一种羽叶三七达玛烯二醇合酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种羽叶三七达玛烯二醇合酶基因及其应用，本专利首次利用第二代SolexaHiSeq2000进行羽叶三七根茎转录组测序及 Denovo 拼接。分析找到羽叶三七中编码达玛烯二醇合成酶（DS）的候选基因并进行体外克隆，最终获得了羽叶三七达玛烯二醇合酶基因，其序列为SEQIDNO.1所示。将该基因通过农杆菌介导的遗传转化转入羽叶三七，可获得高达玛烷皂苷含量的的转基因植株，为达玛烷型皂苷的工业化生产提供了技术支撑。
【专利说明】—种羽叶三七达玛烯二醇合酶基因及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物【技术领域】，主要涉及羽叶三七中达玛烯二醇合成酶(Dammarened1l synthase, DS)基因的克隆和应用。
【背景技术】
[0002]羽叶三七(Panaxjaponicus.C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wu etΚ.Μ.Feng)属于五加科人参属(Panax L.)植物,是传统的名贵药材之一,具有较高的药用价值，如清热解毒、顺气健胃、活血祛疲、滋补强壮等作用，其主要有效成分为皂苷类化合物，其中以齐墩果烷型五环三萜类皂苷为主，同时含有少量达玛烷型四环三萜类皂苷。
[0003]羽叶三七是中国药典收载品种。具有广阔的应用前景和可观的经济价值，目前中国羽叶三七的野生资源近于濒危，通过研究羽叶三七中活性成分三萜皂苷类化合物的生物合成途径及其调控的分子机制，找出其中的关键酶，实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对三萜皂苷生物合成进行人工调控，进一步实现三萜皂苷类化合物的规模生产，以提供医药市场的需求。
[0004]羽叶三七中的达玛烷型四环三萜类皂苷化合物来自于异戊二烯途径。2，3-氧化角鲨烯的环化是三萜皂苷合成下游途径中的关键步骤，这一步由达玛烯二醇合成酶(DS)催化产生原人参二醇，以该化合物为基础在下游最终合成各种达玛烷型皂苷。因此，该反应步骤是三萜皂苷生物合成的重要调控位点。
[0005]迄今为止，关于羽叶三七活性成分代谢途径的生物合成研究尚属空白，羽叶三七中达玛烯二醇合成酶(DS)基因的克隆研究也未见相关报道。本专利首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行羽叶三七根莖转录组测序及De novo拼接。分析找到羽叶三七中编码达玛烯二醇合成酶(DS)的候选基因并进行体外克隆、表达验证，羽叶三七中的达玛烷型四环三萜类皂苷化合物来自于异戊二烯途径。2，3-氧化角鲨烯的环化是三萜皂苷合成下游途径中的关键步骤，这一步由达玛烯二醇合成酶(DS)催化产生原人参二醇，以该化合物为基础在下游最终合成各种达玛烷型皂苷。因此，该反应步骤是三萜皂苷生物合成的重要调控位点，为进一步了解该酶在羽叶三七植物体内基因表达、功能与作用机制奠定了研究基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种羽叶三七达玛烯二醇合酶(DS)基因，其序列为SEQ IDN0.1所示。该基因编码的达玛烯二醇合酶在达玛烷型皂苷化合物合成途径中起关键性作用。
[0007]本发明第二个目的是提供一种羽叶三七达玛烯二醇合酶基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID N0.2所示。
[0008]本发明的最后一个目的在于提供羽叶三七达玛烯二醇合酶基因在提高人参属植物达玛烷型皂苷化合物含量中的应用，特别是在提高羽叶三七达玛烷型皂苷化合物含量中的应用。
[0009]为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施:
[0010]一种羽叶三七达玛烯二醇合酶基因(Dammarened1l synthase,以下简称DS基因)，其制备方法如下:
[0011]以羽叶三七的CDNA链为模板，以正向引物Pl:5’ -ATGTGGAAGCTGAAGGTTGCTCAAG-3’，反向引物 P2:5’ -TTAAATTTTGAGCTGCTGGTGGT-3’，进行 PCR 扩增。扩增体系如下:1Xbuffer 2.5ul, dNTP I ul，引物 Pl 和 P2 各 lul，Taq 酶 0.5 ul，模版 lul，其余用水补足，总体积共25ul。反应条件:30个反应循环，94°C变性lmin，42°C退火2min，75°C延伸3min,最后 75°C延伸 lOmin。
[0012]最终获得了 DS基因，其序列为SEQ ID N0.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID N0.2所示。
[0013]一种羽叶三七达玛烯二醇合成酶(DS)基因在提高羽叶三七达玛烷型皂苷化合物含量中的应用，其应用过程如下:
[0014]将羽叶三七达玛烯二醇合成酶蛋白质(SEQ ID N0.2所示)对应的DS基因(优选SE Q ID N0.1所示)通过农杆菌介导的遗传转化转入羽叶三七，可获得高达玛烷皂苷含量的的转基因植株。
[0015]本发明的所要保护的内容还包括:
[0016]编码SEQ ID N0.2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列
[0017]含有本发明的羽叶三七达玛烯二醇合酶(DS)基因全序列或其ORF序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围，所述原核类载体包括但不限于pT7-Blue ;所述真核类表达载体包括但不限于pYES2、pBI 121，pRS314。
[0018]含有本发明的羽叶三七达玛烯二醇合酶(DS)基因全序列或其ORF序列宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围，包括但不限于E.col1、烟草、拟南芥、酵母宿主菌GIL77、大肠杆菌、羽叶三七等活体材料。
[0019]本发明的羽叶三七达玛烯二醇合酶(DS)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的羽叶三七达玛烯二醇合酶(DS)基因全序列或其ORF序列转化获得转基因生物体。
[0020]利用本发明的羽叶三七达玛烯二醇合酶(DS)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与羽叶三七达玛烯二醇合酶(DS)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
[0021]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0022]本发明所提供的羽叶三七达玛烯二醇合酶(DS)基因是首次从羽叶三七中克隆制备的，利用本发明的技术可以对羽叶三七等含有同类化合物的药用植物进行基因工程改造，通过转基因来提高植物体内的达玛烷皂苷化合物的含量。羽叶三七达玛烯二醇合成酶(DS)基因可参与羽叶三七达玛烷型皂苷化合物的生物合成，因此本申请为羽叶三七达玛烷型皂苷化合物生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。
[0023]进一步添加其产业上的积极效果，本发明利用转基因技术得到了达玛烷型皂苷化合物含量增加的高产株，为达玛烷型皂苷的工业化生产提供了技术支撑。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为羽叶三七RNA电泳图。
[0025]图2为DS功能域预测分析示意图。
[0026]图3为DS系统进化树。
[0027]采用邻接法构建PpgDS系统发育树。
[0028]图4为酶活力检测示意图。
[0029]HPLC检测酶促产物，图A酶产物被HPLC检测分析，检测紫外波长为202nm ;B图为达玛烯二醇HPLC分析图。
【具体实施方式】
[0030]本发明所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别说明，均购自生化商店。
[0031]实施例1
[0032]羽叶三七根茎转录组测序及数据分析
[0033]1、样品采集
[0034]四年生羽叶三七(Panax japonicus.C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wuet Κ.M.Feng)采自湖北恩施。分别取根茎、叶、花，果实置液氮中速冻后，在_80°C冰箱中冷冻保存备用。
[0035]2、羽叶三七总RNA的分离和检测
[0036]对_80°C保存的各类样本于液氮中充分研磨，然后采用优化的Trizol法对样本进行总RNA的提取，全过程保证在低温条件下进行，加入一定浓度的PVP溶液(聚乙烯吡咯烷酮)，并适当加大β -巯基乙醇的浓度，离心去除PVP和β -巯基乙醇后，采用高浓度NaAc溶液析出RNA，DNase去除残留DNA完成RNA的纯化。用1.0%琼脂糖电泳检测RNA的完整性(图1)，用Nanodrop2000核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度，RNA样本置于_80°C冰箱备用。
[0037]3、转录组测序(RNA-Seq)
[0038]用oligo(dT)的磁珠从总 RNA 中富集 mRNA,接加入 fragmentat1n buffer 将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链,然后加入缓冲液、dNTPs> RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链,在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并被EB缓冲液洗脱之后进行末端修复、加poly (A)并连接测序接头，琼脂糖凝胶电泳分离并选择片段大小，PCR扩增构建测序文库，利用第二代SolexaHiSeq2000进行RNA测序，及De novo拼接。
[0039]4、候选基因初步筛
[0040]通过GO注释，Blast比对分析以及MEGA5.0构建系统发育树(图3)等软件分析初步找到羽叶三七中编码达玛烯二醇合酶的候选基因。
[0041]实施例2:
[0042]羽叶三七达玛烯二醇合酶基因的克隆:
[0043]利用正向引物Pl:5’ -ATGTGGAAGCTGAAGGTTGC-3’，反向引物 P2:5’ -TTAAATTTTGAGCTGCTGGTGG-3’，以羽叶三七根茎cDNA文库为模板扩增候选基因全长序列进行P CR扩增。扩增体系如下:10 Xbuffer 2.5ul, dNTP I ul，引物 Pl 和 P2 各 lul，Taq 酶 0.5ul，模版lul，其余用水补足，总体积共25ul。反应条件:30个反应循环，94°C变性lmin，42°C退火2min，75°C延伸 3min。最后 75°C延伸 1min0
[0044]克隆候选基因全长序列后，链接到克隆载体pT7_Blue上并转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5a中，步骤如下:
[0045]a)从_80°C超低温冰箱中取100 μ L感受态细胞悬液，解冻后置于冰上；
[0046]b)加入5 μ L连接产物，用移液器轻轻吹打混匀，冰上放置30min ；
[0047]c) 42°C热激90s，迅速置冰上5min ；
[0048]d)向EP管中加入ImL LB液体培养基(不含抗生素)，37°C 200rpm 45min ；
[0049]e)摇菌后取100 μ L菌液涂布于含抗生素的平板上，37°C培养箱过夜；
[0050]f)挑取单菌落于4mL含抗生素的LB液体培养基中，37°C 200rpm振荡培样过夜选取阳性克隆送样测序。
[0051]至此获得了羽叶三七达玛烯二醇合酶基因，其序列为SEQ ID N0.1所示。
[0052]实施例3:
[0053]DS基因的生物信息学分析
[0054]本发明获得的羽叶三七达玛烯二醇合酶(DS)基因全长为2310bp，其序列为SEQID N0.1所示，其中开放读码框位于I?2310bp，编码的蛋白质序列为SEQ ID N0.2所示。将拼接分析好的达玛烯二醇合酶全长序列在NCBI数据库中进行Blast，该基因具有典型的IS0PREN_C2_like superfamily 结构域，如图 2。
[0055]实施例4:
[0056]DS基因功能的研究
[0057]1、表达载体的构建
[0058]以羽叶三七DS cDNA为模版，利用正向引物Pl: 5’ -GGTACCATGTGGAAGCTGAAGGTTGC-3’ ；反向引物 P2:5’ -CTCGAGTTAAATTTTGAGCTGCTGGTGG-3’ 进行 PCR 反应，取 5ul 扩增产物凝胶电泳，半小时后照相，观察胶图，扩增片段为2322bp。以KpnI和XhoI酶切扩增产物2小时，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用Kp nl和XhoI酶在37°C下酶切pRS314载体2小时，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用试剂盒回收大小约4761bp的片段。
[0059]二者经连接酶在16°C连接过夜。转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有氨苄霉素的LB平板上筛选重组子。含DS克隆的pRS314质粒经PCR和限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列分析，保存且有正确目标的重组质粒PRS314-DS用于表达转化。该表达载体命名为 pRS314-DS。
[0060]2、蛋白的诱导表达
[0061]以PRS314-DS质粒转化部分酶解酵母宿主菌AB1380，培养5天后筛选阳性酵母于2ml含2%葡萄糖的USM培养基上，4_5天后挑取单克隆2ml USM液体培养基中，30°C剧烈震荡培养过夜。5000rpm离心培养5min，弃上清，以含2%葡萄糖的USM液体培养基稀释20倍，30°C剧烈震荡培养24h。提取培养细胞总蛋白。选取高表达转化子以50ml含2%葡萄糖的USM液体培养基30°C剧烈震荡培养20h后，接种到IL不含葡萄糖的USM液体培养基30°C剧烈震荡培养40h，回收菌体，分离微粒体，纯化蛋白。
[0062]3、酶促反应鉴定
[0063]体外酶促反应以2，3-氧鲨烯(50 umolL—1)作为反应底物，向体系中加TritonX-100 (I mg mF1), 10 mmol L-1 Tris (pH6.0), 0.2 mmol L-1 EDTA, 2ug 纯化蛋白。25°C条件下剧烈摇晃30min，后加入Iml 40% KOH终止酶促反应。
[0064]HPLC分析其酶促产物。色谱柱为硅胶柱(4.6 mmX250 mm);流动相为磷酸盐缓冲液(50 mM, pH 4.5)和乙腈(90:10, v/v),流速 I mL/min ;检测波长为 220 nm ;柱温 40。。。
[0065]将酶促产物与标准品对比，如图4所示，经HPLC检测，两种物质波峰完全一致，则可证明，酶促产物为达玛烯二醇。
[0066]实施例5:
[0067]DS在羽叶三七中进行真核表达及转基因羽叶三七发根中达玛烷型皂苷化合物含量的测定
[0068]转基因用的受体材料羽叶三七(Panax japonicus.C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wu et Κ.M.Feng)米自湖北恩施市。
[0069]采用本领域的常规技术，根据羽叶三七达玛烯二醇合酶基因的全长cDNA序列(SEQ ID N0.1)，在扩增编码区的正反方向引物上引入限制性内切酶位点(视选用的载体而定)，构建植物表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化转入羽叶三七，筛选转基因植株检测其达玛烷型皂苷的含量。
[0070]具体如下:
[0071]实施例2中获得的DS基因编码区(SEQ ID N0.1所示)连接到pMD 18-T simpleV ector的质粒上，进行PCR扩增后，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点KpnI和 Sail，利用正向引物 Pl:5’ -GGTACCATGTGGAAGCTGAAGGTTGC-3’ ;反向引物 P2:5’ -GTCGACTTAAATTTTGAGCTGCTGGTGG-3’ 进行 PCR 反应，TA 克隆，提取质粒。
[0072]用KpnI和SalI双酶切含目的基因序列PpgDS和原核表达载体质粒pBI121，酶切产物经琼脂糖电泳后回收相应的片段，PBI121载体与PpgDS目的基因片段经T4DNA连接酶在16°C下进行连接反应16h，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，用50ug/mL卡那霉素筛选，挑取阳性单克隆菌落扩大培养，提取质粒并进行酶切鉴定，将酶切鉴定好的表达载体pB1-PpgDS转入农杆菌中，遗传转化羽叶三七。
[0073]利用发根农杆菌介导的羽叶三七的遗传转化，所需的材料和操作步骤如下:
[0074]I)发根农杆菌A4，使用前自冰箱中取出，用YEB培养基传代2次，菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，28 °C培养过夜。
[0075]2)取羽叶三七细嫩叶片，洗净后置于70%酒精中浸泡lmin，弃酒精，加入2%次氯酸钠消毒lOmin，期间摇动数次，弃去消毒液，用无菌水漂洗4?5次，置于无菌滤纸上晾干，用无菌刀片将羽叶三七叶片切成5mmX5mm小片，置于预培养固体培养基上，在(23±1)°C暗箱培养箱中预培养2d。
[0076]3)经过夜培养的发根农杆菌A4菌液离心后，菌体沉淀用1/2MS重悬，置于4°C中2h后取出。将预培养过的羽叶三七叶片浸泡于1/2MS重悬的菌液中5min，用无菌滤纸吸去多余菌液，放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基中，(23±1) °C黑暗条件下培养，每2周转移到新鲜培养基中I次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素的无激素1/2MS固体培养基中培养，每2周转移到新鲜培养基中至无菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素1/2MS培养基中培养。
[0077]4)把在固体培养基上的毛状根继代培养物接种于装有150ml无激素1/2MS液体培养基的500ml三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养25d后，将毛状根从培养基中取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存-80°C中备用。
[0078]阳性株利用常规real-time PCR进行进一步的筛选验证，本发明所用方法具体如下:
[0079]提取具有卡那霉素抗性的转化羽叶三七植株的总RNA，将RNA反转录成cDNA，半定量所用引物为羽叶三七达玛烯二醇合酶基因特异引物(正向引物5’ -GGTACCATGTGGAAACTGAAAGTGGC-3’ ；反向引物 5’ -GTCGACAATTTTCAGCTGCTGATGTT-3，)，反应程序为 94°C 时 3 分钟，94°C变性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸45秒，25个循环；循环完成后72°C延伸5分钟。用羽叶三七的actin基因做为内参基因，正向引物5’-GGAAAAGATTTGGCATC-3’，反向引物5’ -GGGCGTAACCCTCATA-3’。对羽叶三七的野生型和转化系在相同生长状态下进行目的基因表达水平的分析。最终选择相对于野生型植株，基因表达量的Fold-change值高于4倍以上(P〈0.01)的转化植株作为阳性株进行目的物质含量检测。
[0080]5)含羽叶三七达玛烯二醇基因的转基因发根的达玛烷型皂苷元含量的HPLC检测
[0081]转基因羽叶三七发根中达玛烷型皂苷的含量的检测可使用本领域的常规技术，本发明具体采用以下步骤:
[0082]发根系样品的前处理，用液氮将样品研磨成粉末，各取0.1g放入茄形瓶中，加入4ml的甲醇，将装有样品的茄形瓶固定在蛇形冷凝管上，置于80°C的水浴锅上，回流提取12h，将茄形瓶取出，吸出甲醇提取液，并用少量甲醇洗涤样品粉末二至三次，一并转入容量瓶中，定容至5ml，用0.45um有机系滤膜过滤后，即可用于HPLC进样检测。
[0083]采用美国Thermo Fisher公司液质联用仪(LCQ Fleet)的高效液相色谱仪,检测转基因发根中皂苷元原人参二醇(PPD)和原人参三醇(PPT)的含量，色谱柱为Hypersil0DS2C18柱(250nmX4.6mm，5um)，色谱条件如下:流动相为甲醇-水(90:10)流速1.0ml/min，柱温25°C，检测波长203nm。
[0084]以非转基因羽叶三七发根系为对照，对照组和转基因组均检测10株，比较其达玛烷型皂苷的平均含量。
[0085]检测结果表明:与对照组相比，过表达羽叶三七达玛烯二醇合酶基因的转基因羽叶三七中，原人参二醇皂苷(PPD)的含量平均提高了 2.3倍，原人参三醇皂苷(PPT)的含量平均提高了 3.6倍。
[0086]由此证明，羽叶三七达玛烯二醇合酶基因对促进羽叶三七达玛烷型皂苷含量的提高有显著作用，羽叶三七达玛烯二醇合酶基因可用于利用转基因技术提高羽叶三七达玛烷型皂苷含量的研究和产业化中，具有一定的应用前景。
【权利要求】
1.一种分离的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序列为SEQID N0.1所示。
4.含有权利要求2所述核苷酸序列的植物表达载体。
5.含有权利要求4所述植物表达载体的转基因植株。
6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高人参属植物达玛烷型皂苷含量中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高羽叶三七达玛烷型皂苷含量中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK104293756SQ201410479785
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】陈平, 黄璐琦, 张绍鹏, 赵小龙, 汪琪, 朱闻君, 伍翀, 王如峰, 邓琛, 张西锋 申请人:黄璐琦, 陈平, 张绍鹏, 张西锋, 赵小龙, 汪琪, 陈燕, 朱闻君, 伍翀, 王如峰, 邓琛