非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体及制备方法和应用的制作方法

非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本申请公开了一种非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体及其制备方法和应用。本申请的制备方法，包括用纯化p54免疫蛋白对小鼠免疫，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，用三种筛选抗原进行筛选，获得可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，再通过体内或体外的方法制备单克隆抗体；三种筛选抗原包括，原核表达p54重组蛋白、真核表达p54重组蛋白和人工合成的Seq ID No.1所示序列多肽。本申请，用三种筛选抗原对杂交瘤细胞进行筛选，特别是人工合成所有非洲猪瘟病毒毒株共有的多肽作为筛选抗原，使制备的通用单克隆抗体能够对不同地域来源的毒株进行检测，减小了毒株间地域差异造成的漏检现象，提高了检疫工作质量和效率。
CCTCC No. C2014212
20141203
【专利说明】非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体及制备方法和应用

【技术领域】
[0001] 本申请涉及单克隆抗体领域，特别是涉及一种用于非洲猪瘟病毒毒株的通用单克 隆抗体，以及该单克隆抗体的制备方法和应用。

【背景技术】
[0002] 非洲猪瘟（African Swine Fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，其临床症状表现高热、皮肤 充血、流产、水肿及脏器出血，致死率高达100%。但也有少数毒株感染家猪后，猪只出现亚 急性感染或者隐性带毒。世界动物卫生组织〔OIE〕将其列为A类动物疫病，受到世界各国 的高度重视，我国尚未发生该病，我国已将此病规定为一类动物传染病，并作为动物外来疫 病进行研宄（孙怀昌.中国预防兽医学报，1999,21(21) :117-119)。
[0003] 近年来，非洲猪瘟已由非洲大陆横跨到亚欧大陆的亚美尼亚、乌克兰、俄罗斯，特 别是近年来高加索地区疫情严峻，对我国造成极大威胁。非洲猪瘟在西欧、南美洲和东欧的 发生已经证实，非洲猪瘟一旦传入将给养猪业带来毁灭性的打击。我国已将非洲猪瘟列入 2011年国家动物疫病监测计划，确定新疆、内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、西藏等为重点监测 省区（王宏燕，养猪，2011，4:81-82)。
[0004]目前尚无有效的疫苗，因此通过快速诊断非洲猪瘟抗体水平来判断猪只的感染情 况，从而制定有效的控制和消灭措施，进而及时准确的诊断检测和严格有效的封锁扑杀等 措施是成功消灭非洲猪瘟的有效方法。非洲猪瘟抗体诊断方法包括琼脂扩散试验、ELISA、 免疫印迹、免疫荧光等。目前，我国诊断非洲猪瘟的检测试剂主要依赖进口，拥有自主知识 产权的方法和试剂很少，加之周边国家严峻的疫情形势，我国迫切需要建立自己的检测方 法和试剂。
[0005] 并且，现有的抗体诊断方法中，由于采用活病毒感染细胞来制备抗原导致在临床 运用时检测程序无法标准化操作，且因操作活毒风险大，因此不适合推广运用。目前用于 检测方法及试剂的开发多用基因工程方法表达抗原，主要集中在如p72、p54、p32、PP62、 A104R、B602L、K205R等基因的研宄，其中p72、p54等应用较广。而单克隆抗体的制备也主要 集中在这些结构蛋白，由此建立的基于免疫学方法的商业试剂盒目前世界范围内仅四家。 但是，由于非洲猪瘟病病毒毒株间地域差异大，使得现有的商业试剂盒在使用过程中，容易 出现由某些毒株引起的非洲猪瘟病的漏检现象。


【发明内容】

[0006] 本申请的目的是提供一种新的非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体，以及该通用单 克隆抗体的制备方法和应用。
[0007] 为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
[0008] 本申请一方面公开了一种非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体的制备方法，包括采 用纯化的p54免疫蛋白对小鼠进行免疫，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂 交瘤细胞，然后采用三种筛选抗原对阳性杂交瘤细胞株进行筛选，获得可稳定分泌抗非洲 猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，然后通过体内或体外的方法制备非洲猪瘟病毒毒株通 用单克隆抗体；其中，三种筛选抗原包括，原核表达P54重组蛋白、真核表达p54重组蛋白， 以及人工合成的Seq ID No. 1所示序列的多肽；
[0009] Seq ID No. I ：SSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQWAEV〇
[0010] 需要说明的是，本申请的关键在于采用三种筛选抗原对杂交瘤细胞株进行筛选， 其中Seq ID No. 1所示序列人工合成的多肽，是针对现有所有非洲猪瘟病毒毒株而特别设 计的，该序列经过在NCBI数据库中进行比对，为所有非洲猪瘟病毒毒株所共有，因此，由其 筛选出的杂交瘤细胞株所制备的单克隆抗体具备通用性，能够对不同地域来源的非洲猪瘟 病毒进行检测，从而避免漏检的问题。
[0011] 还需要说明的是，本申请的关键是采用三种筛选抗原对杂交瘤细胞株进行筛选， 尤其是创造性的设计了一条人工合成多肽，从而使得制备的单克隆抗体具备通用性；至于 P54免疫蛋白的制备和纯化、原核表达p54重组蛋白的制备、真核表达p54重组蛋白的制备、 制备融合杂交瘤细胞的具体条件和步骤、杂交瘤细胞的免疫筛选等都可以参考现有的常规 方法进行，在此不累述。筛选获得可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞后， 单克隆抗体的体内或体外的制备方法，也可以参考现有的常规方法；例如，将杂交瘤细胞腹 腔注射动物，如小鼠，采集腹水，分离纯化单克隆抗体；或者，通过体外培养该杂交瘤细胞收 集分泌产生的单克隆抗体。
[0012] 经筛选获得的可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为杂交 瘤细胞株SZCIQASFV1，其微生物保藏号为：CCTCC No. C2014212 ;分类命名为：杂交瘤细胞 hybridoma cell ;保藏时间为：2014年12月3日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心； 保藏地址是：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
[0013] 本申请中，p54免疫蛋白通过以下方式获取，将pMD18-T-p54质粒中p54基因片段 转入pET-52b(+)质粒，并在大肠杆菌DH5a中进行可溶性表达，然后提取纯化表达蛋白，即 P54免疫蛋白。
[0014] 本申请中，原核表达p54重组蛋白为利用pET-52b(+)质粒在大肠杆菌中原核表达 后提取纯化的P54重组蛋白；真核表达p54重组蛋白为利用pFastBac/NT-TOPO昆虫表达系 统真核表达获得的P54重组蛋白。
[0015] 本申请的另一面公开了一种非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体，该通用单克隆抗 体由保藏号CCTCC No. C2014212的杂交瘤细胞株SZCIQASFV1分泌产生。
[0016] 需要说明的是，实际上，本申请的非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体就是由本申 请的制备方法制备获取的。
[0017] 本申请的再一面公开了本申请的通用单克隆抗体在制备非洲猪瘟病毒检测试剂 或设备中的应用。
[0018] 本申请的再一面具体公开了一种含有本申请的通用单克隆抗体的非洲猪瘟病毒 酶联免疫检测试剂盒。
[0019] 在以上研宄的基础上，本申请还提供了一种分泌本申请的非洲猪瘟病毒毒株通用 单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏号为CCTCC No. C2014212。
[0020] 需要说明的是，本申请的分泌非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体的杂交瘤细胞， 实际上，就是非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体的制备方法中筛选获得的可稳定分泌抗非 洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0021] 由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
[0022] 本申请的制备方法，采用三种筛选抗原对杂交瘤细胞进行筛选，特别是设计并人 工合成了一条所有非洲猪瘟病毒毒株共有的多肽作为筛选抗原，使得制备出的单克隆抗体 能够对不同地域来源的非洲猪瘟病毒毒株进行检测，大大减小了毒株间地域差异造成的漏 检现象，提高了检验检疫工作质量和效率。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1 :是本申请实施例中重组表达质粒pET-52b(+)3C/LIC-p54的PCR鉴定结果；
[0024] 图2 :是本申请实施例中pET-52b(+)3C/LIC-p54重组质粒在BL21(DE3)中的诱导 表达产物的SDS-PAGE分析结果；
[0025] 图3 :是本申请实施例中pET-52b(+)3C/LIC-p54重组质粒在BL21(DE3)中的诱导 表达产物的纯化及免疫印迹分析结果；
[0026] 图4 :是本申请实施例中pFastBac-p54重组质粒和Bacmid-p54重组粘粒的PCR鉴 定结果；
[0027] 图5 :是本申请实施例中pFastBac/NT-TOPO昆虫表达系统真核表达p54重组蛋白 的Western-blot鉴定结果；
[0028] 图6 :是本申请实施例中采用ProteinOn XPR36大分子互作仪分析非洲猪瘟病毒 毒株通用单克隆抗体与非洲猪瘟病毒P54蛋白中特定抗原表位多肽A的亲和性的结果图；
[0029] 图7 :是本申请实施例中非洲猪瘟病毒p54蛋白序列的比对分析结果图。

【具体实施方式】
[0030] 由于非洲猪瘟病毒毒株间地域差异大，使得现有的商业试剂盒在使用过程中，容 易出现漏检现象；亟需一种能够对不同地域来源的非洲猪瘟病病毒毒株都具有良好检测效 果的单克隆抗体，因此，本申请旨在研制出一株单克隆抗体，该单抗能与目前世界范围内流 行的所有已知的非洲猪瘟病毒毒株作用，从而为建立基于单克隆抗体的竞争ELISA方法等 免疫学方法提供关键材料与方法，解决现有商业试剂盒漏检的问题，并减少或不用依赖国 夕卜检测试剂，使我国拥有自主的检测能力和检测试剂，严防非洲猪瘟疫情传入我国。
[0031] 基于以上需求和目的，本申请特别设计并人工合成了一条所有已知非洲猪瘟病毒 毒株所共有的多肽，即Seq ID No. 1所示序列的多肽，用于杂交瘤细胞筛选，同时，采用原核 表达P54重组蛋白和真核表达p54重组蛋白进行筛选，使得最终制备的单克隆抗体能够对 现有的所有已知非洲猪瘟病毒毒株进行检测，即非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体。其中， 人工合成的作为筛选抗原的多肽，经NCBI数据库比对证实，理论上，尤其筛选获取的单克 隆抗体可以对所有已知非洲猪瘟病毒毒株进行检测；本申请的试验中也对不同地域来源的 毒株进行了测试，结果与理论相符。
[0032] 需要说明的是，本申请中，人工合成的Seq ID No. 1所示序列的多肽是针对抗原位 点"EDIQFINPYQ"设计的，为了保障免疫效果，所以设计成Seq ID No. 1所示序列多肽；可以 理解，在本申请的基本构思上，在保障抗原位点"EDIQFINPYQ"完整的情况下，可以在Seq ID No. 1所示序列多肽的基础上，在多肽序列前后增减约20个氨基酸，都属于本申请的保护范 围；在不考虑人工合成成本的情况下，还可以在本申请的Seq ID No. 1所示序列多肽基础上 增加更多的氨基酸。
[0033] 在以上研宄的基础上，本申请提供了非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体，及其应 用。可以理解，本申请的单克隆抗体具有良好的通用性，能够对不同地域来源的毒株进行检 测，大大减小了因毒株地域差异造成的漏检；因此，可以制备成试剂盒广泛用于检验检疫工 作；该试剂盒除了含有本申请的单克隆抗体以外，当然也含有其它酶联免疫检测的常规试 剂，在此不累述。
[0034] 下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请 进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
[0035] 实施例1免疫抗原的制备
[0036] 1.目的基因的扩增与纯化
[0037] 设计一对引物，从克隆有非洲猪瘟病毒p54基因的pMD18-T-p54质粒中扩增靶标 基因；其中pMD18-T-p54质粒由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心保存提 供，该质粒中含有如Seq ID No. 10所示序列的552bp的p54基因。该引物的上游引物为 Seq ID No. 2所不序列，下游引物为Seq ID No. 3所不序列。
[0038] Seq ID No. 2 :5, -CAGGGACCCGGTTATACTATTCTCATTGCTATCG-3'
[0039] Seq ID No. 3 :5, -GGCACCAGAGCGTTCAAGGAGTTTTCTAGGTC-3'
[0040] 在引物合成公司合成以上引物后，以pMD18-T-p54质粒为模板进行PCR扩增，反应 条件为 94°C lmin，58°C lmin，30cycles，72°C 5min。
[0041] 反应结束后采用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物，并用胶回收试剂盒回收 纯化目的DNA，即获得靶标基因。
[0042] 2.重组质粒的构建
[0043] 在上述步骤获得的靶标基因中加入T4DNA聚合酶，22 °C孵育30min，75 °C孵育 20min，加入 3C/LIC 载体，22°C孵育 5min，加入 EDTA 后 22°C孵育 5min，构建 pET-52b (+) 3C/ LIC-p54重组质粒。
[0044] 3.重组质粒的转化与鉴定
[0045] 将上述步骤获得的pET-52b (+) 3C/LIC-p54重组质粒转入大肠杆菌DH5 α，并接种 于含100mg/L氨苄青霉素的LB营养琼脂上，37°C培养12h，挑取单个菌落于含50mg/L氨苄 青霉素的LB液体培养基中37°C培养12h后，提取质粒，进行PCR鉴定和测序，检测靶标基因 的完整性。
[0046] 其中PCR鉴定分别采用了两对引物进行，第一对即扩增靶标基因的Seq ID No. 2 和Seq ID No. 3所示引物对，第二对引物为pET_52b(+)3C/LIC质粒自带的T7引物对。PCR鉴 定的凝胶电泳结果如图1所示，图中，M泳道为DNAmarker，1泳道为第一对引物PCR扩增的 电泳结果，2泳道为第二对引物PCR扩增的电泳结果；可见，本例的pET-52b (+) 3C/LIC-p54 重组质粒构建成功，含有约462bp的靶标基因，与理论预期相符。测序结果显示重组质粒中 含有462bp的p54基因，其序列与Seq ID No. 10所示序列相符，进一步验证了本例构建的 pET-52b (+) 3C/LIC-p54重组质粒含有我们所需要的p54基因。
[0047] 需要说明的是，p54基因的前端包含两个启动子，而本例原核表达时只克隆了其中 一个启动子，即P54基因的前端90bp大小的信号肽核苷酸序列未有进行克隆，所以第一对 即扩增靶标基因的Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示引物对扩增产物大小为462bp，该基因 同样包含了 P54蛋白的全部基因序列，只是未包含前端90bp的信号肽核苷酸序列；对本例 来说，不影响p54蛋白的原核表达。
[0048] 4.重组质粒在BL21(DE3)中的诱导表达
[0049] 制备BL21(DE3)细菌感受态细胞，将重组质粒pET-52b(+)3C/LIC-p54转化入 BL21 (DE3)细胞后，在含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上培养，挑取单个菌落，接种于2mL 含100mg/L氨苄青霉素的LB培养液中，37°C，200r/min恒温摇床振荡培养至0D600值为0. 6 左右。加入终浓度为2mM的IPTG，培养2h后收取菌液。将培养液在4°C离心15min，去上 清，收集菌体。用PBS重悬沉淀，4°C IOOOOg离心15min，去上清。用破菌缓冲液重悬菌体， 冰上超声破碎，4°C离心15min，收集上清。用变性不连续的SDS-PAGE对表达产物进行考马 斯亮蓝染色，观察结果。
[0050] 结果如图2所示，图中，M泳道为蛋白分子质量标准；1-5泳道分别为0. 5mM，ImM， 2mM，4mM，8mM IPTG诱导pET-52b (+) 3C/LIC-p54两小时后细菌裂解上清的分析结果；6泳 道为未加 IPTG诱导pET-52b (+) 3C/LIC-p54两小时后细菌裂解上清的分析结果；7泳道为 ImMIPTG诱导BL21 (DE3)两小时后细菌裂解上清的分析结果；8-12泳道分别为ImM IPTG 诱导pET-52b (+) 3C/LIC-p541h，2h，3h，4h，5h后细菌裂解上清的分析结果；13泳道为未加 IPTG诱导pET-52b (+) 3C/LIC-p54两小时后细菌裂解上清的分析结果；14泳道为ImMIPTG 诱导BL21 (DE3)两小时后细菌裂解上清。结果显示，本例构建的pET-52b(+)3C/LIC-p54重 组质粒能够稳定的表达所需的P54重组蛋白。
[0051] 5.表达产物的鉴定
[0052] 将上述步骤培养的菌液，在4°C离心15min，去上清，收集菌体。用PBS重悬沉淀， 4°C IOOOOg离心15min，去上清。用破菌缓冲液重悬菌体，冰上超声破碎，4°C离心15min，收 集上清。采用非洲猪瘟标准阳性血清对表达产物进行免疫印迹分析，以检测目的蛋白的抗 原性。免疫印迹分析结果如图3所示，图中，M为蛋白质分子质量标准，1为样品洗液，2为 目的蛋白纯化样品，3为样品裂解液，4为目的蛋白免疫印迹分析；结果显示，本例获取的重 组蛋白确实为P54重组蛋白。
[0053] 6.表达产物的纯化
[0054] 采用Ni柱亲和层析方法纯化冰上超声破碎的上清液，纯化产物即本例所需要的 免疫抗原，即P54免疫蛋白。
[0055] 实施例2筛选抗原的制备
[0056] 本例采用了三种筛选抗原对杂交瘤细胞进行筛选，一是实施例1中作为免疫抗原 的原核表达P54重组蛋白，将经过镍柱纯化后的p54免疫蛋白作为筛选抗原；二是利用人工 合成的方法合成的Seq ID No. 1所示多肽；三是利用pFastBac/NT-TOPO昆虫表达系统真核 表达P54重组蛋白，将感染重组杆状病毒细胞超声破碎上清作为筛选抗原。
[0057] 其中人工合成的Seq ID No. 1所示多肽是本例在比对了目前已经公开的所有非洲 猪瘟病毒的P54蛋白序列的基础上提出的，所有非洲猪瘟病毒共有的多肽序列，因此，其作 为筛选抗原，理论上可以筛选出所有非洲猪瘟病毒的通用单克隆抗体，对比结果如图7所 不O
[0058] 抗原的具体制备如下：
[0059] Seq ID No. I ：SSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQffAEV
[0060] 1.引物的合成
[0061] 根据pFastBac/NT-TOPO昆虫表达系统合成3组引物，第一组为p54基因扩增引 物对，上游引物NT-T0P0-ASFV54F为Seq ID No. 4所示序列，下游引物NT-T0P0-ASFV54R 为Seq ID No. 5所示序列；第二组为对pFastBac/NT-T0P0-p54重组质粒进行PCR鉴定 的引物对，其上游引物Polyhedrin forward primer为Seq ID No. 6所示序列，下游引物 SV40polyA reverse primer为Seq ID No. 7所不序列；第三组为对Bacmid_p54重组粘粒 进行PCR鉴定的引物对，其上游引物pUC/M13Forward为Seq ID No. 8所示序列，下游引物
[0062] Seq ID No. 4 :5' -ATGGATTCTGAATTTTTTCAACC-3'
[0063] Seq ID No. 5 :5' -TTACAAGGAGTTTTCTAGGTCT-3'
[0064] Seq ID No. 6 :5, -AAATGATAAC CATCT CGC-3，
[0065] Seq ID No. 7 :5, -GGTAT GGCTGATTAT GATC-3'
[0066] Seq ID No. 8 :5' -CCCAG TCACGACGTT GTAAAACG-3'
[0067] Seq ID No. 9 :5' -AGCGGATAAC AATTT CACAC AGG-3'
[0068] 2. pFastBac_p54重组转座载体的构建
[0069] 以与实施例1相同的pMD18T-p54重组质粒作为PCR模板，用第一组引物，即p54 基因扩增引物对p54基因进行扩增，用PureLink HiPure Mini Plasmid Purification Kit 回收PCR产物，即获得靶标基因。取4 μ L靶标基因与1 μ L pFastBac/NT-T0P0载体进行连 接，然后转化DH5a感受态细胞。
[0070] 挑取阳性克隆细菌，采用上述两组引物进行PCR鉴定：一是采用扩增目标基因的 引物对NT-T0P0-ASFV54F和NT-T0P0-ASFV54R进行PCR，即第一组引物。二是采用引物对 NT-T0P0-ASFV54F 和 SV40polyAreverse primer。结果显不，第一组引物扩增得到约 552bp 的片段，与预期的552bp的p54基因相符；第二组引物扩增得到片段大小约为758bp，说明 目的基因已经连接到了载体适合位置，且连接方向正确，获得pFastBac-p54重组质粒。PCR 扩增的部分凝胶电泳结果如图4的A图所示，其中，M为DNAMarker、泳道1和2均是第二组 引物扩增产物的电泳结果，1为阴性菌落质粒扩增产物、2为阳性菌落质粒扩增产物。
[0071] 3.重组粘粒Bacmid_p54构建
[0072] 将10 μ L重组质粒pFastBac_p54转化E. coli DH IOBac感受态细胞。转化完后 往EP管中加入900 μ L LB培养液，37°C摇床225rpm培养4h。以室温，LB培养液按1 :10、 I :100和I :1000三种浓度稀释菌液，分别涂布在含有50 μ g/mL卡那霉素（以下简称K+)、 7 μ g/mL庆大霉素（以下简称G+)、10 μ g/mL四环素（以下简称Tet+)、100 μ g/mL的X-Gal 和40 μ g/mL的IPTG的LB筛选平板上，37°C倒置培养48h。挑取至少10个白斑，接种到上述 组成的筛选平板上，划线分单菌落，37°C倒置培养过夜，确认是否仍为白斑。最终确定为白 斑的菌落重新接种到20mL的LB培养液中，培养液含有K+、G+和Tet+，37°C摇床225rpm培养 过夜。同时将Bacmid-CAT和Bacmid-HTA做同样的操作，分别设为阳性和阴性对照。取出1 份菌液，米用大质粒提取试剂盒PureLink HiPure Plasmid DNAMiniprep Kit提取Bacmid， 其余菌液4°C保存。用两组引物进行PCR鉴定：一是采用第一组引物，即扩增目标基因的引 物对NT-T0P0-ASFV54F和NT-T0P0-ASFV54R进行PCR ;二是采用第三组引物，即引物对pUC/ M13Forward和pUC/M13Reverse进行PCR。PCR扩增产物的部分凝胶电泳图如图4的B图所 示，其中 M 为 DNA Marker、3 为第一组引物即引物对 NT-T0P0-ASFV54F 和 NT-T0P0-ASFV54R 的扩增产物、4为第三组引物即引物对pUC/M13Forward和pUC/M13Reverse的扩增产物、5 为阴性对照。结果显示，第一组引物扩增得到约552bp的片段，与预期的552bp的p54基 因相符；第三组引物扩增得到大小约为2988bp的片段，说明p54基因已经连接到了杆状病 毒载体上。鉴定完成后将4°C保存的余下菌液制备成甘油菌并冻存在_80°C。
[0073] 4.重组杆状病毒AcNPV_p54的获得
[0074] 按 Cellfectil'l? II Reagent 转染试剂盒操作说明，将 Bacmid_p54， Bacmid-CAT，Bacmid-HTA脂质化。脂质化后转染Sf9昆虫细胞，同时把没有转染Bacmid DNA 的正常Sf9昆虫细胞设为空白对照。把细胞置28°C恒温培养箱培养大约72h，期间注意观 察细胞病变情况。大约36小时后细胞出现病变，72小时左右80%细胞出现病变，收集细胞 培养上清，其中含有重组杆状病毒。上清再感染正常细胞，观察细胞病变情况，72小时左右 80%细胞出现病变，收集上清和细胞。将感染重组杆状病毒的细胞超声破碎，提取上清作为 筛选抗原。
[0075] 对筛选抗原进行Western-blot鉴定，结果图图5所示，图中，M为蛋白质marker、 1为正常sf9细胞蛋白、2为p54重组蛋白；结果显示，上清液中含有预期的真核表达p54重 组蛋白
[0076] 实施例3单克隆抗体的制备
[0077] 1.动物免疫
[0078] 将实施例1中制备的纯化p54免疫蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合并乳化，皮下 注射7周龄BALB/c雌鼠，每只0. 2 μ g。14d后用等量弗氏不完全佐剂与p54蛋白混合并乳 化，皮下多点注射。21d后用等量弗氏不完全佐剂与p54蛋白混合并乳化，皮下多点注射。 在计划和SP2/0细胞融合前3d进行不加任何佐剂的加强免疫注射。
[0079] 2.阳性杂交瘤细胞株的建立
[0080] 取效价高的免疫小鼠，将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按10 : 1比例混合，常规 PEG融合法制备杂交瘤细胞。采用实施例2中制备的筛选抗原进行间接ELISA方法检测每 孔杂交瘤细胞培养上清，并设大肠杆菌、Sf9细胞蛋白作为筛选抗原的阴性对照。
[0081] 取同时满足实施例2中的三种筛选抗原间接ELISA结果强阳性的孔，采用有限稀 释法进行亚克隆，连续5次的杂交瘤细胞稀释和连续5次的单克隆抗体测试，并且最后3次 抗体测试，全部阳性率孔穴达100 %，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0082] 3.单克隆抗体的制备
[0083] 取10周龄BALB/c雌鼠，腹腔注射液体石蜡，每只0. 5mL，l周后向腹腔注射 5父106个阳性杂交瘤细胞。7-10(1后小鼠腹部明显胀大，收集腹水并以200017^11离心 5min，上清液即为含抗非洲猪瘟p54蛋白单克隆抗体的腹水，即本例的非洲猪瘟病毒毒株 通用单克隆抗体，一 80°C保存备用。
[0084] 4.单克隆抗体亚类的鉴定
[0085] 将用Sigma公司的单抗亚类鉴定试剂盒内的试剂恢复至室温，在装有试纸卡的小 试管中先加入500 μ L缓冲液，再加500 μ L收集的小鼠腹水，轻轻晃动小试管使试纸卡充分 浸没。再加入ImL抗小鼠抗体胶体金结合物，保持试纸卡有字的一面始终浸在液体中，于室 温下轻轻晃动小试管，直到出现小点。经鉴定，该株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为IgGl 亚类，与预期相符。
[0086] 5.单克隆抗体特异性鉴定
[0087] 分别米用猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、口蹄疫病毒、猪流感病毒、猪伪狂犬病病毒的 全病毒蛋白包被ELISA板，作为检测抗原，采用本例制备的非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆 抗体作为被检抗体，经间接ELISA方法检测，结果显示本例制备的非洲猪瘟病毒毒株通用 单克隆抗体与上述常见猪病病原均无交叉反应，具有良好的特异性。
[0088] 6.单克隆抗体亲和性分析
[0089] 利用ProteinOnXPR36大分子相互作用系统，研宄本例制备的非洲猪瘟病毒毒株 通用单克隆抗体与非洲猪瘟病毒P54蛋白中特定抗原表位多肽A的亲和性，来判断抗原抗 体之间的结合解离程度，从而判断抗原抗体复合物的稳定性。首先活化芯片，将本例制备的 非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体通过化学键结合在芯片上，然后将芯片去活化并测试单 克隆抗体结合是否牢固。将配制好的不同浓度的多肽A作为液相，以25 μ L/min流速通过 结合了单克隆抗体的固相芯片，当抗原抗体的结合达到峰值后再将抗原抗体复合物解离， 测试其解离速率。
[0090] 结果如图6所示，图中，横坐标0S-150S为不同浓度多肽A与单克隆抗体的相互结 合作用，150s-500s为抗原抗体复合物的解离；1是浓度为150nM的多肽A、2是浓度为75nM 的多肽A、3是浓度为37. 5nM的多肽A、4是浓度为18. 75nM的多肽A、5是浓度为9. 375nM 的多肽A、6为PBST缓冲液。
[0091] 结果显示，本例制备的非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体与非洲猪瘟病毒p54蛋 白中特定抗原表位多肽A在室温时的解离速率常数（Kd)为6. 13 X ΙΟ-41/s，其平衡结合常 数（KD)为2. 97X 10-9M，以及结合速率常数（Ka)为2. 06X 1051/Ms ;表明本例制备的非洲 猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体与特定抗原表位多肽A的结合较好，亲和力较强，适合用于 检测诊断。
[0092] 实施例4单克隆抗体的应用
[0093] 1.材料与方法
[0094] I. 1血清和c-ELISA试剂盒
[0095] 非洲猪瘟标准阳性血清购自英国IAH Pirbright实验室；153份阴性血清收集于 国内多个猪场；c-ELISA商品化试剂盒购自西班牙INGENASA公司。
[0096] 1.2包被抗原的制备
[0097] 采用实施例1制备的纯化抗原，即p54免疫蛋白，测定蛋白浓度，用于包被ELISA 板。
[0098] 1. 3单克隆抗体的制备
[0099] 采用实施例3制备的非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体，并标记上辣根过氧化物 酶（HRP)，一 80 °C保存备用。
[0100] 1. 4竞争ELISA操作程序
[0101] 包被：将P54免疫蛋白抗原用包被液稀释至2. 5 μ g/mL，分别加入到96孔酶标板 中，每孔l〇〇yL，置4°C冰箱过夜，或37°C作用lh。
[0102] 洗板：取出酶标板弃去液体，每孔加洗液200 μ L，洗板，共三次。最后一次倒置拍 干。
[0103] 封闭：每孔加封闭液100 yL，37°C反应lh，洗板。
[0104] 加样：样品和弱阳性对照、阳性对照、阴性对照用稀释液作1 :5稀释，混匀，分别加 入ELISA反应板，每孔50 μ L ;37°C反应Ih，洗板。
[0105] 加1. 3中的酶标单抗结合物：每孔加50 μ L IgG-HRP，轻轻混匀。酶标板置37°C作 用30min，反应完成，洗板。
[0106] 加底物液：每孔加10(^1^底物液，37°0作用1〇1^11。
[0107] 终止反应：取出反应板，每孔快速加入50 μ L终止液，在30min内测其OD值。
[0108] 测吸光值：用酶标仪在450nm波长下，测定其吸光值。
[0109] 1. 5竞争ELISA方法实验条件的优化
[0110] L 5. 1抗原包被浓度筛选
[0111] 按间接ELISA实验操作程序，采用矩阵式排列，分别将纯化后的p54按浓度梯度包 被：5、2. 5、1. 25、0. 625 μ g/mL，50 μ!7孔，4°C下包被过夜。酶标单抗06-HRP竖排倍比稀释： 25 X -3200 X，37°C下0· 5h，显色3min，加0· 5M硫酸50 μ L/孔终止显色，选取ODL 5左右， 并综合考虑包被成本和使用酶标单抗的数目，选择最佳包被浓度。
[0112] L 5. 2酶标单抗工作浓度筛选
[0113] 按上述1.4竞争ELISA实验操作程序，采用2.5 μ g/mL的ρ54纯化蛋白包被酶标 板，待检标准阳性血清分别按40 X，80 X，160 X，320 X纵向倍比稀释，并做重复；待检标 准阴性血清按40X稀释作对照，也做重复孔。横向加入竞争06-HRP单抗，并按梯度稀释： 100 X，200 X，400 X，800 X。测定OD值，计算抑制率，取抑制率最高的单抗稀释倍数作为酶 标单抗的最佳工作浓度。
[0114] 1. 6竞争ELISA方法结果判定阈值确定
[0115] 为确定竞争ELISA试验方法判定阴阳性结果的临界值，本实验采用20份阴性血清 作为被检血清，该20份血清经西班牙INGENASA公司的非洲猪瘟抗体ELISA检测试剂盒检 测为阴性血清，按上述优化好的竞争ELISA方法试验程序进行试验，然后测定每份血清的 OD值。按照下列公式计算该20份血清的阻断率，即PI值：
[0116] PI (%) = (1-样品血清平均OD值+阴性血清对照平均OD值）X 100%
[0117] 计算20份血清的平均PI值以及其标准差S。按平均PI值加上3倍标准差S的值 作为阳性结果判定临界值；按平均PI值加上2倍标准差S的值作为阴性结果判定临界值； 位于两者间则判定为可疑样品。
[0118] 1. 7竞争ELISA方法应用于检测田间样本
[0119] 取来源于不同国家的107份血清样品，其中包括53份感染不同毒株的阳性血清样 品和54份阴性血清样品，按上述优化好的操作规程及判定标准检测，并与商业检测试剂盒 进行符合性比较。
[0120] 2 结果
[0121] 2. 1包被抗原浓度的筛选
[0122] 按间接ELISA实验操作程序，采用矩阵式排列，分别将纯化后的ρ54按浓度梯度 包被：5、2. 5、1. 25、0. 625 yg/mL，50 μ!7孔，4°C下包被过夜。上述酶标单抗竖排倍比稀释： 25\-3200父，37°0下0.511，显色31^11，加0.51硫酸5(^17孔终止显色。结果如表1所示。
[0123] 表1抗原浓度筛选结果
[0124]

【权利要求】
1. 一种非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括采用纯化的 p54免疫蛋白对小鼠进行免疫，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞， 然后采用三种筛选抗原对阳性杂交瘤细胞株进行筛选，获得可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒单 克隆抗体的杂交瘤细胞，然后通过体内或体外的方法制备非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗 体；所述三种筛选抗原包括，原核表达P54重组蛋白、真核表达p54重组蛋白和人工合成的 Seq ID No. 1所示序列的多肽； Seq ID No. 1 ：SSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQWAEV〇
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述p54免疫蛋白通过以下方式获 取，将pMD18-T-p54质粒中p54基因片段转入pET-52b(+)质粒，并在大肠杆菌DH5a中进 行可溶性表达，然后提取纯化表达蛋白，即P54免疫蛋白。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述原核表达p54重组蛋白为利用 pET-52b(+)质粒在大肠杆菌中原核表达后提取纯化的p54重组蛋白；所述真核表达p54重 组蛋白为利用pFastBac/NT-TOPO昆虫表达系统真核表达获得的p54重组蛋白。
4. 一种非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体，其特征在于：所述通用单克隆抗体由保藏 号CCTCC No. C2014212的杂交瘤细胞株SZCIQASFV1分泌产生。
5. 根据权利要求4所述的通用单克隆抗体，其特征在于：所述通用单克隆抗体由权利 要求1-3任一项所述的方法制备。
6. 根据权利要求4或5所述的通用单克隆抗体在制备非洲猪瘟病毒检测试剂或设备中 的应用。
7. -种非洲猪瘟病毒酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求 4或5所述的通用单克隆抗体。
8. -种分泌非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏号为CCTCC No.C2014212。
9. 根据权利要求8所述的杂交瘤细胞的制备方法，包括采用纯化的p54免疫蛋白对小 鼠进行免疫，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，然后采用三种筛 选抗原对阳性杂交瘤细胞株进行筛选，对三种筛选抗原均为强阳性的样品进行有限稀释法 细胞亚克隆，连续若干次的杂交瘤细胞稀释和连续若干次的单克隆抗体测试，并且最后三 次抗体测试全部阳性率孔穴达100%的杂交瘤细胞，即获得可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒单 克隆抗体的杂交瘤细胞； 所述三种筛选抗原包括，原核表达P54重组蛋白、真核表达p54重组蛋白和人工合成 的Seq ID No. 1所不序列的多狀； Seq ID No. 1 ：SSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQWAEV〇
【文档编号】C12N5/20GK104497137SQ201410736335
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】曹琛福, 花群义, 刘建利, 唐金明, 吕建强, 宗卉, 张彩虹, 杨俊兴, 孙洁, 廖立珊 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心