一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及能一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋 白质及构建方法及应用。
【背景技术】
[0002] 人参皂苷是中药人参的主要活性成分，具有保护心血管，抗疲劳，抗衰老和抗癌的 药理作用。传统的人参栽培、组织培养和下游的植物组织提取已很难满足市场对人参皂苷 的需求。
[0003] 作为一种三萜类化合物，酵母内源代谢途径可为人参皂苷的合成提供前体 2, 3-氧化鲨烯。随后的环氧化、氧化以及糖基添加分别由达玛烯二醇合成酶、原人参二醇 合成酶和糖基转移酶完成。达玛烯二醇合成酶基因于2006年被发现。Tansakul等报道 PNA (DDBJ数据库，序号AB265170)是催化达玛烯二醇合成的基因。Han等报道了另外一个 DDS(DDBJ/EMBL/GenBanK 数据库，序号 AB122080)。2011 年，Jung-Yeon Han 等通过对茉莉 酸甲酯诱导的人参不定根进行cDNA建库，对转录组测序后经过一系列筛选，确定PPDS基因 (Cyp716a47)编码原人参二醇合成酶。2014年，GT的筛选也取得一定的进展，周志华等综 合已发表的人参转录组的信息，筛选出能将原人参二醇转化为人参皂苷compound K(CK)的 糖基转移酶。
[0004] 基于以上人参皂苷合成途径中相关基因的挖掘，张学礼对酿酒酵母进行工程化， 引入DS、PPDS和拟南芥中的AtCPRl，并对酵母甲羟戊酸途径限速过程进行过表达，构建了 产原人参二醇的人工酵母细胞。周志华将筛选到的GT基因植入酿酒酵母中，得到了能产CK 的酵母细胞。
[0005] PPDS是一种细胞色素 P450单加氧酶。前期的研宄发现，在人工构建的原人参二醇 酵母合成途径中，PPDS是一个限速的步骤，单纯的增加 PPDS及其还原酶的拷贝并不能解决 问题，致使达玛烯二醇的转化效率相对较低。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种能提高达玛烯二醇转化效率的 融合蛋白质。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构 建方法。
[0008] 本发明的第三个目的是提供一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的应 用。
[0009] 本发明的技术方案概述如下：
[0010] -种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建方法，包括如下步骤：
[0011] ①将拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因 AtCPRl的5'端的前138个碱基切 除，得到SEQ ID NO. 2所示序列，所述拟南芥中AtCPRl基因以SEQ ID NO. 1所示；
[0012] ②将以SEQ ID NO. 3所示的人参中原人参二醇合酶基因 PPDS的3'端终止密码子 TAA去除，与SEQ ID NO. 2所示序列的5'端用编码多肽GSTSSGSG的碱基序列连接，构建出 PPDS-Iinkerl-AtCPRl融合蛋白质的基因元件；
[0013] ③将PPDS-Iinkerl-AtCPRl融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子 和终止子连接，构建PPDS-Iinkerl-AtCPRl融合蛋白质基因表达盒，并转化进入酿酒酵母 细胞表达。
[0014] 具体构建过程见实施例3。
[0015] 上述方法构建的能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质 PPDS-Iinkerl-AtCPRl。
[0016] 上述融合蛋白质在酿酒酵母中合成人参皂苷中的应用。
[0017] 编码多肽 GSTSSGSG 的碱基序列如 5' -GGTTCTACTTCTTCAGGTTCAGGT-3'，但不仅限 于此序列。
[0018] 酿酒酵母内源启动子如PGKlp (磷酸甘油酸激酶1启动子），序列SEQ ID NO. 7。
[0019] 酿酒酵母内源终止子如ADH3t (乙醇脱氢酶3)序列SEQ ID NO. 12.
[0020] SEQ ID NO. 1所示的AtCPRl基因序列为拟南芥NADPH-细胞色素 P450还原酶1的 基因针对酿酒酵母的密码子的优化序列。
[0021] SEQ ID NO. 2所示的基因序列为序列SEQ ID NO. 1去除前138bp后得到。
[0022] SEQ ID NO. 3所示的PPDS基因序列为人参中原人参二醇合成酶的基因针对酿酒酵 母的密码子的优化序列。
[0023] 本发明的优点：
[0024] 实验证明，本发明构建的能提高达玛烯二醇转化效率的PPDS-Iinkerl-AtCPRl融 合蛋白质在酿酒酵母中比单独存在的PPDS和AtCPRl催化效率高。这种构建方法得到的融 合蛋白提高了达玛烯二醇的转化效率，有利于人参皂苷在微生物中的高效合成。
【附图说明】
[0025] 图 I. PGKlp-PPDS-linkerl-AtCPRl-ADH3t 融合模块电泳图。
[0026] 图2. PPDS和AtCPRl蛋白质在酵母细胞内的示意图。图2A为自然条件下两种蛋 白质在酵母细胞内的示意图；图2B为本发明所构建的PPDS-Iinkerl-AtCPRl融合蛋白质在 酵母细胞内的示意图。
[0027] 图3.达玛烯二醇和原人参二醇LC-MS分析。
[0028] 图4.自然条件下PPDS和AtCPRl与PPDS-Iinkerl-AtCPRl融合蛋白催化能力对 比。
[0029] 图5.各菌株达玛烯二醇和原人参二醇的产量对比。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0031] 下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 实施例1
[0034] 合成达玛烯二醇酿酒酵母细胞的构建
[0035] 一、模块构建
[0036] 根据人参中达玛烯二醇合酶的氨基酸序列，进行针对酿酒酵母的密码子优化，然 后通过化学合成的方法（金唯智生物科技有限公司合成）得到编码达玛烯二醇合成酶的基 因 DS为SEQIDN0.4;酿酒酵母内源的tHMGl(SEQIDN0.5)，ergl(SEQIDN0.6)，以及启动 子PGKlp(SEQIDNO·7)，TEFlp(SEQIDNO·8)，TDH3p(SEQIDNO·9)和终止子CYClt(SEQID NO. 10)，ADHlt(SEQ ID NO. ll)，ADH3t(SEQ ID NO. 12)均来自酿酒酵母 w303-la基因组；筛 选标记基因 leu2来自质粒prs405 (美国ATCC)，his3来自质粒pxp320 (购自Addgene, Inc. WWW. addgene. org) 〇
[0037] 以酿酒酵母 W303-la(美国，ATCC)基因组为模板，以 PGKlp-DS-F (SEQ ID NO. 13) (和 PGKlp-DS-R (SEQ ID NO. 14)以及 DS-CYClt-F (SEQ ID NO. 17)和 DS-CYClt-R (SEQ ID NO. 18)为引物，分别扩增PGKlp启动子和CYClt终止子。
[0038] 以达玛烯二醇合成酶基因 DS (SEQ ID NO. 4)为模板，以DS-F (SEQ ID NO. 15)和 DS-R(SEQ ID NO. 16)为引物扩增DS基因。将PGKlp启动子、DS基因和CYClt终止子用融 合PCR的方法融合成DS的表达模块PGKlp-DS-CYClt ;以酿酒酵母W303-la基因组为模板， &TEFlp-ergl-F(SEQIDN0.19)*TEFlp-ergl-R(SEQIDN0.20)W&ergl-ADHlt-F(SEQ ID NO. 23)和 ergl-ADHlt-R(SEQ ID NO. 24)为引物，分别扩增 TEFlp 启动子和 ADHlt 终止 子。以 W303-la 基因组为模板，以 ergl-F(SEQ ID N0.21)和 ergl-R(SEQ ID N0.22)为引 物扩增ergl基因片段。将TEFlp启动子、ergl基因片段和ADHlt终止子用融合PCR的方 法融合成ergl的表达模块TEFlp-ergl-ADHlt，所用序列见序列表。
[0039] 以酿酒酵母W303-la基因组为模板，以TDH3p-tHMGl-F(SEQ ID NO. 25)和 TDH3-tHMGl-R(SEQ ID N0.26)以及 tHMGl-ADH3t-F(SEQ ID N0.29)*tHMGl-ADH3t-R(SEQ ID NO. 30)为引物，分别扩增TDH3p启动子和ADH3t终止子。
[0040] 以 W303-la基因组为模板，以 tHMGl-F(SEQ ID NO. 27)和 tHMGl-R(SEQ ID NO. 28) 为引物扩增tHMGl基因片段。将TDH3p启动子、tHMGl基因片段和ADH3t终止子用融合PCR 的方法融合成tHMGl的表达模块TDH3p-tHMGl-ADH3t，所用序列见序列表。
[0041] 另外，以 prs405 为模板，以 leu-F(SEQ ID NO. 33)和 leu-R(SEQ ID NO. 34)为 引物扩增leu2标记基因，以酿酒酵母W303-la基因组为模板，以S1-F(SEQ ID NO. 39) 和δ 1-R(SEQ ID NO. 40)为引物，扩增δ位点部分片段，并采用融合PCR的方法构建 leu2- δ 1 转化元件；以 ρχρ320 为模板，以 his-F(SEQ ID NO. 31)和 his-R(SEQ ID NO. 32) 为引物扩增his3标记基因，以酿酒酵母W303-la基因组为模板，以rDNAl-F(SEQ ID NO. 35)和rDNAl-R(SEQ ID NO. 36