用于检测鹅细小病毒的lamp引物与试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测鹅细小病毒的LAMP引物与试剂盒及其应用。本发明所提供的用于检测鹅细小病毒的LAMP引物，为由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成的引物组A，或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成的引物组B；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本发明为鹅细小病毒的检测提供了一个新的技术平台，可用于畜牧业生产单位筛查和检测鹅细小病毒，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
【专利说明】用于检测鹅细小病毒的LAMP引物与试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】中病毒的分子生物学检测方法，涉及一种用于检测鹅细 小病毒的LAMP引物与试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 小鹅癌是由鹅细小病毒（Goose parvovirus GPV)引起的雏鹅的一种急性或亚急 性的败血性传染病，主要侵害4-20日龄的雏鹅，尤其对10日龄以内的雏鹅具有极强的致 死性。该病的主要特点是严重的肠炎、小肠粘膜脱落、坏死，形成特征性的肠内栓塞（急性 型）。由于该病具有传播速度快、发病率和死亡率高的特点，因而给养殖鹅带来了严重的危 害，多年来一直倍受关注。一般认为，小鹅瘟根据流行病学、临床特征和剖检特点，可以做 出初步诊断。但是，最急性型小鹅瘟、小鹅流感、鹅病毒性肠炎以及近年来新发现的鹅副粘 病毒病等疾病均具有相似的临床和剖检特征。为此，开展小鹅瘟的实验室诊断研究具有重 要意义。目前用于小鹅瘟诊断的实验室方法很多，如病毒的分离鉴定、免疫荧光抗体技术、 ABC-ELISA试验和琼脂扩散试验等，其中琼脂扩散试验简便、快速，常用于小鹅瘟病毒或血 清的检查，但是其敏感性较低，很难在临床上推广应用。为此，急需建立一种敏感、准确、快 速、简便的小鹅瘟实验室诊断方法。虽然基于PCR技术的检测方法也已建立，但PCR需要昂 贵的仪器，而且操作繁琐。
[0003] 环介导的等温核酸扩增技术（LAMP)是由T. Notomi (Notomi T, Okayama H, MasubuchiHj et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res2000 ;28 (12) : 63.)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和 一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。 近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人（Imai M，Ninomiya A, Minekawa H, et al. Rapid diagnosis of H5Nlavian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method. J Virol Methods. 2007 ;141 (2):173-80.)利用 LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人（Hayashi N, Arai R,Tada S,Taguchi H, Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/ Dekkera sp.yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method. Food Microbiol. 2007 ;24(7-8) :778-85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了 LAMP特异性引 物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血 性败血病（VHS)、巨细胞病毒（CMV)、埃博拉病毒（EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒（EBV)、虹 彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒（IHHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黄化曲叶病 毒等。但是迄今为止，市场上还未见用于检测鹅细小病毒的LAMP专用引物与试剂盒问世。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种检测鹅细小病毒的环介导等温扩增引物组。
[0005] 本发明所提供的检测鹅细小病毒的环介导等温扩增引物组，具体可为引物组A或 引物组B ;
[0006] 所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组 B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；
[0007] 所述引物I (FIP)、所述引物2 (BIP)、所述引物3 (F3)、所述引物4(B3)、所述引物 5 (LF)和所述引物6 (BF)的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序 列5和序列6。
[0008] 序列1由43个核苷酸组成，序列2由42个核苷酸组成，序列3由18个核苷酸组 成，序列4由19个核苷酸组成，序列5由20个核苷酸组成，序列6由20个核苷酸组成。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂。
[0010] 本发明所提供的检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合 酶、甜菜碱、dNTPs、Mg2+和所述引物组。
[0011] 当所述引物组为所述引物组A时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引 物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜 喊在所述扩增试剂中的配比为 40pmol :40pmol :5pmol :5pmol :20pmol :20pmol :35nmol : 250nmol ：8U ：20 u mol〇
[0012] 当所述引物组为所述引物组B时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物 4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比 为 40pmol :40pmol :5pmol :5pmol :35nmol :250nmol :8U :20iimol〇
[0013] 在本发明中，所述链置换型DNA聚合酶具体可为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合 酶大片段。
[0014] 在本发明的一个实施例中，所述检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂组成如 下：每23 iU所述试剂中含有各40pmol的所述引物1和所述引物2、各5pmol的所述引物 3和所述引物4、各20pmol的所述引物5和所述引物6、35nmol的dNTP、250nmol的MgS04、 8U 的 Bst DNA 聚合酶、20 ii mol 的甜菜碱、500nmol 的 Tris .HCl (pH 8. 8)、250nmol 的 KC1、 250nmol 的（NH4)2S04、0. 25iil 的 Tween20 ;余量为水。
[0015] 本发明的第三个目的是提供一种检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂盒。
[0016] 本发明所提供的检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂盒，含有所述的引物组或 所述试剂。
[0017] 所述试剂盒中还可含有荧光显色剂。
[0018] 所述荧光显色剂可为含有钙黄绿素和MnCl2的水溶液；所述荧光显色剂中，所述钙 黄绿素和所述MnCl2的配比为0. 5mmol : IOmmol。在本发明的一个实施例中，所述突光显色 剂具体为含有〇. 5mmol/L的钙黄绿素和lOmmol/L的MnCl2的水溶液。
[0019] 所述试剂盒中还可含有记载有检测或辅助检测待测样品中是否含有鹅细小病毒 的环介导等温扩增方法的说明书；
[0020] 所述检测或辅助检测待测样品中是否含有鹅细小病毒的环介导等温扩增方法，包 括如下（a)和（b)的步骤：
[0021] (a)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用所述引物组进行环介导等温扩 增；
[0022] (b)根据步骤（a)的扩增结果，按照如下（bl)或（b2)的方法确定所述待测样品中 是否含有鹅细小病毒：
[0023] (bl)反应结束后，若所述待测样品反应液出现白色沉淀物，则所述待测样品中含 有或候选含有鹅细小病毒；反之，则所述待测样品不含或候选不含有鹅细小病毒；
[0024] (b2)反应结束后，向所述待测样品的反应液中加入所述荧光显色剂，然后观察所 述反应液的颜色变化；
[0025] 若所述待测样品反应液为绿色，则所述待测样品中含有或候选含有鹅细小病毒； 若所述待测样品反应液为橙色，则所述待测样品中不含有或候选不含有鹅细小病毒。
[0026] 在本发明中，所述环介导等温扩增反应具体为63°C -65°C (如65°C )条件下的恒 温反应60min。
[0027] 在本发明中，进行所述环介导等温扩增时，所述引物1和所述引物2在反应体系中 的终浓度为I. 6 y M，所述引物3和所述引物4在反应体系中的终浓度为0. 2 y M，所述引物 5和所述引物6在反应体系中的终浓度为0. 8 ii M。所述反应体系具体可由2 ii 1所述基因 组DNA与23 iU所述试剂组成；在所述（b2)中，所述荧光显色剂与所述待测样品的反应液 的体积配比具体可为1:25。
[0028] 如下a)或b)的应用也属于本发明的保护范围：
[0029] a)所述的引物组在制备所述试剂或所述试剂盒中的应用；
[0030] b)所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是 否含有鹅细小病毒的产品中的应用。
[0031] 所述待测样品可为病毒样品或鹅囊液等。
[0032] 在本发明中，所述鹅细小病毒具体为鹅细小病毒JLDA株。
[0033] 本发明具有以下优点：
[0034] 1)高特异性：6条引物对鹅细小病毒靶序列的8个特异区域的识别保证了 LAMP扩 增的高度特异性；
[0035] 2)高灵敏度：灵敏度比普通PCR高100倍；
[0036] 3)结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果（钙黄绿素显色），也可以直接用浊度仪判 断结果；
[0037] 4)操作简单：只要将检测样品（靶核酸）和检测试剂一起放入63_65°C恒温水浴 锅中60分钟后就可以判断结果；
[0038] 5)快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，能将目标片段扩增 IO8-IO9 倍。
[0039] 综上所述，本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到鹅 细小病毒，不需要复杂仪器，为鹅细小病毒的检测提供了一个新的技术平台，可用于畜牧业 生产单位筛查和检测鹅细小病毒，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范 围推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 图1为5套引物组合的LAMP扩增曲线。
[0041] 图2为本发明鹅细小病毒LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果。
[0042] 图3为本发明鹅细小病毒LAMP检测方法特异性的钙黄绿素指示剂染色检测结果。
[0043] 图4为本发明鹅细小病毒LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果。
[0044] 图5为本发明鹅细小病毒LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素指示剂染色检测结果。
[0045] 图6为本发明鹅细小病毒LAMP检测方法灵敏度的PCR检测结果。目标片段为 209bp，DNA Marker 为 D2000。
【具体实施方式】
[0046] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048] 鹅细小病毒JLDA株：记载于"李琳，王楠，邵洪泽等.鹅细小病毒JLDA株主要 结构蛋白VP3基因的克隆及序列分析比较.上海畜牧兽医通讯，2009年06期"一文，公众 可从吉林省畜牧兽医科学研究院获得。
[0049] 实施例1、检测鹅细小病毒的环介导等温扩增引物的设计与合成
[0050] 从美国基因数据库检索获得鹅细小病毒序列（GenBank Accession No. U25749), 通过BLAST软件进行同源性分析，获得鹅细小病毒的特异性保守靶序列，再根据该保守靶 DNA序列，用软件Primer design V4设计用于对鹅细小病毒进行LAMP检测的引物，设计出 5套引物（GV-0、GV-1、GV-4、GV-5、GV-6)，经过实验对比，最终选取了由6条引物组成的引 物组合GV-1，引物序列如表1所示。
[0051] 表1检测鹅细小病毒的环介导等温扩增引物
【权利要求】
1. 检测鹅细小病毒的环介导等温扩增引物组，为引物组A或引物组B ;所述引物组A由 引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物 2、所述引物3和所述引物4组成； 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序 列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
2. 检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dNTPs、 Mg2+和权利要求1或2所述的引物组。
3. 根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述 引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜 菜喊在所述扩增试剂中的配比为 40pmol :40pmol :5pmol :5pmol :20pmol :20pmol :35nmol : 250nmol :8U :20iimol ;或 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换 型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为40pmol :40pmol :5pmol :5pmol : 35nmol :250nmol :8U:20umol〇
4. 根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚 合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
5. 检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求 1所述的引物组，或权利要求2-4中任一所述的试剂。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光显色剂。
7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光显色剂为含有钙黄绿素和 MnCl2的水溶液； 所述突光显色剂中，所述I丐黄绿素和所述MnCl2的配比为0. 5mmol :10mmol。
8. 根据权利要求5-7中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有记载有 检测或辅助检测待测样品中是否含有鹅细小病毒的环介导等温扩增方法的说明书； 所述检测或辅助检测待测样品中是否含有鹅细小病毒的环介导等温扩增方法，包括如 下（a)和（b)的步骤： (a) 以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物组进行环介导等 温扩增； (b) 根据步骤（a)的扩增结果，按照如下（bl)或（b2)的方法确定所述待测样品中是否 含有鹅细小病毒： (bl)反应结束后，若所述待测样品反应液出现白色沉淀物，则所述待测样品中含有或 候选含有鹅细小病毒；反之，则所述待测样品不含或候选不含有鹅细小病毒； (b2)反应结束后，向所述待测样品的反应液中加入权利要求7中所述的荧光显色剂， 然后观察所述反应液的颜色变化； 若所述待测样品反应液为绿色，则所述待测样品中含有或候选含有鹅细小病毒；若所 述待测样品反应液为橙色，则所述待测样品中不含有或候选不含有鹅细小病毒。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述录环介导等温扩增反应为63-65°C 条件下的恒温反应60min。
10. 如下a)或b)的应用： a) 权利要求1所述的引物组在制备权利要求2-4中任一所述试剂或权利要求5-9中任 一所述试剂盒中的应用； b) 权利要求1所述的引物组，或权利要求2-4中任一所述的试剂，或权利要求5-9中任 一所述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有鹅细小病毒的产品中的应用。
【文档编号】C12Q1/70GK104450965SQ201410736708
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】邵洪泽, 程荣华, 呼延含蓉, 李奉京 申请人:吉林省畜牧兽医科学研究院, 北京蓝谱生物技术开发有限公司