专利名称：一种检测生物大分子相互作用的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明属生物芯片领域，具体地说，本发明涉及微流控生物芯片检测生物大分子相互作用的方法，同时还涉及一种微流控的生物芯片的装置。
背景技术：
生物芯片主要是指通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分进行准确、快速、大信息量的检测。目前常见的生物芯片分为三大类即基因芯片、蛋白芯片和芯片实验室(或称微流控芯片)。生物芯片主要特点是高通量、微型化和自动化。生物芯片上高度集成的成千上万密集排列的分子微阵列，能够在很短时间内分析大量的生物分子，使人们能够快速准确地获取样品中的生物信息，检测效率是传统检测手段的成百上千倍。微流控生物芯片即芯片实验室是生物芯片技术发展一个重要方向，它以分析化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学为目前主要应用对象，是当前微型全分析系统发展的重点。它的目标是把整个化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上，且可多次使用，因此较生物芯片有更广泛的适用性及应用前景。现在已有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的生物芯片。例如可以将样品制备和PCR扩增反应同时在一块小小的芯片上完成。再如GeneLogic公司设计制造的生物芯片可以从待检样品中分离出DNA或RNA，并对其进行荧光标记，然后当样品流过固定于栅栏状微通道内的寡核苷酸探针时便可捕获与之互补的靶核酸序列。生物芯片是在多种固定化载体上刻蚀具有多种性能的生物反应器。此类生物芯片的突出优越性在于通过芯片通道中的微流控(microfluidic)操作，很容易在低于普通化学分析几个数量级的体积(纳升至微升)的水平上，实现微机控制的自动化定量操作，不仅分析速度大为提高，试样与试剂消耗量也大为降低，而且由于这类微分析系统易于批量生产，因而生产成本显著降低，这也为现代分析技术的大规模普及创造了条件。
细胞或组织的蛋白质不是杂乱无章的混合物，蛋白质间的相互作用和相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。蛋白质间的相互作用及作用方式同样也是蛋白质组研究所面临的问题，从近期国际上蛋白质组学研究的发展动向可以看出，揭示蛋白质之间的相互作用关系，建立相互作用关系的网络图，已成为揭示蛋白质组复杂体系与蛋白质功能模式的先导，业已成为蛋白质组学领域的研究热点。传统的生物学手段是通过酵母双杂交系统来分析一种细胞或特定组织的所有可能的蛋白质之间的相互作用，酵母双杂交技术问世不到十年，已经在蛋白质间的相互作用研究、筛选新的蛋白质、研究蛋白质的功能等诸方面发挥重要作用。然而双杂交技术也有其内在的不足之处，如假阴性现象是双杂交分析过程中经常碰到的问题；此外一些对细胞致命的蛋白质也不适宜通过双杂交系统来分析。双杂交只是反映蛋白质间能发生作用的可能性，这种可能还必须经过其他实验验证，尤其要与生理功能研究相结合。生物芯片技术有望成为后基因组时代最重要的药物研究和开发手段，但蛋白质芯片到2003年还只占有不到20％的生物芯片市场。微流控芯片旨在集样品准备、检测及分析于一张芯片完成，预计将在药物开发(包括药物靶标鉴定、药物毒理学预测、高通量药物筛选及临床药物安全性)中得到广泛的应用。在寻找HIV药物中，Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸，并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物，实验表明，这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。生物芯片技术使得药物筛选，靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高，成本大大降低。芯片药物筛选技术具有很大的潜在应用价值。美国已有多家生物芯片公司股票上市，而且其股价平均以每年75％的速率上涨。根据前线决策管理咨询公司的最新报告，基因芯片市场包括用于临床实验和研究应用的芯片以及用于制造和分析芯片的相关设备在2000年达到了47亿美元。
目前在中国专利网中，涉及生物芯片的专利共有178项，有115项是以各式各样的新型生物芯片为内容的，在这当中与疾病治疗相关的有33项，但这些生物芯片承担的大多是检测和诊断功能。我国专利CN95195417发明了一种对化学分析和合成进行微流体处理的装置和方法，即一种用于分析和合成化学材料的微流控芯片系统。我国专利CN02132622发明了一种蛋白质分析用微流控芯片。美国专利US2003207467名称为Protein chips for highthroughput screening of protein activity，涉及蛋白质芯片用于研究蛋白质功能。法国专利FR2827612名称为New nucleic acid encoding G protein coupled receptor，useful for identifyingmodulators，potentially useful for treating e.g.Diabetes or Parkinson’s disease，涉及核酸编码GPCR用于治疗糖尿病和帕金森疾病。美国专利US20020094544将生物膜点阵结合在特殊基质表明，通过靶标复合物诱导激活与GPCR结合的标记G蛋白，来检测靶标复合物与探针GPCR的结合。但是，与这些专利或论文的公开的生物芯片相比，本发明的微流控生物芯片能够同时检测几种生物大分子相互作用，也可以利用其来检测药物对于某两种生物大分子相互作用强弱的影响。本发明公开的微流控生物芯片具有样品需求量少、使用方便高效等特点，并可能发展成为筛选药物的有利工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测生物大分子相互作用的方法，该方法简单易行且操作方便，能够同时在线检测几种生物大分子相互作用，样品需求量少、使用方便高效，并可成为筛选药物的有利工具。
本发明的另一个目的在于提供一种检测生物大分子相互作用的装置，该装置结构简单、成本低廉，应用此生物芯片可准确地检测到特异性的生物大分子。
为了实现上述任务，本发明采用以下技术方案本发明设计的微流控生物芯片能够在储液池内加入待研究的生物大分子样品(如蛋白质、核酸及多糖等)，通过改变储液池间的电压驱动样品溶液定向移动并实现在微混合器中的混合并相互作用，然后通过T字型通道上样分离，由分离通道末端荧光信号的检测实现对蛋白质相互作用定性乃至定量的研究。利用本发明提供的微流控芯片及相关研究方法来研究生物大分子相互作用，能在很短的时间内得到相关蛋白相互作用的大量信息，相对传统的蛋白质相互作用研究模式更加方便、高效，同时也可作为酵母双杂交系统研究蛋白质相互作用的有利验证。
本发明微流控生物芯片是一种在有机玻璃上蚀刻有储液池、槽道及微型混合器的芯片，其特点在于芯片由储液池、槽道及微型混合器分别形成样品混合作用流路、样品分离与检测流路及夹流流路三部分。
在本发明中，样品混合作用流路由4个独立样品储液池和3个独立微型层流混合器通过槽道连接而成，其中储液池P1与纵向槽道T1连通接混合器M1，储液池P2与横向槽道T2连通接混合器M1，实现储液池P1与储液池P2中样品的混合作用；储液池P3与横向槽道T3连通接混合器M2，在混合器M2中实现储液池P1、P2和P3中样品的混合作用；储液池P4与横向槽道T4连通接混合器M3，实现储液池P1、P1、P3及P4中样品的充分混合作用。混合器M3与纵向槽道T7接纵向槽道T8，纵向槽道T8再与横向槽道T5连接。
本发明的夹流流路由储液池P6、P8及连通槽道组成，储液池P6与纵向槽道T6连通接横向槽道T5，储液池P8与纵向槽道T8连通接横向槽道T5，槽道T6与T8等长实现样品夹流。
本发明的样品分离检测流路由储液池P5与储液池P7及连接P5、P7的横向槽道T5组成，实现样品的横向分离与检测。
储液池P1、P2中流出的样品由纵向槽道连接混合后进入微型层流混合器M1，混合后的溶液再与储液池P3中流出的样品混合后进入微型层流混合器M2，混合后的溶液再次与储池液P4中流出的样品混合后进入微型层流混合器M3；样品分离与检测流路由储液池P5和P7横向连接而成，待检测样品与检测试剂在夹流流路中的电流作用下经过样品混合反应流路、样品分离并收集检测流路中信号；夹流流路由储液池P6与P8纵向连接而成。
在本发明中，样品分离与检测流路由两个独立的储液池通过横向的槽道相连，其中储液池P5与P7在样品混合反应流路下游，通过槽道末端的光电倍增管检测待测样品荧光信号的变化。
在本发明中，夹流流路由两个独立的储液池通过纵向的槽道相连，并且槽道长度相等且对称，其中储液池P6与P8位于横向槽道两侧，通过电极对微流控生物芯片两端增加相等大小的电压以实现夹流。
本发明公开的微流控芯片由蚀刻有储液池、槽道及微型混合器的一块聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，即有机玻璃)片与另一块无蚀刻的完整聚甲基丙烯酸甲酯片键和而成，在两块片子之间形成封闭的连通电泳槽道。由储液池加入的样品在电压的驱动下定向移动、混合并在层流微混合器中实现混合及相互作用，之后由T字型槽道上样，改加分离电压后，纳升级样品带由电渗流驱动横向移动，再由于样品带中个成分所带电荷及分子量的差异而实现分离。
本发明微流控生物芯片检测生物大分子相互作用的方法，该方法包括下列步骤1)储液池P7中加入缓冲液并使之在毛细作用下充满整个芯片纵向槽道(T1、T6、T7、T8)和横向槽道(T2、T3、T4、T5)；2)用微量加样器将待检测生物大分子样品加入储液池P1、P2、P3及P4中；3)调节上样电压150～550V/cm，样品以电渗流驱动的方式在电压作用下定向移动并进样；4)改变电压为分离电压(300V/cm)，在芯片分离通道末端联结荧光检测器，检测样品信号，可准确检测到特异性的生物大分子。
在本发明中，待检测样品可以是蛋白质、核酸、多糖乃至药物分子。
在本发明中，由高压电源分出8路高压铂电极，8路高压电极分别插入8个储液池中，通过调节高压电场实现芯片表面流体的定向移动与混合。
在本发明中，样品相互作用之后，在分离通道末端分离，可以通过紫外、荧光或偶联质谱的方法检测并得到结果。
本发明以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，即有机玻璃)片作为基底制作微芯片。HF/HNO3为刻蚀混合剂实现所设计的流路。电渗流泵首先被用于样品的输送以及反应混合，反应后的溶液进入芯片上的电泳分离信道。通过分离通道末端连接荧光检测器检测荧光标记蛋白的信号变化。
聚甲基丙烯酸甲酯为聚酯类高分子材料，实验表明，经0.1M NaOH浸泡过夜的聚甲基丙烯酸甲酯表面在两端加有高压的碱性缓冲液条件下电离出大量羟基，使得芯片那表面与缓冲液中形成双电层，从而产生一定的电渗流推动样品在芯片槽道中的流动。先在缓冲液储液池中加入电泳缓冲液(如pH 8.1的硼砂缓冲液)并使其充满槽道，然后依次在对应储液池中加入蛋白样品，分别调节8个储液池中电极电压，使得液流由样品储液池向样品废液池移动，在溶液流动的过程中经过微型混合器实现多个样品的充分混合作用。最后切换个电极电压为分离电压，使得充分混合并进样的样品在分离通道实现有效分离。在分离通道末端，可连接紫外或荧光信号检测器，通过检测样品紫外或标记荧光的信号变化定性判断生物大分子相互作用强弱及药物对某几种生物大分子相互作用的影响。
本发明的目的在于实现一种利用微流控芯片研究生物大分子相互作用的有效方法，因此本发明设计了多储液池分布混合的流路设计。根据实际研究的需要，可以选择其中两个样品储液池加入待测样品，研究两种生物大分子的相互作用，也可以研究几种生物大分子分布混合且相互作用后的存在形式。为了防止大分子物质在流动过程中的阻塞，本发明在液流汇合处均设计90度的弯角结构以利于液流顺利实现定向移动，此外锯齿形微槽道混合器能有效实现层流式的样品混合以利于样品之间充分作用。当样品处于混合反应流路时，样品储液池均加有高压，样品废液池则接地，样品在电渗流的驱动下由储液池向废液池方向移动，在槽道中实现相互混合并作用。当样品流过T字型通道时，横向截留的100μm左右液柱即为进样样品。此时切换缓冲液池P5接高压，缓冲液池P7接地，样品实现横向的电泳分离。同时在缓冲液池P6与P8加一定强度的高压实现夹流。在分离槽道末端偶联荧光信号检测器，检测已标记的待测蛋白样品信号及相互作用后的样品信号，以此定性的判断生物大分子相互作用的强弱。
与以前的专利及论文公开的生物芯片相比，本发明能够同时检测几种生物大分子相互作用，也可利用其来检测药物对于某两种生物大分子相互作用强弱的影响，具有样品需求量小、使用方便快捷等优点，可能发展成为药物筛选的有利工具。本发明公开了一种微流控芯片，该芯片成本低廉、操作方便，利用本发明提供的微流控芯片及其检测生物大分子相互作用的方法，能在很短的时间内得到相关蛋白相互作用的大量信息，相对传统的蛋白质相互作用研究模式更加方便、高效，同时也可作为酵母双杂交系统研究蛋白质相互作用的有利验证。本发明旨在提供一种实现样品在线混合、反应并检测几种不同生物样品之间相互作用强弱的有效方法，该方法的实现对于蛋白质组学研究蛋白质相互作用有极大意义。此外，利用本发明也可定性的研究药物对于某两种生物大分子相互作用强弱的影响，并以此作为药物筛选的重要指标。
图1为微流控生物芯片结构示意图；图2、图3均为图1的配合示意图；图4为利用微流控芯片单独进样荧光标记G蛋白时，在分离槽道末端检测的荧光信号谱峰图。其中两个峰分别为荧光标记G蛋白和过量荧光标记物的峰；图5为利用微流控芯片同时进样荧光标记G蛋白和D2型多巴胺偶联受体，充分混合作用后，横向分离并在槽道末端检测的荧光信号谱峰图。三个峰分别为荧光标记G蛋白、过量荧光标记物及两种蛋白相互作用形成的复合物的峰；图1所示为微流控生物芯片实际构造图，其特征为蚀刻有8个储液池并由相互连通的槽道组成，各储液池加样方式依实施例中说明。
整个芯片的流路设计，包括电渗流进样及电泳分离的流路示意图如图2及图3所示。在图2的进样方式中，到待检测样品所在的储液池(P1、P2、P3和P4)均接高压，而样品的废液池(P6)接地，样品以电渗流移动的方式按图2中箭头的方向移动，实现样品的充分混合和相互作用并进样。切换分离电压至如图3所示，缓冲液所在的储液池(P7)接高压，废液池(P5)为接地。这时其它的储液池均切断了电源，在进样区带中的反应试剂和产物沿着分离信道电泳分离后经过检测窗口，最后进入废液池(P5)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。
实施例11.1芯片构造及加样方式本发明所公开的新型微流控生物芯片其特点在于芯片由储液池、槽道及微型混合器分别形成样品混合反应流路、样品分离与检测流路及夹流流路三部分在本发明中，样品混合作用流路由4个独立样品储液池P1、P2、P3和P4和3个独立微型层流混合器M1、M2和M3通过槽道连接而成，其中储液池P1由纵向槽道T1连通接入混合器M1，储液池P2由横向槽道T2连通接入混合器M1，实现储液池P1与P2中样品的混合作用；储液池P3由横向槽道T3连通接入混合器M2，在M2中实现P1、P2和P3中样品的混合作用；储液池P4由横向槽道T4连通接入混合器M3，实现P1、P1、P3及P4中样品的充分混合作用。混合器M3由纵向槽道T7接入纵向槽道T8，纵向槽道T8再与横向槽道T5连通实现样品的进样。
本发明的夹流流路由储液池P6、P8及连通槽道组成，储液池P6与纵向槽道T6连通接横向槽道T5，储液池P8与纵向槽道T8连通接入横向槽道T5，纵向槽道T6与T8等长实现样品夹流。
本发明的样品分离检测流路由储液池P5与储液池P7及连接储液池P5、P7的横向槽道T5组成，实现样品的横向分离与检测。
在本发明中，储液池P1、P2中流出的样品由纵向槽道连接混合后进入微型层流混合器M1，混合后的溶液再与储液池P3中流出的样品混合后进入微型层流混合器M2，混合后的溶液再次与储池液P4中流出的样品混合后进入微型层流混合器M3；样品分离与检测流路由储液池P5和P7横向连接而成，待检测样品与检测试剂在夹流流路中的电流作用下经过样品混合反应流路、样品分离并收集检测流路中信号；夹流流路由储液池P6与P8纵向连接而成。
该芯片由蚀刻在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片表面的8个独立加样储液池(如图1所示P1～P8)及相互连通的槽道组成，储液池通过高压电极外加不同电压以形成电压差实现槽道内部样品的移动、分离及检测。其中储液池加P7、P8加入50～150μl样品缓冲液(不需很准确，只要求充满槽道)；储液池P1、P2、P3、P4加入10μl生物大分子样品溶液；储液池P6为上样样品废液池；储液池P5为样品废液池。
1.2试剂的配制1)芯片体系缓冲液——PBS缓冲液8.0g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、1.44g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)，加双蒸水溶解并定容至1000ml，用0.45μm膜过滤以除去杂质，防止堵塞槽道。
2)蛋白质样品及药物溶液的配制蛋白质样品均溶于1)所述之PBS缓冲液，其浓度不大于μM级即可。
实施例2利用该芯片分离检测D2型多巴胺偶联受体与G蛋白相互作用1)用微量加样器在图1所示的储液池P7中用微量加样器加入25μl的20mM PBS缓冲液(pH 8.0)，抽气使缓冲液充满整个芯片槽道；2)用微量加样器在图1所示的储液池P1中加入10μl浓度为0.1mg/ml的荧光标记的G蛋白；3)如下表所示在各储液池插入电极并加上上样电压，实现样品进样
4)此时如下表所示在各储液池插入电极并加上分离电压
5)在分离槽道末端连接荧光检测及光电转换装置，检测样品信号；6)用0.1M NaOH溶液充分冲洗芯片槽道，然后用氮气吹干，之后用微量加样器在图1所示的储液池P7中用微量加样器加入25μl的20mM PBS缓冲液(pH 8.0)，抽气使缓冲液充满整个芯片槽道；7)用微量加样器在图1所示的储液池P1中加入10μl浓度为0.1mg/ml的荧光标记G蛋白；8)用微量加样器在图1所示的储液池P2中加入10μl浓度为0.25mg/ml的D2型多巴胺偶联受体及浓度为1mM的盐酸多巴胺混合物，充分混合并使其充满储液池；9)如下表所示在各储液池插入电极并加上上样电压，实现样品进样，当样品流经各个微型混合器时，各样品经过结构式混合器充分混合并相互作用，然后流入下游槽道；
10)当样品之间充分混合互作并进样完毕之后，部分样品流入样品废液池(如图1所示号储液池P6)，而在芯片十字交叉处滞留待分离的样品带；11)此时如下表所示在各储液池插入电极并加上分离电压
12)在分离槽道末端连接荧光检测及光电转换装置，检测样品信号；利用该微流控生物芯片单独检测荧光标记G蛋白时，其谱图为G蛋白荧光峰信号与过量FITC荧光标记物的峰信号(如图4)；当D2型多巴胺偶联受体与G蛋白相互作用后进样分离，可见除上述两个峰之外的相互作用复合物峰的形成(如图5)，由此判断D2多巴胺偶联受体与G蛋白有较强的相互作用。
权利要求
1.一种检测生物大分子相互作用的方法，它包括下列步骤A、储液池(P7)中加入缓冲液并使之在毛细作用下充满整个芯片纵向槽道(T1、T6、T7、T8)和横向槽道(T2、T3、T4、T5)；B、用微量加样器将待检测生物大分子样品加入储液池(P1、P2、P3、P4)中；C、调节上样电压150～550v/cm，样品以电渗流驱动的方式在电压作用下定向移动并进样；D、改变电压为分离电压300V/cm，在芯片分离通道末端联结荧光检测器，检测样品信号。
2.一种实现权利要求1所述的检测生物大分子相互作用的装置，包括储液池(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8)；混合器(M1、M2、M3)；储液池(P1)与纵向槽道(T1)连接通混合器(M1)，储液池(P2)与横向槽道(T2)连通接混合器(M1)，储液池(P3)与横向槽道(T3)连通接混合器(M2)，储液池(P4)与横向槽道(T4)连通接混合器(M3)，混合器(M3)与纵向槽道(T7)接纵向槽道(T8)，纵向槽道(T8)与横向槽道(T5)连接；储液池(P6)与纵向槽道(T6)连通接横向槽道(T5)，储液池(P8)与纵向槽道(T8)连通接横向槽道(T5)；储液池(P5)与储液池(P7)连通接储液池(P5、P7)的横向槽道(T5)。
全文摘要
本发明公开了一种检测生物大分子相互作用的方法及装置，其步骤是首先将储液池P7中加入缓冲液并使之在毛细作用下充满整个芯片槽道；其次是用微量加样器将待检测生物大分子样品加入储液池中；第三是调节上样电压150～550v/cm，样品以电渗流驱动的方式定向移动并进样；第四是改变电压为分离电压，在芯片分离通道末端联结荧光检测器，检测样品信号。实现该方法的装置由储液池、连通槽道和混合器组合而成。本发明方法简单易行，操作方便，结构简单、成本低廉，可准确检测到特异性的生物大分子相互作用。
文档编号G01N21/76GK1696667SQ20051001882
公开日2005年11月16日 申请日期2005年5月31日 优先权日2005年5月31日
发明者梁毅, 周拯, 项瑾, 廖俊明, 周兵瑞, 杜芬, 陈杰 申请人:武汉大学