用于大分子的增强的递送的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于大分子的增强的递送的方法和组合物
[0001] 本申请是申请号为200980126247. 5的中国专利申请的分案申请。
[0002] 本申请要求2008年7月10日提交的美国临时申请案61/079586(其内容通过引 用合并入本文）的优先权。 发明领域
[0003] 本公开内容涉及促进分子穿过生物膜的递送，特别是结合抗原的多肽穿过血脑屏 障进入中枢神经系统（CNS)的递送的组合物和方法。
[0004] 发明背景
[0005] 根据2006年世界卫生组织的报告，世界上超过10亿人患有神经病症，并且此类病 症每年导致将近680万人死亡。治疗性结合抗原的肽例如抗体可用于治疗多种（如果不是 大部分的话）此类神经病症。然而，使用此类治疗性结合抗原的肽治疗神经病症经常受到 与递送药物穿过血脑屏障（BBB)相关的困难的阻碍。
[0006] 虽然已发现增强分子穿过上皮细胞层的递送的化合物，但通常显示其只在增强小 分子的递送中有效。例如，已显示肽4-苯基偶氮苄基氧羰基-Pro-Leu-Gly-Pro增强小分 子穿过上皮细胞层的运输，然而对于IOkDa或更大的大分子未显示渗透增强作用（参见美 国专利 5, 534, 496;Yen等人 1995,JControlRelease, 36:25-37)。尽管进行了大量研宄， 但目前还没有将治疗性结合抗原的多肽递送至CNS内的方便有效的方法。
[0007] 因此，在本领域内存在对增强治疗性结合抗原的多肽穿过上皮层特别地至CNS的 特异性递送以治疗CNS病症的组合物和方法的持续需要。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明至少部分基于令人惊讶的发现：渗透增强剂（例如，Pz-肽或FMOC-肽）能 够增强大的大分子（即，大于IOkDa)例如结合抗原的多肽（例如scFv)至CNS的特异性递 送，特别是当给鼻粘膜施用时。因此，本发明提供了增强大的大分子（即，大于IOkDa)例如 结合抗原的多肽（例如，scFv)穿过上皮层的递送的组合物和方法。此类方法和组合物是特 别有利的，因为它们使得能够通过鼻内施用方便、有效和选择性地将结合抗原的多肽（例 如scFv)递送至CNS以治疗神经病症。
[0010] 在一个方面，本发明提供了包含一种或多种结合抗原的多肽例如免疫结合剂（例 如，scFv)和一种或多种渗透增强剂（例如，Pz-肽或FMOC-肽）的组合物。在特定的实施 方案中，将结合抗原的多肽共价连接至渗透增强剂。
[0011] 在某些实施方案中，结合抗原的多肽特异性结合靶抗原特别是TNFa，所述靶抗 原选自TNF-a、0淀粉样蛋白、0淀粉样蛋白衍生的可扩散配体受体、单胺氧化酶-B、 L-3, 4-二羟苯丙氨酸脱羧酶、乙酰辅酶A羧化酶、N-甲基-D-天冬氨酸受体（也称为 GRIN1)、GRINA、GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C、GRIN2D、GRIN3A、GRIN3B、组胺Hl受体、毒蕈碱受 体（也称为01冊1)、01冊2、01冊3、01冊4、下丘泌素受体1、下丘泌素受体2、5-羟色胺（也 称为HTR1A)、多巴胺受体（也称为DRD1)、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、肾上腺素能0 1受体、去 甲肾上腺素转运蛋白（NET)和多巴胺D2受体。
[0012] 在其他实施方案中，结合抗原的多肽是包含与本文的表5、6和7中所示的一个或 多个氨基酸序列具有至少80%，优选85 %、90%、95 %或99 %的同一性或相似性的氨基酸 序列的scFv。
[0013] 在其他实施方案中，渗透增强剂促进结合抗原的多肽至中枢神经系统的选择性鼻 内递送。
[0014] 本发明的组合物特别地可用作药物（或用于制造药物），所述药物特别地用于治 疗、预防或延迟神经病症的进展，所述神经病症包括但不限于偏头痛、抑郁症、阿尔茨海默 氏病、帕金森病、精神分裂症、癫痫、中风、脑膜炎、肌萎缩侧索硬化、失眠（insomnia)、脑膜 炎、记忆缺陷（memoryimpairment)、多发性硬化、发作性睡病、中风、创伤性脑损伤和应激 (stress)〇
[0015]在另一个方面，本发明提供了包括一种或多种结合抗原的多肽（例如scFv)、一种 或多种渗透增强剂（例如，Pz-肽或FMOC-肽）以及使用说明书的试剂盒。
[0016] 附图概述
[0017] 当结合下列附图阅读下列详述时，将更好地理解本公开内容的特征和有利方面， 其中：
[0018] 图1描述了时程实验，其跟踪在鼻内施用400ygScFv后（A)嗅球、（B)大脑、（C) 小脑和⑶脑干中的ESBA105浓度。
[0019] 图2比较在鼻内（400yg/mL)或静脉内（40yg/mL)施用ESBA105后（A)嗅球、 (B)大脑、（C)小脑、（D)脑干和（E)血清中ESBA105的浓度，以及在以400yg/mL的等浓度 鼻内或静脉内施用ESBA105后（F)血清中ESBA105的浓度。
[0020] 图3显示在使用或不使用Pz肽的情况下鼻内施用后，不同脑区域中ESBA105的 (A)Cmax (平均值土SEM，n= 4)和（B)暴露（AUC)的脑组织对血液的浓度比率。
[0021] 图4描述了在鼻内递送后ESBA105从鼻腔至CNS的迀移途径。施用的化合物可从 鼻腔迀移入血液并且穿过血脑屏障，最后渗入脑组织（下面的途径）。可选择地，化合物可 经嗅神经（N.olfactorius)轴突（即细胞内）或神经周围（即细胞外）迀移入嗅球，然后 进入大脑。化合物还可经三叉神经（N.trigeminus)(神经周围地，即细胞外）迀移入脑干， 然后进入小脑。
[0022] 详述
[0023] 定义
[0024] 本语〃渗透增强剂〃包括增强药物穿过物理屏障例如组织屏障（例如上皮）的 通过的任何组合物。适当的渗透增强剂包括但不限于，N-端连接至保护基团例如4-苯 基偶氮苄基氧羰基（Pz)、N-甲基、叔丁基氧羰基（t-Boc)、荷基甲氧基羰基（FMOC)和节 氧幾基（CBZ)的肽Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [SEQ IDNO: 28]、Pro-Leu-Gly-Pro-Lys [SEQ IDN0:29],Pr〇-Leu-Gly-Pr〇-Glu[SEQ IDNO: 30],Pro-Leu-Gly-Pro-Asp [SEQ ID NO: 31]、Pro-Leu-Gly-Pro [SEQ IDNO: 32]、Pro-Leu-Gly和Pro-Leu(参见例如，美国专利 5, 534, 496,其通过引用合并入本文）。
[0025]术语〃Pz-肽〃是指N末端连接至Pz基团的Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [SEQ IDNO:28] (参见例如，美国专利5, 534, 496,其通过引用合并入本文）。
[0026]术语〃FMOC-肽〃是指N端连接至FMOC基团的Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [SEQ ID N0:28](参见例如，美国专利5,534,496,其通过引用合并入本文）。
[0027] 术语"选择性鼻内递送"是指在导致患者的CNS中分子的浓度比血清中的浓度高 的条件下分子（例如，结合抗原的多肽）至患者的鼻内应用。
[0028] 术语"结合抗原的多肽"是指大小为至少IOkDa的多肽，其包括免疫结合剂、单克 隆抗体（包括全长单克隆抗体）、多克隆抗体、多特异性抗体（例如，双特异性抗体）、嵌合 抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体（scFv)和抗体片段以及基于本领域内 已知的可选择的支架的抗原结合多肽，所述支架例如但不限于CTLA-4、淀粉酶抑肽、纤连蛋 白（FN3)、新制癌菌素（neocarzinostatin)、CBM4-2、脂质运载蛋白、T细胞受体、蛋白A结 构域（蛋白Z)、Im9、设计的锚蛋白重复蛋白（DARPins)、设计的TPR蛋白、锌指、pVIII、鸟 胰腺多肽、GCN4、Wff结构域、Src同源结构域3 (SH3)、Src同源结构域2 (SH2)、PDZ结构域、 TEM-I0 -内酰胺酶、GFP、硫氧还蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD-指、CI-2、BPT1APPI、HPSTI、 ecotin、LACI-D1、LDTI、MTI-II、蝎毒素、昆虫防御素A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、 细胞色素b562、Ldl受体结构域A、Y-晶体蛋白、泛素、转铁蛋白和C型凝集素样结构域（参 见例如Binz2005，CurrOpinBiotechnol?第 16卷，第 459-69 页）。
[0029] 术语"免疫结合剂"是指分子，所述分子包含抗体的全部或部分抗原结合位置， 例如重链和/或轻链可变结构域的全部或一部分，这样免疫结合剂能够特异性识别靶抗 原。免疫结合剂的非限定性实例包括全长免疫球蛋白分子和scFv，以及抗体片段，包括但 不限于⑴Fab片段，由Vh、(^和ChI结构域组成的单价片段；（ii)F(ab'）2片段，包含通 过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，（iii)Fab'片段，其基本上是具有 较链区的一部分的Fab(参见，FundamentalImmunology(Paul编辑，3.sup.rded. 1993); (iv)由V#PChI结构域组成的Fd片段；(v)包含抗体的单臂的\和VHg构域的Fv片 段；（vi)单结构域抗体例如Dab片段（Ward等人，（1989)Nature341 :544-546)，其由Vh 或Vl结构域组成，Camelid(参见Hamers-Casterman,等人，Nature363:446-448(1993) 和Dumoulin等人，ProteinScience11 :500-515(2002))或Shark抗体（例如，shark Ig-NARsNan〇b〇dieS? );和（vii)纳米抗体（Nanobody)，包含单个可变结构域和两个 恒定结构域的重链可变区。
[0030] 本文中使用的术语"抗体"是免疫球蛋白的同义词。根据本发明的抗体可以是 完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，例如单个可变结 构域，Fv(SkerraA?和Pluckthun，A. (1988)Science240 :1038-41)、scFv(Bird，R.E?等 人（1988)Science242 :423-26 ;Huston，J.S?等人（1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85: 5879-83)，Fab、（Fab'）2或本领域技术人员熟知的其他片段。
[0031] 术语"单链抗体"或"scFv"意指包含通过接头连接的抗体重链可变区（Vh)和 抗体轻链可变区（')的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-Vf接头-Vh-COOH或 NH2-Vh-接头-VfCOOHo
[0032] 本文中使用的术语"抗体构架"是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该 可变结构域的抗原结合环的支架（Kabat，E.A.等人，（1991)Sequencesofproteinsof immunologicalinterest.NIHPublication91_3242)。适当的构架的实例公开于PCT/ CH2009/000219和PCT/CH2009/000222 (其通过引用合并入本文）。
[0033] 术语"接头"是指连接两个结构域的线性氨基酸序列。可通过遗传学和/或化学 方法将本发明的接头融合至结构域。在某些实施方案中，接头包含通过存在于接头中的两 个半胱氨酸之间形成的二硫桥形成的环。这样的接头的一般结构示于SEQIDNo. 18和 19中；SEQIDNo. 16和1