元件；以prs405质粒为模板，以Ieu2-F (SEQ ID NO. 67)和 Ieu2-R(SEQ ID NO. 68)为引物，扩增转化元件leu2。同时，以PGKlp-PPDS-CYClt为模 板，以PGK1P-PDDS-F2(SEQ ID N0.61)和PDDS-CYClt-R(SEQ ID N0.54)为引物扩增 PGKlp-PPDS-CYClt 模块；以 TDH3p-AtCPRl-F(SEQ ID NO. 43)和 TDH3p-AtCPRl-R2(SEQ ID NO. 62)为引物扩增TEFlp-AtCPRl-ADH3t模块。采用实施例1的转化方法，将 PGKlp-PPDS-CYClt，TDH3p-AtCPRl-ADH3t，ade2-leul 和 leu2 转化片段各 200ng 以酵母自 组装的方式整合到酿酒酵母基因组leu2位点，菌落PCR验证后，得到增加 PPDS和AtCPRl 模块拷贝的菌株W3 plus。
[0054] 实施例3、一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建
[0055] 根据原人参二醇合酶基因 PPDS和拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因 AtCPRl的氨基酸序列，进行针对酿酒酵母的密码子优化，然后通过化学合成的方法（金唯 智生物科技有限公司合成）得到基因片段。人参中PPDS基因以SEQ ID NO. 3所示，拟南芥 中AtCPRl基因以SEQ ID NO. 1所示；将拟南芥中AtCPRl基因5'端的前138个碱基切除， 得到SEQ ID NO. 2所示序列。内源启动子PGKlp(SEQ ID NO. 7)和内源终止子ADH3t(SEQ ID NO. 12)均来自酿酒酵母w303-la基因组；筛选标记基因 ura3来自质粒pxp218。
[0056] 两个蛋白质中用编码多肽GGG的碱基序列连接，本实施例中编码linker3的碱 基序列为5' -GGTGGTGGT-3'，将该碱基序列设计到引物中并采用融合PCR的方法实现 两个基因片段的连接，具体实施过程为：以原人参二醇合酶基因 PPDS(SEQ ID N0.3)为 模板，以序列表中 PPDS-F(SEQ ID NO. 51)和 PPDS-linker3-R(SEQ ID NO. 69)为引物， 扩增PPDS-linker3片段，该片段去除了人参中原人参二醇合酶基因 PPDS的3'端终止 密码子TAA，同时还含有编码多肽GGG的碱基序列5' -GGTGGTGGT-3' ；以拟南芥中细胞 色素-NADPH-还原酶1基因 AtCPR15 '端的前138个碱基切除序列（SEQ ID NO. 2)为 模板，以linker3-AtCPRl-F(SEQIDN0·70)和AtCPRl-R(SEQIDN0·46)为引物，扩增 linker3-AtCPRl片段，该片段包含编码多肽GGG的碱基序列5'-GGTGGTGGT-3'和去除5'端 138bp 的 AtCPRl 基因序列（SEQ ID N0.2)。将PPDS-linker3 和 linker3-AtCPRl 基因片段用 融合PCR的方法连接成PPDS-I inker3-AtCPRl的基因元件，该元件为PPDS-I inker3-AtCPRl 融合蛋白质的基因元件。PCR和融合PCR的方法同实施例1。
[0057] 将PPDS-linker3_AtCPRl融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子 和终止子连接，构建PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白质基因表达盒，具体实施过程为：以 PGKlp-PPDS-F(SEQIDN0·49)和PGKlp-PPDS-R(SEQIDN0·50)为引物，以W303-la基因组 为模板，扩增PGKlp启动子；以AtCPRl-ADH3t-F(SEQ ID NO. 47)和AtCPRl-ADH3t-R(SEQ ID NO. 48)为引物，以W303-la基因组为模板，扩增ADH3t终止子。将PPDS-linker3-AtCPRl融 合酶的基因元件PPDS-linker3-AtCPRl与酿酒酵母细胞启动子PGKlp和终止子ADH3t用融 合 PCR 连接，构建 PPDS-linker3-AtCPRl 融合酶基因表达盒 PGKlp-PPDS-linker3-AtCPRl-ADH3t (图 1)。
[0058] 以 pxp218 为模板，以 ura-F(SEQ ID NO. 55)和 ura-R(SEQ ID NO. 56)为引物扩增 ura3标记基因，以酵母W303_la基因组为模板，以δ 1-F2(SEQ ID NO. 57)和δ 1-R2(SEQ ID NO. 58)为引物扩增δ位点部分片段，并采用融合PCR的方法构建ura3- δ 1转化元件； 以W303-la基因组为模板，以S2-F(SEQ ID NO. 59)和S2-R(SEQ ID NO. 60)为引物，扩增 转化元件6 2。采用实施例1的转化方法，将PGKlp-PPDS-linker3-AtCPRl-ADH3t表达盒， ura3-δ 1和δ 2转化片段各200ng以酿酒酵母自组装的方式转化进入实施例2得到的酿酒 酵母细胞W2的基因组δ位点上，得到转化子后进行菌落PCR验证后，得到合成原人参二醇 的酿酒酵母菌株W3c。
[0059] 实施例4、融合Ρ450酶的催化能力测定
[0060] 一、酿酒酵母微粒体的制备
[0061] 实施例1，2, 3中得到的酿酒酵母细胞W2，W3和W3c分别在YH)培养基中进行培养 (30°C，220rmp)。培养24h后离心（3000rmp，5min)收集细胞。酿酒酵母细胞用TEK缓冲液 (IOOmM KCl，50mM Tris-HCl，lmM EDTA)重悬，6100g离心3min〇去除上清，加入与菌体量等 量的玻璃珠，并加入提取缓冲液（20mM β -巯基乙醇，1 % BSA，0. 6M山梨醇，50mM Tris-HCl， ImM EDTA)。剧烈震荡20min后，6100g离心15min，将上清过膜后转移至干净的离心管中， 加入MgCl2(50mM)后在冰上放置Ih沉淀微粒体。然后12500g离心20min。上清去除后，离 心管底部的微粒体转移至TEG缓冲液中（30 %甘油，50mM Tris-HCl，ImMEDTA)，并用研磨杵 快速研磨进行均一化处理。
[0062] 二、CO示差法测定P450酶
[0063] 取4mL酿酒酵母细胞微粒体制备液，加入80 μ L 0. 5mmol/L连二亚硫酸钠混勾， 于冰浴中放置2min。将4mL上述制备液体分转入两个比色皿中，其中一份用CO气体鼓泡 lmin，另一份不鼓泡，分别测定两份悬液的紫外吸收光谱。所用仪器为TU-1810型紫外可见 分光光度计（比色皿光程Icm)，扫描波长范围400-500nm。以通CO鼓泡的悬液为样品液，未 通CO的悬液为参比液，绘制示差紫外吸收光谱图。记录450nm和490nm波长处的吸收值， 按以下公式计算P450含量（摩尔消光系数ε为91011^0^450 (mM) = (A45tol-A49cinm)/91。
[0064] 三、P450酶的酶活力的测定
[0065] 在500 μ L IOOmM磷酸二氢钾缓冲液（pH 7. 4)加入IOmg微粒体。达玛烯二醇浓 度500 μ M，在30°C水浴中温育，加入NADPH(ImM)开始反应，每隔5min取一定量的混合液， 加入等体积的正己烧萃取，12000rmp离心2min后过0. 22有机膜备用，最后用HPLC测定原 人参二醇的含量。液相色谱条件：进样量20 μ L，安捷伦ZORBAX SB-Aq ;流动相为甲醇：乙 腈=4:6,流速：lmL/min，紫外检测器波长203nm〇
[0066] 结果：PPDS酶的含量用W3,和W3c微粒体中P450酶的含量减去W2中P450酶的 含量所得。经计算，W3中PPDS的含量为9. 82±0. 83 μM/g微粒体，W3c中PPDS的含量为 9. 30±0. 67 μ M/g微粒体。由此可知，酿酒酵母微粒体中的PPDS浓度差别较小，它们的酶活 测定结果如图4所示。图4中，本实验所构建的PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白质的催化 效率明显高于自然条件下PPDS和AtCPRl的催化效率。
[0067] 实施例5、工程菌株的发酵与发酵产物的LC-MS检测。
[0068] 将实施例2, 3中得到的人工合成酿酒酵母细胞W3，W3plus和W3c分别在YH)培养 基中进行培养（30°C，220rmp)。6天后离心收集细胞，加入丙酮，在冰水浴中进行超声波破 碎lOmin，然后在12000转/min常温条件下离心2min，取上清过0. 22mm有机膜后备用。
[0069] 达玛烯二醇和原人参二醇的定性用LC-MS进行。液相色谱条件：进样量5 μ L，安捷 伦ZORBAX SB-Aq ;流动相为90%乙腈，流速：0. 2mL/min。质谱条件：雾化气和干燥气都为 N2;碰撞电压：-70V ;喷雾电压：3. 8kV ;离子源：APCI ;离子源温度：120°C ;脱溶温度：300°C ; 柱后流出物导入离子源速率jyL/min ;质谱扫描质量数范围：200-1000Da。
[0070] 达玛烯二醇和原人参二醇的定量用HPLC进行，液相色谱条件：进样量20 μ L，安 捷伦ZORBAX SB-Aq;流动相为甲醇：乙腈=4:6,流速：lmL/min。达玛稀二醇购自云南西 力生物技术有限公司（WWW. biobiopha.com)。原人参二醇购自北京索莱宝科技有限公司 (http://www. solarbio. cn/) 〇
[0071] 结果如附图5所示：W3达玛烯二醇和原人参二醇的产量分别为96. 8mg/L和 155. 6mg/L ;W3plus增加了 PPDS和AtCPRl表达模块的拷贝数，达玛烯二醇和原人参二醇的 产量分别为102. 5mg/L和150. 6mg/L ;W3c达玛烯二醇和原人参二醇的产量分别为16. 3mg/ L 和 263. 2mg/L。
[0072] 实验证明，在酿酒酵母W303_la宿主中，单纯的增加 PPDS和AtCPRl表达模块的拷 贝数并不能提高达玛烯二醇的转化率。所构建的PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白质能有效 提高达玛烯二醇的转化效率，从而提高原人参二醇的产量。
【权利要求】
1. 一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建方法，其特征是包括如下步 骤： ① 将拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因 AtCPRl的5'端的前138个碱基切除， 得到SEQ ID NO. 2所示序列，所述拟南芥中AtCPRl基因以SEQ ID NO. 1所示； ② 将以SEQ ID N0.3所示的人参中原人参二醇合酶基因 PPDS的3'端终止密码 子TAA去除，与SEQ ID NO. 2所示序列的5'端用编码多肽GGG的碱基序列连接，构建出 PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白质的基因元件； ③ 将PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子和终 止子连接，构建PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白质基因表达盒，并转化进入酿酒酵母细胞 表达。
2. 权利要求1的方法构建的能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质。
3. 权利要求2的融合蛋白质在酿酒酵母中合成人参皂苷中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK104498577SQ201410736992
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月4日 优先权日:2014年12月4日
【发明者】卢文玉, 赵方龙 申请人:天津大学