专利名称：分子间相互作用的检测方法及其检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子间相互作用的检测方法及其检测装置，尤其涉及用于检测生物体分子、有机高分子等的分子间相互作用的检测方法及其检测装置。
背景技术：
以往,抗原抗体反应等生物体分子彼此的分子间相互作用、有机闻分子彼此的分子间相互作用等的结合的测量，一般通过使用放射性物质、荧光体等标识来进行。该标识花费时间，尤其是对蛋白质的标识存在方法烦杂的情况、由于标识而使蛋白质的性质变化的情况。近些年，作为不使用标识，简便地直接检测生物体分子、有机高分子间的结合的方法，公知有利用了光学薄膜的干涉色变化的RIfS方式(Reflectometric interferencespectroscopy :反射型干涉分光法)。其基本原理在专利文献I、非专利文献I等中被提及。 对RIfS方式简单地进行说明，在该方式中，使用图6所示的检测器100。如图6Ca)所示，检测器100具有基板102，在基板102上设置有光学薄膜104。在向该状态的检测器100照射白色光的情况下，如图9所示，白色光本身的分光强度用实线106表示，其反射光的分光强度用实线108表不。若根据照射的白色光与其反射光的各分光强度求出反射率，则如图10所示，可得到用实线表示的反射光谱110。在检测分子间相互作用时，如图6 (b)所示，在光学薄膜104上设置配位体120。若在光学薄膜104上设置配位体120，则光学的厚度112发生变化，光程长度发生变化，干涉波长也发生变化。即，反射光的分光强度分布的峰值位置漂移，其结果如图10所示，反射光谱110向反射光谱122 (参照虚线部分)漂移。在该状态下，若向检测器100上灌入样本溶液，则如图6 (c)所示，检测器100的配位体120与样本溶液中的分析物130结合。若配位体120与分析物130结合，则光学的厚度112进一步变化，如图10所示，反射光谱122向反射光谱132 (参照点划线部分)漂移。而且，通过检测反射光谱122的峰值波长(谷峰波长)与反射光谱132的谷峰波长的变化量，能够检测分子间相互作用。若随时间变化地观测谷峰波长的变化趋势，则如图11所示，在时刻140，能够确认因配位体120引起的谷峰波长的变化，在时刻142，能够确认因配位体120与分析物130的结合引起的谷峰波长的变化。专利文献I :日本专利第3786073号公报非专利文献I =Sandstrom et al, APPL. OPT.，24，472，1985然而，在观测谷峰波长的变化趋势的上述RIfS方式中，在实际上检测出的反射光的波长间多存在真的反射率谷峰波长，因此需要以比实际上检测出的反射光的波长间隔小(窄)的波长间隔来追踪谷峰波长的变化。与此相对，通常执行如下处理利用高阶多项式来近似反射率的波长分布，根据该高阶多项式求出其解(最小值)，并将其作为谷峰波长。但是，利用高阶多项式的近似虽然从相匹配的观点来看是有用的，但是由于是高阶，所以从该多项式求出解要花费时间，难以容易地且在短时间内计算、确定谷峰波长。另外，在观测谷峰波长的变化趋势的上述RIfS方式中，也可以处理多个种类的分子，即使堆叠多个种类的分子，向样本溶液中混入多个种类的分析物130，也能够检测分子间相互作用。例如，如图12所示，能够检测复杂的抗原、抗体反应这样的蛋白质的分子间相互作用。根据图12的例子，将光学薄膜104的表面氨基化(参照(a))，经由NHS-PEG4结合生物素150 (参照(b))后，结合抗生物素蛋白152 (参照(c))，用BSA154封闭(blocking)来结合抗体156 (参照(d))，从而检测抗原158 (参照(e))。若随时间变化观测谷峰波长的变化趋势，则如图13所示，能够分别在区间160检测生物素150、抗生物素蛋白152的结合，在区间162检测BSA154的封闭，在区间164检测抗体156的结合，在区间166检测与浓度相应的抗原158的结合。实际上欲检测多个种类的分子的相互作用的情况下，当计算、确定谷峰波长时，例如，得到如图14 (a)、(b)所示那样的反射光谱170，并用高阶函数对其进行近似，来计算、确定谷峰波长。但是，该情况下，因为要处理多个种类的分子，所以反射光谱170中存在极小点172，若近似反射光谱170，则可得到受到了极小点172的影响的反射光谱174，与此相伴，谷 峰波长偏移。因此，有时不能计算、确定反射光谱170中的正确的谷峰波长。
发明内容
因此，本发明的主要的目的在于提供无论反射光谱的极小点的有无与否，都能够容易地且在短时间内计算、确定谷峰波长的分子间相互作用的检测方法及其检测装置。根据本发明的一方式，提供一种分子间相互作用的检测方法，其特征在于，包括以一定的波长间隔计算反射率来求出反射光谱的步骤；将所述反射光谱近似为高阶函数的步骤；从所述高阶函数中选择包含最小的反射率的波长区间的步骤；在所述波长区间中，将所述高阶函数近似为阶次比该高阶函数低的二次函数的步骤；以及用波长对所述二次函数进行微分，求出微分值为O的解的步骤。根据本发明的另一方式，提供一种分子间相互作用的检测方法，其特征在于，包括以一定的波长间隔计算反射率来求出反射光谱的步骤；对所述反射光谱进行滤波的步骤；从滤波后的所述反射光谱中选择包含最小的反射率且以拐点为边界的第I波长区间的步骤；在所述第I波长区间中，将滤波后的所述反射光谱近似为高阶函数的步骤；从所述高阶函数中选择包含最小的反射率的第2波长区间的步骤；在所述第2波长区间中，将所述高阶函数近似为阶次比该高阶函数低的二次函数的步骤；以及用波长对所述二次函数进行微分，求出微分值为O的解的步骤。根据本发明的另一方式，提供一种分子间相互作用的检测装置，其特征在于，具备检测器，其具有配位体；白色光源，其向所述检测器照射白色光；分光器，其检测来自所述检测器的反射光；以及控制装置，其控制所述白色光源与所述分光器，所述控制装置以一定的波长间隔计算反射率来求出反射光谱，将所述反射光谱近似为高阶函数，从所述高阶函数中选择包含最小反射率的波长区间，在所述波长区间中将所述高阶函数近似为阶次比该高阶函数低的二次函数，用波长对所述二次函数进行微分，求出微分值为O的解。根据本发明的另一方式，提供一种分子间相互作用的检测装置，其特征在于，具备检测器，其具有配位体；白色光源，其向所述检测器照射白色光；分光器，其检测来自所述检测器的反射光；以及控制装置，其控制所述白色光源与所述分光器，所述控制装置以一定的波长间隔计算反射率来求出反射光谱，对所述反射光谱进行滤波，从滤波后的所述反射光谱中选择包含最小的反射率且以拐点为边界的第I波长区间，在所述第I波长区间中，将滤波后的所述反射光谱近似为高阶函数，从所述高阶函数中选择包含最小的反射率的第2波长区间，在所述第2波长区间中，将所述高阶函数近似为阶次比该高阶函数低的二次函数，用波长对所述二次函数进行微分，求出微分值为O的解。根据本发明，在用高阶函数近似反射率的波长分布(反射光谱)后，选择波长区间，在该波长区间中用二次函数再次近似反射光谱，然后，对该二次函数微分，并求出微分值为O的解，通过这样的简单处理来求出谷峰波长，从而能够无论反射光谱的极小点的有无与否，都容易地且在短时间内计算、确定谷峰波长。
图I是表示分子间相互作用的检测装置的概略构成的图。图2是表示检测器的概略构成的图。图3是示意地表示配位体与分析物的结合的样子的图。图4是概略地表示分子间相互作用的检测方法的处理步骤的流程图。图5是用于概略地说明图4的处理步骤中的波形处理的图。图6是用于说明RIfS方式的概略的图。图7是概略地表示分子间相互作用的检测方法的处理步骤的流程图。图8是用于概略地说明图7的处理步骤中的波形处理的图。图9是表示波长与分光强度的概略的关系的光谱例。图10是表示波长与反射率的概略的关系的光谱例。图11是表示谷峰波长的变化的概略的趋势的曲线图。图12是用于说明抗原-抗体反应的一个例子的图。图13是表示图12的例子中的谷峰波长的变化的概略的趋势的曲线图。图14是用于说明根据反射光谱计算、确定谷峰波长时的问题点的图。
具体实施例方式(第I实施方式)以下，参照附图，对本发明的优选的第I实施方式进行说明。如图I所示，检测装置I主要由检测器10、白色光源20、分光器30、光纤40、控制装置50等构成。检测器10基本上由传感器芯片12、流路池14构成。如图2所示，传感器芯片12具有呈矩形形状的硅基板12a。在硅基板12a上蒸镀有SiN膜12b (氮化硅)。SiN膜12b是光学薄膜的一个例子。流路池14是硅橡胶制的透明部件。流路池14中形成有槽14a。若使流路池14与传感器芯片12紧贴，则形成密闭流路14b (参照图I)。槽14a的两端部从流路池14的表面露出，按照一端部作为样本溶液的流入口 14c，另一端部作为其流出口 14d的方式分别发挥作用。在槽14的底部上结合有配位体16 (参照图I)。在检测器10中，可以使流路池14重新粘贴于传感器芯片12，流路池14可以一次性(用完扔掉)使用。在传感器芯片12的表面上，也可以用硅烷耦合剂等进行表面修饰，该情况下，流路池14的重新粘贴会变得容易。如图I所示，在流路池14的密闭流路14b的上方设置有光纤40。光纤40的一端部与白色光源20连接。作为白色光源20，例如可使用卤素光源。光纤40的另一端部与分光器30连接。若白色光源20点亮，则其光经由光纤40向密闭流路14b照射，其反射光再次经由光纤40，被分光器30检测出。白色光源20、分光器30与控制装置50连接，控制装置50控制这些部件的动作。尤其是在检测装置I中，可以通过控制装置50，根据分光器30的检测结果分析其分光特性、反射特性等。接下来，对使用了检测装置I的分子间相互作用的检测方法进行说明。如图I所示，使包含分析物62的样本溶液60从流入口 14c经由密闭流路14b向流出口 14d流通。分析物62是指与配位体16异常结合的物质，是以欲检测为目的的分子。 作为分析物62，可使用例如蛋白质、核酸、脂质、糖等生物体分子、或药剂物质、内分泌紊乱化学物质等与生物体分子结合的外来物质等。在样本溶液60在密闭流路14b中流通的期间，使白色光源20点亮。白色光透过流路池14向传感器芯片12照射，其反射光被分光器30检测。通过分光器30检测到的反射光的检测强度被发送至控制装置50。该情况下，如图3所不,若样本溶液60中的分析物62与配位体16结合,贝U光学的厚度70发生变化，干涉色(分光器30所检测的检测强度为最小的波长)发生变化。控制装置50接收分光器30的检测结果，来计算、确定分析物62与配位体16的结合前后反射光谱的各谷峰波长入
bottom°谷峰波长λ bottom的计算、确定方法主要由图4的(SI) (S4)的步骤构成，(SI)
(S4)的步骤的处理在控制装置50中执行。(SI)求出反射光谱，使其近似为高阶函数。(S2)从高阶函数中选择任意的波长区间。(S3)在选择出的波长区间中，将高阶函数近似为阶次比该高阶函数低的二次函数。(S4)根据二次函数求出谷峰波长λ bQtt()m。其中，谷峰波长λ bottom的计算、确定方法在分析物62与配位体16的结合前后相同。在SI的步骤中，根据分光器30的检测结果，以一定的波长间隔(例如O. 35nm间隔)计算波长的反射率，如图5 (a)所不,求出测量波长范围(例如400 800nm)中的波长与反射率的关系(反射光谱72)。在该阶段中，反射光谱72的波形呈反复微小的凹凸那样的不规则的形状，成为计算、确定谷峰波长很困难的状态。之后，用20阶左右的高阶函数近似反射光谱72，如图5 (b)所示那样，使反射光谱72的波形平滑。该近似可以用公知的任意的方法实现，例如能够用线性函数与伪voigt函数之和来实现。在S2的步骤中，如图5 (b)所示，在近似后的反射光谱72 (高阶函数)中，将反射率取最小值的波长作为“基准波长λ ^”，并任意地选择、决定波长区间74。S卩，在SI的步骤中，在高阶函数中也计算与测量波长对应的反射率，因此从这些反射率之中，确定取最小值的波长，并将其作为基准波长Xci (参照图5 (C))。之后，以基准波长λ ^为中心，在其前后选择数点的波长，将其选择出的区间作为波长区间74。波长区间74的选择是任意的，至少选择包含基准波长λ。的3点即可。在S3的步骤中，在波长区间74中，用二次函数来对近似后的反射光谱72(高阶函数)进行近似。该近似可以用公知的任意的方法实现，例如能够用最小二乘法实现。该情况下，将波长设为X，将反射率设为y，用式(I)表示波长区间74中的波长的反射率。y = ax2 + bx + c …(I)式(I)中，a、b、c是任意的常数。在S4的步骤中，根据式(I)的二次函数，求出谷峰波长Ab()tt(M。式(I)的二次函数 是描绘向下凸的抛物线的二次函数，只要在某波长处的斜率为O (零)，该波长就是可取最小的反射率的波长，相当于谷峰波长入一因此，在S4的步骤中，用波长(X)对式(I)的二次函数进行微分，导出使其微分后的值为O的方程式，求出其解。使微分后的值为O的方程式用式(2)表示，其解用式(3)表示。2ax + b = O... (2)X = — b/2a ... (3)根据这样的处理，能够将谷峰波长λ bottom计算、确定为“一 b/2a”。根据以上的第I实施方式，在SI的步骤中，根据分光器30的检测结果，用高阶函数对反射光谱72进行近似后，在S2、S3的步骤中，决定波长区间74，用二次函数再次对反射光谱72进行近似，然后，在S4的步骤中，对该二次函数进行微分，求出微分值为O的解，通过执行以上这样简单的处理，可以计算、确定谷峰波长，并能够容易地且在短时间内计算、确定谷峰波长Xbottom。(第2实施方式)以下，参照附图，对本发明的优选的第2实施方式进行说明。第2实施方式中的检测装置的构成与第I实施方式的检测装置I相同。第2实施方式与第I实施方式不同的是谷峰波长λ bottom的计算、确定方法。以下，对第2实施方式中的谷峰波长Xbottom的计算、确定方法进行说明。谷峰波长Xb()tt(M的计算、确定方法主要由图7的(Sll) (S16)的步骤构成，(Sll) (S16)的步骤的处理在控制装置50中执行。(Sll)求出反射光谱，对其进行滤波。(S12)从滤波后的反射光谱中选择任意的波长区间。(S13)在选择出的波长区间中，将滤波后的反射光谱近似为高阶函数。(S14)从高阶函数中选择任意的波长区间。(S15)在选择出的波长区间中，将高阶函数近似为阶次比该高阶函数低的二次函数。(S16)根据二次函数求出谷峰波长λ b(rtt()m。其中，谷峰波长λ bottom的计算、确定方法在分析物62与配位体16的结合前后是同样的。在Sll的步骤中，根据分光器30的检测结果，以一定的波长间隔(例如O. 35nm间隔)计算波长的反射率，如图8 (a)所不,求出测量波长范围(例如400 800nm)中的波长与反射率的关系(反射光谱72)。该阶段中，反射光谱72的波形呈反复微小的凹凸那样的不规则的形状，成为计算、确定谷峰波长很困难的状态。之后，对反射光谱72进行滤波(平滑化处理)，如图8 (b)所示，使反射光谱72的波形平滑化。在该滤波中，以一定的波长间隔对各波长中的反射率进行平均化。在S12的步骤中，如图8 (b)所示，在滤波后的反射光谱72中，将反射率取最小值的波长作为“基准波长λ ^”，并任意地选择、决定波长区间76。S卩，在Sll的步骤中，计算以一定的波长间隔平均化后的反射率，从这些反射率之中，确定取最小值的波长，将其作为基准波长\0。之后，以基准波长λ ^为中心，在其前后选择波长，将其选择出的区间作为波长区间76。当基准波长λ ^的短波长侧、长波长侧存在拐点78时，将拐点78作为波长区间76的边界。也可以将从拐点78起靠近基准波长λ 0侧数点(2 3点)的量的波长的地点作为波长区间76的边界。
在S13的步骤中，在波长区间76中，用20阶左右的高阶函数对滤波后的反射光谱72进行近似，如图8 (c)所示，使反射光谱72的波形更平滑。该近似可以用公知的任意的方法来实现，例如能够用线性的函数与伪voigt函数之和来实现。在S14的步骤中，如图8 (C)、图8 (d)所示，在近似后的反射光谱72 (高阶函数)中，将反射率取最小值的波长作为“基准波长λ广，来任意地选择、决定波长区间74。S卩，在S13的步骤中，由于在高阶函数中也计算与测量波长对应的反射率，因此从这些反射率之中，确定取最小值的波长来将其作为基准波长X1 (参照图8 (d))。之后，以基准波长X1为中心，在其前后选择数点的波长，将其选择出的区间作为波长区间74。波长区间74的选择是任意的，至少选择包含基准波长λ I的3点即可。在S15的步骤中，在波长区间74中，用二次函数对近似后的反射光谱72 (高阶函数)进行近似。该近似可以用公知的任意方法来实现，例如能够用最小二乘法实现。该情况下，将波长设为X，将反射率设为y，用前述的式(I)表示波长区间74中的波长的反射率。在S16的步骤中，根据式(I)的二次函数，求出谷峰波长Ab(rttM。式(I)的二次函数是描绘向下凸的抛物线的二次函数，只要某波长处的斜率为O (零)，该波长就是可取最小的反射率的波长，相当于谷峰波长Xbottom0因此，在S16的步骤中，用波长(X)对式(I)的二次函数进行微分，导出使其微分后的值为O的方程式，求出其解。使微分后的值为O的方程式用前述的式(2)表示，其解用前述的式(3)表示。根据这样的处理，能够将谷峰波长λ bottom计算、确定为“一 b/2a”。根据以上的第2实施方式，在Sll的步骤中，根据分光器30的检测结果，求出反射光谱72，并进行滤波后，在S12的步骤中，选择、决定以拐点78作为边界的波长区间76，因此当反射光谱72中存在多个极小点时，也能够在回避了该极小点的范围(除去的范围)内求出谷峰波长Xbtrtttjm，能够正确地计算、确定谷峰波长λ bottom。进而，根据第2实施方式，在S13的步骤中，用高阶函数近似了滤波后的反射光谱72后，在S14、S15的步骤中，决定波长区间74，用二次函数再次近似反射光谱72，之后，在S16的步骤中，对该二次函数进行微分，求出微分值为O的解，通过执行以上这样简单的处理，能够计算、确定谷峰波长λ ，能够容易地且在短时间内计算、确定谷峰波长Xb()tt()m。
附图标记的说明I检测装置；10检测器；12传感器芯片；12a硅基板；12bSiN膜；14流路池；14a槽；14b密闭流路；14c流入口 ；14d流出口 ； 16配位体；20白色光源；30分光器；40光纤；50控制装置；60样本溶液；62分析物；70光学的厚度；72反射光谱；74波长区间；100检测器；102基板；104光学薄膜；106、108实线；110反射光谱；112光学的厚度；120配位体； 122反射光谱；130分析物；132反射光谱；140、142时刻；150生物素；152抗生物素蛋白；154 BSA ; 156抗体；158抗原;160、162、164、166区间；170反射光谱；172极小点；174反射光谱。
权利要求
1.一种分子间相互作用的检测方法，其特征在于，包括 以一定的波长间隔计算反射率来求出反射光谱的步骤； 将所述反射光谱近似为高阶函数的步骤； 从所述高阶函数中选择包含最小的反射率的波长区间的步骤； 在所述波长区间中，将所述高阶函数近似为阶次比该高阶函数低的二次函数的步骤；以及 用波长对所述二次函数进行微分，求出微分值为O的解的步骤。
2.一种分子间相互作用的检测方法，其特征在于，包括 以一定的波长间隔计算反射率来求出反射光谱的步骤； 对所述反射光谱进行滤波的步骤； 从滤波后的所述反射光谱中选择包含最小的反射率且以拐点为边界的第I波长区间的步骤； 在所述第I波长区间中，将滤波后的所述反射光谱近似为高阶函数的步骤； 从所述高阶函数中选择包含最小的反射率的第2波长区间的步骤； 在所述第2波长区间中，将所述高阶函数近似为阶次比该高阶函数低的二次函数的步骤；以及 用波长对所述二次函数进行微分，求出微分值为O的解的步骤。
3.一种分子间相互作用的检测装置，其特征在于，具备 检测器，其具有配位体； 白色光源，其向所述检测器照射白色光； 分光器，其检测来自所述检测器的反射光；以及 控制装置，其控制所述白色光源与所述分光器，所述控制装置以一定的波长间隔计算反射率来求出反射光谱，将所述反射光谱近似为高阶函数，从所述高阶函数中选择包含最小反射率的波长区间，在所述波长区间中将所述高阶函数近似为阶次比该高阶函数低的二次函数，用波长对所述二次函数进行微分，求出微分值为O的解。
4.一种分子间相互作用的检测装置，其特征在于，具备 检测器，其具有配位体； 白色光源，其向所述检测器照射白色光； 分光器，其检测来自所述检测器的反射光；以及 控制装置，其控制所述白色光源与所述分光器，所述控制装置以一定的波长间隔计算反射率来求出反射光谱，对所述反射光谱进行滤波，从滤波后的所述反射光谱中选择包含最小的反射率且以拐点为边界的第I波长区间，在所述第I波长区间中，将滤波后的所述反射光谱近似为高阶函数，从所述高阶函数中选择包含最小反射率的第2波长区间，在所述第2波长区间中，将所述高阶函数近似为阶次比该高阶函数低的二次函数，用波长对所述二次函数进行微分，求出微分值为O的解。
全文摘要
容易地且在短时间内计算、确定谷峰波长。分子间相互作用的检测装置(1)具备具有配位体的检测器(10)；向检测器(10)照射白色光的白色光源(20)；检测来自检测器(10)的反射光的分光器(30)；以及控制装置(50)，其控制白色光源(20)与分光器(30)，该控制装置(50)以一定的波长间隔计算反射率来求出反射光谱，将所述反射光谱近似为高阶函数，从所述高阶函数中选择包含最小的反射率的波长区间，在所述波长区间中将所述高阶函数近似为阶次比该高阶函数低的二次函数，用波长对所述二次函数进行微分，求出微分值为0的解。
文档编号G01N21/27GK102792149SQ20118001293
公开日2012年11月21日 申请日期2011年2月10日 优先权日2010年3月12日
发明者新勇一, 柏崎治, 泉谷直干 申请人:柯尼卡美能达先进多层薄膜株式会社