融合蛋白Nt4CL7aPcSTS及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中融合蛋白Nt4CL7aPcSTS及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 白藜芦醇（Resveratrol，简称Res)，化学名为3,4'，5-三轻基-1，2-二苯乙稀（tr ans-3, 4'，5-trihydroxystilbene)，又称苗三酷，是一种含有苗类结构的非黄酮类多酷化 合物，分子量为228. 2,不溶于水，溶于乙醇等有机溶剂。天然的白藜芦醇在很多植物中存 在，例如虎杖、花生和葡萄等。
[0003] 白藜芦醇是植物遭遇紫外线照射、机械损伤及真菌感染时急剧增加的一种植保 素，研宄显示白藜芦醇具有抗癌、保护心血管、抗氧化、抗衰老、免疫调节、神经保护和植物 雌激素等作用，可广泛地应用于医药、保健品、食品、化妆品等领域。白藜芦醇是葡萄酒最重 要的保健成分，法国人在高脂肪、高蛋白、高能量饮食习惯下，心血管疾病的发病率远低于 其他欧美国家，就得益于经常饮用含白藜芦醇的红葡萄酒。
[0004] 白藜芦醇来源于苯丙烧代谢途径（Phenylpropanoid pathway)。其生物代谢途径 为：苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)作用下裂解成反式 肉桂酸，肉桂酸在肉桂酸-4-轻基化酶（Cinnamate-4-hydroxylase，C4H)的催化作用下生 成4-香豆酸，4-香豆酸在4-香豆酰辅酶A连接酶（4-Coumarate-CoA ligase，4CL)的作用 下合成4-香豆酰辅酶A，最后，苗合酶（Stilbene synthase，STS)催化1分子的4-香豆酰 辅酶A和3分子的丙二酰辅酶A生成白藜芦醇（图1)。
[0005] 在生物体内白藜芦醇生物合成途径限速步骤较多，单纯过量表达某一关键酶虽然 对白藜芦醇的含量可能会产生一定的促进作用，但由于其它步骤限制，白藜芦醇的高水平 积累非常困难。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何提高白藜芦醇的产量。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供了融合蛋白Nt4CL7aPcSTS。
[0008] 本发明所提供的融合蛋白，名称为Nt4CL7aPcSTS，是如下⑴或⑵的蛋白质：
[0009] ⑴由蛋白质Nt4CL和蛋白质PcSTS融合得到的融合蛋白：
[0010] 所述蛋白质Nt4CL是如下a)或b):
[0011] a)氨基酸序列是SEQ ID No. 1第1-542位氨基酸残基的蛋白质；
[0012] b)将a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功 能的由其衍生的蛋白质；
[0013] 所述蛋白质PcSTS是如下A或B :
[0014] A、氨基酸序列是SEQ ID No. 1第550-937位氨基酸残基所示的蛋白质；
[0015] B、将A经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能 的由其衍生的蛋白质。
[0016] ⑵将⑴的N端或C端连接标签得到的带标签蛋白质。
[0017] 所述融合蛋白中，所述蛋白质Nt4CL和蛋白质PcSTS通过七个氨基酸残基连接。所 述七个氨基酸残基的序列如SEQ ID No. 1第543-549位所示，所述融合蛋白的氨基酸序列 是 SEQ ID No. 1。
[0018] 为了使所述融合蛋白Nt4CL7aPcSTS便于纯化，可在所述融合蛋白Nt4CL7aPcSTS 的N端和/或C端连接上如表1所示的标签。如在SEQ ID No. 1所示的蛋白质的N端和C 端分别连接一个6*His标签（HHHHHH)得到的融合蛋白。
[0019] 表1.标签的序列
[0020]
【主权项】
1. 一种融合蛋白，名称为融合蛋白Nt4CL7aPcSTS，是如下(1)或⑵的蛋白质： ⑴由蛋白质Nt4CL和蛋白质PcSTS融合得到的融合蛋白： 所述蛋白质Nt4CL是如下a)或b): a) 氨基酸序列是SEQ ID No. 1第1-542位氨基酸残基的蛋白质； b) 将a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的 由其衍生的蛋白质； 所述蛋白质PcSTS是如下A或B : A、 氨基酸序列是SEQ ID No. 1第550-937位氨基酸残基所示的蛋白质； B、 将A经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由 其衍生的蛋白质； 所述蛋白质Nt4CL和蛋白质PcSTS通过七个氨基酸残基连接； ⑵将⑴的N端或C端连接标签得到的带标签蛋白质。
2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述七个氨基酸残基的序列如SEQ ID No. 1第543-549位所示，所述融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID No. 1。
3. 权利要求1或2所述的融合蛋白的制备方法，包括将所述融合蛋白的编码基因在生 物细胞中进行表达得到所述融合蛋白。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因在生物细胞中 进行表达包括将所述融合蛋白的编码基因导入所述生物细胞。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述生物细胞为微生物细胞、非人动 物细胞或植物细胞。
6. 根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：所述微生物细胞为原核微生物 细胞。
7. 根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述原核微生物细胞为细菌。
8. 根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因是如 下①或②或③或④所述的DNA分子： ① 编码序列是SEQ ID No. 2的第1-2814位核苷酸的DNA分子或cDNA分子； ② 核苷酸序列是SEQ ID No. 2的DNA分子或cDNA分子； ③ 与①或②限定的DNA分子或cDNA分子具有75%以上的同一性且编码所述蛋白质的 DNA分子或cDNA分子； ④ 在严格条件下与①或②限定的DNA分子或cDNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA 分子或cDNA分子。
9. 一种生产白藜芦醇的方法，包括在含有4-香豆酸的培养基中培养融合蛋白相关生 物材料，得到白藜芦醇；所述融合蛋白相关生物材料为下述C1)至C12)中的任一种： C1)含有核酸分子的重组微生物；所述核酸分子编码权利要求1所述融合蛋白；所述微 生物为原核微生物； C2)含有表达盒的重组微生物；所述表达盒含有所述核酸分子；所述微生物为原核微 生物； C3)含有重组载体的重组微生物；所述重组载体为原核细胞表达载体，所述重组载体 含有所述核酸分子或所述表达盒；所述微生物为原核微生物； C4)含有所述核酸分子的转基因植物细胞系； C5)含有所述表达盒的转基因植物细胞系； C6)含有所述重组载体的转基因植物细胞系； C7)含有所述核酸分子的转基因植物组织； C8)含有所述表达盒的转基因植物组织； C9)含有所述重组载体的转基因植物组织； CIO)含有所述核酸分子的转基因植物器官； C11)含有所述表达盒的转基因植物器官； C12)含有所述重组载体的转基因植物器官。 10,1或II的应用： I、权利要求1-3中任一所述的融合蛋白在生产白藜芦醇中的应用； 11、 权利要求1-3中任一所述的融合蛋白在作为4-香豆酸辅酶A连接酶和芪合酶中的 应用。
【专利摘要】本发明公开了融合蛋白Nt4CL7aPcSTS及其制备方法与应用。本发明所提供的融合蛋白Nt4CL7aPcSTS，是由蛋白质Nt4CL和蛋白质PcSTS融合得到的融合蛋白：所述蛋白质Nt4CL是氨基酸序列是SEQ ID No.1自N端第1-542位氨基酸残基组成的蛋白质；所述蛋白质PcSTS是氨基酸序列是SEQ ID No.1自N端第550-937位氨基酸残基所示的蛋白质。融合蛋白Nt4CL7aPcSTS能够催化4-香豆酸和丙二酰辅酶A生成具有生物活性的白藜芦醇，证明融合蛋白Nt4CL7aPcSTS具有4-香豆酸辅酶A连接酶和芪合酶的活性。
【IPC分类】C12N15-62, C12P7-22, C12N9-10, C12N9-00
【公开号】CN104611300
【申请号】CN201510061692
【发明人】王有年, 马兰青, 刘柳, 郭辉力, 刘欢, 刘文彬, 戴梦迪
【申请人】北京农学院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月5日