一种检测生物分子相互作用的方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测生物分子相互作用的方法。所述方法包括：将修饰于微球表面的固定相分子与一系列不同浓度的连接荧光分子的流动相分子共同孵育；使孵育后的样品通过流式细胞仪，统计不同浓度的流动相分子条件下的不同表面荧光强度的微球的数目；根据所述统计的微球的数目，拟合出所述固定相分子与所述流动相分子相互作用的平衡结合常数和/或平衡解离常数。所述方法检测时间短，不受反应分子的溶解度的限制，对于反应分子的分子量要求不高，可以定量检测分子量较小的短肽相互作用。
【专利说明】—种检测生物分子相互作用的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及生物分子相互作用的检测，尤其涉及检测蛋白、短肽等生物分子相互作用的方法。
【背景技术】
[0002]生物分子的相互作用在正常生命活动、疾病的发生过程中都起着非常重要的作用。因此，检测生物分子的相互作用在很多基础研究中是尤为必要的步骤。目前常用的检测方法有表面等离激元共振技术(SPR)、等温滴定量热(ITC)和石英晶体微天平(QCM)。
[0003]SPR是一种新兴的生物化学检测技术，于1982年首次使用于气体检测和生物传感器中。30年来，SPR技术在实现方式，应用领域扩展方面有了飞速的发展。如今的SPR具有以下优点:免标记，实时监测，无损伤检测(参考Liedberg B.等人，Sensors andActuatorsl983, 4, 29.；Rich R.L.等人，Analytical Biochemistry2007, 361 (I), 1-6.) ?ITC也是一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息 ，方法灵敏，精度高，可以获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数和摩尔结合熵等(参考Pierce Μ.Μ.等人，Methodsl999, 19 (2) 213-221.)。QCM是通过测量吸附在石英晶片表面的分子质量来研究分子间相互作用，可以提供相互作用过程中的动力学信息(参考 Okada T.等人，Biosensors and Bioelectronics2007, 22,1480 - 1486.)。这些技术虽然能够获得相应的信号，但是应用过程中局限性仍很大，而且获得结果与引起信息变化的因素间的关系十分复杂。尤其是SPR和ITC，前者对芯片基底要求高，由于灵敏度的限制，使得该检测方法对样品分子量有要求(大于1KD)，此外芯片对有机溶剂的耐受力有限，因此对样品的溶解度也有限制；后者在具体应用过程中对溶剂成分要求一致，对于疏水性较强的生物分子成功率不高。
[0004]针对上述问题，本发明引入一种新的检测生物分子相互作用的方法，建立在Langmuir吸附模型的基础上，将微球与流式细胞技术(FCM)相结合，克服溶解度、分子量的限制，最终可以定量地得到蛋白、多肽、核酸等生物分子间相互作用的平衡解离常数。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种检测生物分子相互作用的方法，所述方法检测时间短，不受反应分子的溶解度的限制，对于反应分子的分子量要求不高，可以定量检测分子量较小的短肽相互作用。
[0006]一种检测生物分子相互作用的方法，包括:
[0007]将修饰于微球表面的固定相分子与一系列不同浓度的连接荧光分子的流动相分子共同孵育；
[0008]使孵育后的样品通过流式细胞仪，统计不同浓度的流动相分子条件下的不同表面荧光强度的微球的数目；[0009]根据所述统计的微球的数目，拟合出所述固定相分子与所述流动相分子相互作用的平衡结合常数和/或平衡解离常数。
[0010]作为本发明的优选方案，所述固定相分子选自多肽、蛋白质、DNA、RNA或寡核苷酸。[0011 ] 优选地，所述流动相分子选自多肽、蛋白质、DNA、RNA或寡核苷酸。
[0012]优选地，所述固定相分子选自多肽和/或蛋白质，所述流动相分子选自多肽和/或蛋白质。
[0013]本发明检测生物分子相互作用的方法可用于检测例如多肽与蛋白质的相互作用、蛋白质与蛋白质的相互作用、多肽与多肽的相互作用、蛋白质与DNA的相互作用、蛋白质与RNA的相互作用、蛋白质与寡核苷酸的相互作用、DNA与DNA的相互作用、DNA与RNA的相互作用、RNA与RNA的相互作用，等等。
[0014]作为本发明的优选方案,所述微球的材料选自聚合物、娃、二氧化娃、金属、金属氧化物、玻璃和石英中的任意一种或至少两种组成的复合材料。基本上目前生物学上常用的微球均可用于本发明。
[0015]作为本发明的优选方案，所述荧光分子选自异硫氰酸荧光素、3H-吲哚菁类染料、藻红蛋白、多甲藻叶绿蛋白或别藻青蛋白，优选异硫氰酸荧光素。这些荧光分子都是生物学上常用的荧光标记分子，可以使用任一种或至少两种。
[0016]作为本发明的优选方案，所述修饰于微球表面的固定相分子是通过生物素-链霉亲和素之间的强相互作用、共价连接、自组装或静电吸附方式将所述固定相分子固定于所述微球表面的。 [0017]优选地，所述修饰于微球表面的固定相分子是通过生物素-链霉亲和素之间的强相互作用将所述固定相分子固定于所述微球表面的。
[0018]将分子修饰到微球表面的方法是本领域技术人员所熟知的，只要能够保证生物分子的活性不受影响，任何修饰方法均可用于本发明，如各种偶联技术。已知通过生物素-链霉亲和素之间的强相互作用、共价连接、自组装或静电吸附方式将生物分子固定到微球上能够很好地保持生物分子的活性。
[0019]作为本发明的优选方案，所述微球为链霉亲和素包被的微球，所述固定相分子为生物素标记的生物分子。
[0020]优选地，所述微球为表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球。
[0021]生物素与链霉亲和素之间的相互作用是自然界中很强的分子间相互作用，通过此方式可以确保生物分子固定到微球表面的稳定性。
[0022]作为本发明的优选方案，所述微球为表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球；所述固定相分子为生物素标记的多肽和/或蛋白质；所述流动相分子为连接异硫氰酸荧光素的多肽和/或蛋白质。
[0023]作为本发明的优选方案，所述孵育的温度条件为35~40°C，优选为37°C。
[0024]作为本发明的优选方案，所述生物分子相互作用具体是生物分子或小分子与靶蛋白之间的相互作用。
YJ-
[0025]作为本发明的优选方案，所述拟合采用吸附公式=进行；其中，Θ为
I+ K-\V.4
表面覆盖率，Ca为流动相分子的浓度，Ka为固定相分子和流动相分子相互作用的平衡结合常数，η为流动相分子与固定相分子相互作用的化学计量数之比。
[0026]本发明的有益效果为:本发明检测生物分子相互作用的方法适用于蛋白质、多肽、DNA和RNA等生物分子，通过检测可以得到两个生物分子的相互作用的平衡结合常数和/或平衡解离常数。相对于其它现有技术，本发明的方法检测时间短，不受反应分子的溶解度的限制，对于反应分子的分子量要求不高，可以定量检测分子量较小的短肽相互作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是本发明检测生物分子相互作用的方法的流程和原理示意图。
[0028]图2是实施例1中F8-F8相互作用曲线，编号1、2和3分别代表三次测量的数据，其中黑色粗线为拟合曲线。
[0029]图3是实施例2中蛋白A-1gG(Protein A-1gG)相互作用曲线，编号1、2和3分别代表三次测量的数据，其中黑色粗线为拟合曲线。
[0030]图4是实施例3中E-coil-K-coil相互作用曲线，编号1、2和3分别代表三次测量的数据，其中黑色粗线为拟合曲线。
[0031]图5是实施例4中链霉亲和素-生物素(SA-Biotin)相互作用曲线，编号1、2和3分别代表三次测量的数据，其中黑色粗线为拟合曲线。
【具体实施方式】
[0032]为使本发明的目的、方案和效果更加清楚明了，下面对本发明进行详细描述。
[0033]为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的含义。
[0034]除非另外说明，本文中浓度单位“ μΜ”是指“ ymol/L”，“mM”是指“mmol/L”，“M是指“mol/L”。
[0035]除非另外说明，本文中“固定相Mols”是指修饰于微球表面的固定相分子，“流动相MoIl"是指连接荧光分子的流动相分子。
[0036]除非另外说明，本文中“KD”是两种生物分子相互作用的平衡解离常数，“KA”是两种生物分子相互作用的平衡结合常数。
[0037]除非另外说明，本文中的“FCM”是指流式细胞技术。
[0038]本发明的目的是针对目前生物分子相互作用的测量技术分辨性、溶解度和分子量等方面的约束，大大限制了对测量的广泛性，提供一种检测生物分子相互作用的方法。
[0039]本发明提供的检测生物分子相互作用的方法，建立在Langmuir吸附原理的基础上，通过微球与流式细胞术相结合，可以定量地测量蛋白、多肽等相互作用的平衡解离常数和平衡结合常数。
[0040]本发明提供的检测生物分子相互作用的方法，可包括微球修饰，相互作用，仪器检测和数据拟合方法。图1示出了本发明检测生物分子相互作用的方法的一种流程和原理示意图。
[0041]其中，所述微球修饰将固定相Mols偶联于微球表面，以及结合于生物分子修饰层的流动相Mo IP
[0042]本发明的实施例中，所述固定相Mols是修饰了生物素(Biotin)的生物分子中的任意一种，流动相Mok是连接荧光分子的生物分子中的任意一种，所述荧光分子可以是异硫氰酸荧光素(FITC)、3H-吲哚菁类染料(Cy3和Cy5)、藻红蛋白(PE)、多甲藻叶绿蛋白(PerCP)或别藻青蛋白(APC)等。优选地，所述流动相Mok是连接荧光分子FITC的生物分子中的任意一种。
[0043]本发明的实施例中，通过生物素-链霉亲和素(SA)之间的强相互作用，将固定相Mols偶联在微球表面，所述微球为表面修饰SA的聚苯乙烯微球。也可以采用酰胺键等共价连接、自组装和静电吸附等偶联方式，将固定相Mols偶联在微球表面。
[0044]本发明的实施例中，所述相互作用指偶联固定相Mols的微球与一系列不同浓度的流动相Mok进行孵育。孵育条件为置于37°C摇床中过夜，摇动速度150r/min。
[0045]本发明的实施例中，所述仪器检测的方式为，将上述微球样品通过流式细胞仪，检测流动相Mok —系列不同浓度条件下，不同表面荧光强度的微球的数目统计。
[0046]本发明的实施例中,所述拟合的方法采用拟合公式Langmuir吸附公式:
【权利要求】
1.一种检测生物分子相互作用的方法，包括: 将修饰于微球表面的固定相分子与一系列不同浓度的连接荧光分子的流动相分子共同孵育； 使孵育后的样品通过流式细胞仪，统计不同浓度的流动相分子条件下的不同表面荧光强度的微球的数目； 根据所述统计的微球的数目，拟合出所述固定相分子与所述流动相分子相互作用的平衡结合常数和/或平衡解离常数。
2.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述固定相分子选自多肽、蛋白质、DNA、RNA或寡核苷酸； 优选地，所述流动相分子选自多肽、蛋白质、DNA、RNA或寡核苷酸； 优选地，所述固定相分子选自多肽和/或蛋白质，所述流动相分子选自多肽和/或蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述微球的材料选自聚合物、硅、二氧化硅、金属、金属氧化物、玻璃和石英中的任意一种或至少两种组成的复合材料。
4.根据权利要求 1-3任一项所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述荧光分子选自异硫氰酸荧光素、3H-吲哚菁类染料、藻红蛋白、多甲藻叶绿蛋白或别藻青蛋白，优选异硫氰酸荧光素。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述修饰于微球表面的固定相分子是通过生物素-链霉亲和素之间的强相互作用、共价连接、自组装或静电吸附方式将所述固定相分子固定于所述微球表面的； 优选地，所述修饰于微球表面的固定相分子是通过生物素-链霉亲和素之间的强相互作用将所述固定相分子固定于所述微球表面的。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述微球为链霉亲和素包被的微球，所述固定相分子为生物素标记的生物分子； 优选地，所述微球为表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述微球为表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球；所述固定相分子为生物素标记的多肽和/或蛋白质；所述流动相分子为连接异硫氰酸荧光素的多肽和/或蛋白质。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述孵育的温度条件为35~40°C，优选为37°C。
9.根据权利要求1-8任一项所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述生物分子相互作用具体是生物分子或小分子与靶蛋白之间的相互作用。
10.根据权利要求1-9任一项所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述拟合采用吸附公式:
【文档编号】G01N15/10GK103983555SQ201410232021
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】王琛, 杜慧文, 杨延莲 申请人:国家纳米科学中心