专利名称：Parp相互作用分子的鉴定方法和parp蛋白的纯化方法
PARP相互作用分子的鉴定方法和PARP蛋白的纯化方法本发明涉及固定化合物(immobilization compound)和用于鉴定PARP相互作用分 子的方法和用于纯化PARP蛋白的方法。另外，本发明涉及例如用于治疗癌症、代谢性 疾病或自体免疫/炎症性障碍的包含所述相互作用分子的药物组合物，和涉及癌症的诊 断方法。聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)组成真核细胞中存在的细胞信号传导酶的家族， 所述酶催化DNA-结合蛋白的聚(ADP-核糖基化)。PARPS还已知为聚(ADP-核糖) 合成酶或聚(ADP-核糖)转移酶(pART)。这些酶在对DNA损伤的速发型细胞应答方 面起重要作用。对由电离辐射、氧化应激和DNA-结合抗肿瘤药诱导的DNA损伤的应 答，PARP将ADP-核糖单元添加到靶蛋白的天冬氨酸和谷氨酸残基的羧酸酯基上。该 聚(ADP-核糖基化)为通过附着ADP-核糖单元的复杂支链聚合物上触发受体蛋白失活 的翻译后修饰(Schreiber 等，2006.Nature Reviews CellBiology 7，517-528)。ADP核糖基化为一种翻译后蛋白修饰，该修饰中ADP-核糖部分从NAD转 移到靶蛋白的特定氨基酸侧链上(Schreiber等，2006.NatureReviews Cell Biology 7， 517-528)。PARPl为PARP家族中首个被表征的成员，并且是最熟知的成员。由ADPRT 基因编码的该蛋白是高度保守的染色质结合酶，所述酶结合带切口的DNA并且介导针对 DNA损伤的保护。对重大DNA损伤的应答，PARPl被过度激活，并且诱导细胞NAD+ 和ATP的耗尽，导致细胞功能障碍或细胞死亡。PARPl的过度激活涉及几种疾病的发病 机理，所述疾病包括中风、心肌梗塞、糖尿病、神经退行性疾病和炎症疾病。已经提出使用小分子抑制剂靶向PARP作为用于癌症治疗的有前景的方法 (Haince 等，2005.Trends Mol Med.ll (10) 456-63)。在文献中已经报道了几种 PARP 抑 制剂。然而，第一代的PARP抑制剂对于PARP家族的各种成员是非选择性的，存在对 选择性抑制剂的需要。另外，还需要用于PARP抑制剂的选择性剖析(profiling)的新方 法。PARP抑制剂的鉴定和表征的一个前提条件是提供合适的检测方法，优选是使用 靶蛋白生理形式的检测方法。本领域中，为了解决该问题已经提出几种策略。为了对来自小牛胸腺的PARP蛋白进行纯化，描述了两步亲和纯化策略 (D，Amours 等，1997.Analytical Biochemistry 249，106-108)。第一步由 DNA-纤维素
色谱组成，第二步由3-氨基苯甲酰胺亲和色谱组成。3-氨基苯甲酰胺是一种PARP抑制 剂，与所述酶的C-末端催化结构域相互作用。常规而言，可以在基于溶液的检测中使用合适的底物使用经纯化的酶或重组酶 测定 PARP 酶活性(Dantzer 等，2006.Methods inEnzymology 409，493-510)。这种类型的 检测可用于鉴定PARP抑制剂，还可用于通过测试针对PARP家族的所有成员的抑制剂而 评估抑制剂选择性。综上所述，需要为PARP相互作用化合物的鉴定和选择性剖析以及为PARP蛋白 的纯化提供有效工具和方法。
发明内容
本发明尤其涉及式⑴的固定化合物或其盐，
权利要求
1.一种式⑴的固定化合物，或其盐，
2.如权利要求1所述的固定化合物，所述固定化合物选自由以下组成的组
3.固定产物的制备方法，其中将至少一种如权利要求1或2任一项所述的固定化合 物固定在固相载体上，特别是其中所述固相载体选自由琼脂糖、改性琼脂糖、琼脂糖珠 (例如NHS-激活的琼脂糖)、胶乳、纤维素和铁磁性颗粒或亚铁磁性颗粒组成的组。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述固定产物由将所述固定化合物直接共价连接到固相载体而产生，或由将所述固定化合物通过连接子介导的共价连接到固相载体而产 生，特别是其中所述连接子是C1,亚烃基，该亚烷基可选地被选自由S、O、NH、C(O) O、C(O)和C(O)NH组成的组中的一种或多种原子或官能团打断，并且其中该连接子可 选地被独立地选自由卤素、OH、NH2 > C(0)H、C (O) NH2 > S03H、NO2和CN组成的 组中的一种或多种取代基取代，特别是其中所述固定经由权利要求1的式⑴中的饱和环 的环氮原子发生。
5.一种固定产物，该固定产物能够通过权利要求3或4任一项所述的方法获得。
6.PARP相互作用化合物的鉴定方法，所述方法包括以下步骤a).提供包含PARP的蛋白制剂，b).使所述蛋白制剂与权利要求5所述的固定产物以及与给定化合物在允许形成PARP 和固定产物的复合物的条件下接触，和c).检测步骤b)中形成的复合物。
7.PARP相互作用化合物的鉴定方法，所述方法包括以下步骤a)提供两等份的包含PARP的蛋白制剂，b)使一等份蛋白制剂与权利要求5所述的固定产物在允许形成PARP和固定产物的复 合物的条件下接触，和c)使另一等份蛋白制剂与所述固定产物以及与给定化合物在允许形成所述复合物的 条件下接触，和d)确定步骤b)和c)中形成的复合物的量。
8.PARP相互作用化合物的鉴定方法，所述方法包括以下步骤g)提供各自包括至少一个包含PARP的细胞的两等份试样，h)将一等份试样与给定化合物温育，i)收获各等份试样的细胞，j)对所述细胞进行裂解从而获得蛋白制剂，k)使所述蛋白制剂与权利要求5所述的固定产物在允许形成PARP和固定产物的复合 物的条件下接触，和1)确定步骤e)的各等份试样中形成的复合物的量。
9.如权利要求7或8任一项所述的方法，其中在与所述化合物一起温育的等份试样中 形成的复合物的量相对于不与所述化合物一起温育的等份试样减少表示PARP是所述化合 物的靶。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中通过从所述固定产物中分离PARP，并 且随后检测分离的PARP或随后确定分离的PARP的量，来确定所述复合物的量，特别是 其中通过质谱法或免疫检测法，优选使用针对PARP的抗体的免疫检测法来检测PARP或 确定PARP的量。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述给定化合物选自由合成化合物或 有机合成药，更优选小分子有机药，和天然小分子化合物组成的组。
12.如权利要求7-11中任一项所述的方法，其中所述给定化合物是PARP抑制剂。
13.纯化PARP的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含PARP的蛋白制剂，b)使所述蛋白制剂与权利要求5所述的固定产物在允许形成PARP和固定产物的复合 物的条件下接触，和C)从所述固定产物分离PARP。
14.如权利要求7-13中任一项所述的方法，其中蛋白制剂的提供包括收获至少一个包 含PARP的细胞和对所述细胞进行裂解的步骤。
15.如权利要求7-14中任一项所述的方法，其中形成所述复合物的步骤在基本上生理 条件下进行。
16.用于确定样品中PARP的存在的方法，所述方法由以下步骤组成a)提供预期包含PARP的蛋白制剂，b)使所述蛋白制剂与权利要求5所述的固定产物在允许形成PARP和固定产物的复合 物的条件下接触，和c)检测PARP是否与所述固定产物形成复合物。
17.如权利要求1或2任一项所述的固定化合物或如权利要求5所述的固定产物在鉴 定PARP相互作用化合物或在纯化PARP中的用途。
全文摘要
本发明涉及用于鉴定PARP相互作用化合物或用于纯化或鉴定PARP蛋白的固定化合物和方法。
文档编号G01N33/573GK102027371SQ200980117707
公开日2011年4月20日 申请日期2009年5月14日 优先权日2008年5月16日
发明者G·德勒维斯, V·雷德尔 申请人:塞尔卓姆股份公司