一种抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的制备方法，以鲤科疱疹病毒3型作为抗原，免疫蛋鸡，测定卵黄抗体效价后，收集免疫卵，分离卵黄，纯化后获得抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体。还公开了由上述方法制成的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体及该卵黄抗体在制备检测、预防或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的药物中的应用及在制备预防和/或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的饲料添加剂中的应用；本发明方法采用差速离心方法纯化的鲤科疱疹病毒3型具有较高的回收率和较好的囊膜完整性，适于大规模纯化病毒；本发明制备的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体纯度高，易于产业化，可显著降低鲤科疱疹病毒3型感染造成的锦鲤死亡率。
【专利说明】一种抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于抗鲤科疱疫病毒抗体【技术领域】,具体涉及一种抗鲤科疱疫病毒3型鸡卵黄抗体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]鲤科疱疹病毒3型，又称为锦鲤疱疹病毒，特异性感染锦鲤、鲤，进而引发锦鲤疱疹病毒病，该病属二类动物疫病，可以造成宿主80%~100%的死亡率，严重威胁锦鲤、鲤养殖业安全。该病自上世纪90年代末爆发至今，已经在世界范围内流行，造成巨大经济损失，2002年我国大陆地区也报道了鲤科疱疹病毒3型引发的疫情。我国的鲤产量居世界第一，锦鲤作为观赏动物也被广泛养殖，因此对鲤科疱疹病毒3型的防治需求尤为迫切。目前文献报道了鲤科疱疹病毒3型弱毒活疫苗和细胞灭活疫苗的防治应用，但是上述弱毒疫苗存在毒力残留等安全问题；此外由于该病毒滴度较低(一般在104TCID5Q/mL)，导致上述细胞灭活苗成本过高；并且上述疫苗免疫后特异性抗体生成也需要3到4周时间，而鲤科疱疹病毒3型感染锦鲤后I到2周内宿主死亡率就超过80%，因此需要一种安全、廉价、快速起效的防治药物以控制鲤科疱疹病毒3型的传播。
[0003]鸡卵黄抗体是由特定抗原免疫蛋鸡，蛋鸡产生的特异性抗体传递于鸡卵黄中形成。鸡卵黄抗体无毒 副作用，安全性高，热、酸、碱稳定性高，生产成本低，适于大规模制备，已经成功应用于多种水产动物的疾病防治。制备抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体，作为饲料添加剂等，通过投喂被动免疫锦鲤，将是一种控制鲤科疱疹病毒3型蔓延的有效手段。
【发明内容】
[0004]本发明的第一个目的是提供一种抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的制备方法。
[0005]本发明的第二个目的是提供一种由上述制备方法制备获得的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体。
[0006]本发明的第三个目的是提供上述抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体在制备检测、预防或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的制剂或药物中的应用。
[0007]本发明的第四个目的是提供上述抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体在制备预防和/或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的饲料添加剂中的应用。
[0008]本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的:一种抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的制备方法，含以下步骤:
[0009](I)鲤科疱疹病毒3型的纯化:取CCB细胞株增殖的鲤科疱疹病毒3型培养物，冻融后进行差速离心纯化病毒:首先采用低速离心，去除细胞碎片，收集上清，再将上清进行超速离心，沉淀后获得差速离心纯化的鲤科疱疹病毒3型病毒，纯化的病毒采用BCA蛋白定量方法检测蛋白浓度后作为抗原；
[0010](2)用纯化的鲤科疱疹病毒3型作为抗原免疫蛋鸡，首次免疫100 μ g(纯化的鲤科疱疹病毒3型)/只，两周后200 μ g (纯化的鲤科疱疹病毒3型)/只第二次免疫，再过两周后300 μ g(纯化的鲤科疱疹病毒3型)/只进行第三次免疫，测定卵黄抗体效价，抗体效价达到1:25600以上时收集免疫卵；
[0011](3)分离免疫卵的卵黄制备卵黄液，采用硫酸钠盐析纯化卵黄液后，获得抗鲤科疱疫病毒3型鸡卵黄抗体。
[0012]本发明步骤⑴中的CCB细胞株增殖的鲤科疱疹病毒3型培养物来源优选为:鲤科疱疹病毒3型毒株购自美国菌种保藏中心，毒株编号:VR-1592?，接种鲤脑细胞系(CCB)，待细胞病变达到90%时，收集培养物，即为CCB细胞株增殖的鲤科疱疹病毒3型培养物。
[0013]本发明步骤(1)中低速离心时的参数为1000g4°C离心20min，超速离心时采用的参数为45000g4°C离心60min。
[0014]本发明步骤(2)中采用间接酶联免疫吸附试验测定卵黄抗体效价。
[0015]本发明步骤(3)中还需对获得的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体进行抗体效价、纯度和总卵黄抗体浓度测定，以使抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体适合应用于检测、预防或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的制剂或药物，以及适合应用于预防和/或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的饲料添加剂等。
[0016]本发明优选采用间接酶联免疫吸附试验抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体效价，其中抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体效价超过1:25600较好，本发明优选采用SDS-PAGE测定抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的纯度，抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的纯度在90%以上较好，采用夹心酶联免疫吸附试验测定抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的浓度，以进一步确定抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体在制剂、药物或者饲料添加剂中的用量等。 [0017]本发明提供的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的制备方法，该方法以鲤科疱疹病毒3型作为抗原，免疫蛋鸡，采用间接酶联免疫吸附试验测定卵黄抗体效价后，收集免疫卵，分离卵黄，水稀释后采用硫酸钠盐析沉淀卵黄抗体，经过抗体效价测定和总卵黄抗体浓度测定后制备即获得抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体。
[0018]作为本发明的一种优选的【具体实施方式】，本发明提供的一种抗鲤科疱疫病毒3型鸡卵黄抗体的制备方法，含以下步骤:
[0019](I)鲤科疱疹病毒3型的纯化；
[0020](2)以纯化的鲤科疱疹病毒3型作为抗原免疫蛋鸡；
[0021](3)采用间接酶联免疫吸附试验测定卵黄抗体效价，抗体效价大于等于1:25600时收集免疫卵；
[0022](4)采用硫酸钠盐析纯化卵黄液；
[0023](5)采用SDS-PAGE测定纯化卵黄抗体的纯度；
[0024](6)采用酶联免疫吸附试验测定纯化的卵黄抗体效价；
[0025](7)采用酶联免疫吸附试验测定纯化的卵黄抗体总浓度。
[0026]在该制备方法中:
[0027]步骤(1)中鲤科疱疹病毒3型纯化步骤具体为:鲤科疱疹病毒3型(购自美国菌种保藏中心，毒株编号:VR-1592?)接种鲤脑细胞系(CCB)，待细胞病变达到90%时，收集培养物，将上述细胞培养物反复冻融3次，1000g4°C离心20min，去除细胞碎片，收集上清，采用45000g4°C超速离心60min，沉淀病毒，负染后通过透射电镜观察纯化病毒的囊膜完整性，纯化的病毒采用检测蛋白浓度后，作为抗原。[0028]步骤(2)中以纯化的鲤科疱疹病毒3型作为抗原免疫蛋鸡的具体步骤为:用纯化的鲤科疱疫病毒3型作为抗原免疫蛋鸡,首次免疫100 μ g/只,两周后200 μ g/只第二次免疫，再过两周，300 μ g/只进行第三次免疫，采用间接酶联免疫吸附试验测定卵黄抗体效价，抗体效价达到1:25600时收集免疫卵。
[0029]步骤(3)中采用间接酶联免疫吸附试验测定卵黄抗体效价具体步骤为:采用纯化的鲤科疱疹病毒3型包被酶标板，包被缓冲液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.05M,PH9.6)，包被浓度采用方阵滴定确定为0.4 μ g/mL，4°C包被过夜；洗板后加入2倍梯度稀释(1:3200~1:51200)的免疫蛋鸡的卵黄液，同时设立阴性对照(未免疫蛋鸡卵黄液)和空白对照(PBS)，37°C孵育I小时；洗板后加入HRP标记的兔抗鸡IgG，抗体稀释比例由方阵滴定试验确定为1:10000，37°C孵育I小时；洗板后加入TMB显色液，37°C反应15min，加入2MH2SO4终止反应，读取OD45tl值；P/N值大于2.1定义为阳性。
[0030]步骤⑷中采用硫酸钠盐析纯化卵黄抗体:免疫卵用自来水清洗后采用0.5%新洁尔灭浸泡消毒20min，晾干后分离免疫卵的卵黄，加入0.01% (g/mL)叠氮钠，制备卵黄液，将卵黄液与双蒸水1:6稀释后用稀盐酸调整pH到5.0，4°C静置过夜，10000g4°C离心25min取上清液，加入19%硫酸钠(质量/体积，g/mL)，混匀后25°C静置2小时，10000g4°C离心25min，弃上清，将沉淀溶解于与卵黄液等体积的双蒸水中，加入14%硫酸钠(质量/体积，g/mL)，混匀后25°C静置2小时，10000g4°C离心25min，弃上清，将沉淀溶解于与卵黄液等体积的双蒸水中，即为纯化的卵黄抗体。
[0031]步骤(5)中采用SDS-PAGE测定纯化卵黄抗体的纯度的步骤具体为:制备15%的分离胶和5%的浓缩胶，将纯化的卵黄抗体与4倍的上样缓冲液(Tris-HCl (pH6.8)，200mM ；SDS,8% ;溴酚蓝，0.4% ;甘油，40% ;巯基乙醇，4% )按照体积比3:1混匀后煮沸1min后上样，90V电泳1.5小时，考马斯亮蓝染色30min，脱色后拍照，采用Bandscan5.0软件分析卵黄抗体纯度。
[0032]步骤(6)中酶联免疫吸附试验测定纯化的卵黄抗体效价的步骤具体为:采用纯化的鲤科疱疫病毒3型包被酶标板,包被浓度为0.4 μ g/mL, 4°C包被过夜；洗板后加入2倍梯度稀释(1:3200~1:51200)的纯化卵黄抗体，同时设立阴性对照(纯化的未免疫鸡的卵黄抗体)和空白对照(PBS)，37°C孵育I小时；洗板后加入1:10000稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG，37°C孵育I小时；洗板后加入TMB显色液，37°C反应15min，加入2M H2SO4终止反应，读取OD45tl值；P/N值大于2.1定义为阳性。
[0033]步骤(7)中酶联免疫吸附试验测定纯化的卵黄抗体总浓度的步骤具体为:采用兔抗鸡IgG包被酶标板，包被浓度为3.75μ g/mL，4°C包被过夜；洗板后加入1:80000稀释的纯化卵黄抗体，同时加入0.5~0.031 μ g/mL滴度稀释的标准卵黄抗体，制备标准曲线；37°C孵育I小时；洗板后加入1:10000稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG，37°C孵育I小时；洗板后加入TMB显色液，37 V反应15min，加入2M H2SO4终止反应，读取OD45tl值；根据标准曲线计算纯化的卵黄抗体浓度。
[0034]本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的:由上述抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的制备方法制 备的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体。
[0035]本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的:上述抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体在制备检测、预防或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的制剂或药物中的应用。
[0036]本发明的第四个目的是通过如下技术方案来实现的:上述抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体在制备预防和/或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的饲料添加剂中的应用。
[0037]抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体在制备预防和/或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的饲料添加剂中的应用时，抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的添加量优选占饲料总质量的0.5%以上，最好是0.5%。
[0038]抗鲤科疱疫病毒3型鸡卵黄抗体作为饲料添加剂的一种优选的【具体实施方式】为:将制备的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体按照0.5% (占饲料总质量的0.5% )的剂量喷洒到饲料上，混匀后25°C放置48小时晾干。采用含有抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的饲料，按照2% (饲料质量占锦鲤总体重的2%)体重比连续投喂锦鲤10天后，可以有效降低鲤科疱疹病毒3型攻毒后的锦鲤死亡率。
[0039]本发明的有益效果是:
[0040](1)本发明方法采用差速离心方法纯化的鲤科疱疹病毒3型具有较高的回收率和较好的囊膜完整性，适于大规模纯化病毒；
[0041](2)本发明中的卵黄抗体的纯化过程简单，并且可以很好地保留卵黄抗体的生物学活性；
[0042](3)本发明中抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的制备为在生产过程中控制鲤科疱疹病毒3型的传播提供了物质基础；
[0043](4)本发明制备的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体纯度高，易于产业化，而且可以显著降低鲤科疱疹病毒3型感染造成的锦鲤死亡率。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1是实施例1中纯化的鲤科疱疹病毒3型的电镜照片，图中箭头所指为病毒囊膜；
[0045]图2是纯化的鲤科疱疹病毒3型抗卵黄抗体的SDS-PAGE电泳图。M:蛋白质分子量标准；1:硫酸钠盐析沉淀纯化的卵黄抗体；2:标准卵黄抗体(Sigma)。
【具体实施方式】
[0046]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。
[0047]实施例1鲤科疱疹病毒3型的纯化
[0048]鲤科疱疹病毒3型(购自美国菌种保藏中心，毒株编号:VR-1592?)接种鲤脑细胞系(CCB)，待细胞病变达到90%时，收集培养物，即为CCB细胞株增殖的鲤科疱疹病毒3型培养物，将600mL培养物反复冻融3次后进行差速离心:低速离心时参数为lOOOg，4°C低速离心20min，去除细胞碎片，收集上清，超速离心时参数为45000g，4°C超速离心60min，沉淀病毒，负染后通过透射电镜观察纯化病毒的囊膜完整性(图1)。纯化的病毒采用BCA蛋白定量方法检测蛋白浓度后作为抗原，结果表明，在600mL细胞培养物中可以纯化到12mg以上的鲤科疱疹病毒3型。
[0049]实施例2以纯化的鲤科疱疹病毒3型作为抗原免疫蛋鸡[0050]用纯化的鲤科疱疹病毒3型作为抗原免疫来亨鸡开产蛋鸡，首次免疫100 μ g/只，两周后200 μ g/只第二次免疫，再过两周，300 μ g/只进行第三次免疫。免疫注射部位为胸肌和颈部皮下多点注射，首次免疫采用弗氏完全佐剂，第二和第三次免疫采用弗式不完全佐剂，每次免疫后10日，收集免疫卵，采用间接酶联免疫吸附试验测定卵黄抗体效价。
[0051]实施例3间接酶联免疫吸附试验测定卵黄抗体效价
[0052]采用纯化的鲤科疱疹病毒3型包被酶标板，包被缓冲液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.05M, pH9.6)，包被浓度采用方阵滴定确定为0.4μ g/mL，4°C包被过夜；洗板后加入2倍梯度稀释(1:3200~1:51200)的免疫蛋鸡的卵黄液，同时设立阴性对照(纯化的未免疫鸡的卵黄抗体)和空白对照(PBS)，37°C孵育I小时；洗板后加入HRP标记的兔抗鸡IgG，抗体稀释比例由方阵滴定试验确定为1:10000，37°C孵育I小时；洗板后加入TMB显色液，37 V反应15min，加入2M H2SOj*止反应，读取OD45tl值；P/N值大于2.1定义为阳性，抗体效价达到1:25600时收集免疫卵，制备卵黄抗体。
[0053]实施例4硫酸钠盐析纯化卵黄抗体
[0054]免疫卵用自来水清洗后采用0.5%新洁尔灭浸泡消毒20min,晾干后分离免疫卵的卵黄，加入0.01% (g/mL)叠氮钠，制备卵黄液，将10mL卵黄液与双蒸水1:6稀释后用稀盐酸调整pH到5.0，4°C静置过夜，10000g4°C离心25min取上清液，加入19%硫酸钠(g/mL)，混匀后25°C静置2 小时，10000g4°C离心25min，弃上清，将沉淀溶解于与卵黄液等体积的双蒸水中，加入14%硫酸钠(g/mL，10mL水中加入14g硫酸钠)，混匀后25°C静置2小时，10000g4°C离心25min，弃上清，将沉淀溶解于10mL双蒸水中，即为纯化的卵黄抗体。
[0055]实施例5采用SDS-PAGE测定纯化卵黄抗体的纯度
[0056]制备15%的分离胶和5%的浓缩胶，将纯化的卵黄抗体与4倍的上样缓冲液(Tris-HCl (pH6.8), 200mM ；SDS, 8% ;溴酚蓝，0.4% ;甘油，40% ;巯基乙醇，4% )按照体积比3:1混匀后煮沸1min后上样，90V电泳1.5小时，考马斯亮蓝染色30min后，脱色后拍照，采用Bandscan5.0软件分析卵黄抗体纯度，结果表明，纯化得到的卵黄抗体纯度在90%以上(图2)。
[0057]实施例6纯化的卵黄抗体效价测定
[0058]采用纯化的鲤科疱疹病毒3型包被酶标板，包被缓冲液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.05M, pH9.6)，包被浓度为Odyg/mUfC包被过夜；洗板后加入2倍梯度稀释(1:3200~1:51200)的纯化卵黄抗体，同时设立阴性对照(纯化的未免疫鸡的卵黄抗体)和空白对照(PBS)，37°C孵育I小时；洗板后加入1:10000稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG，37°C孵育I小时；洗板后加入TMB显色液，37°C反应15min，终止反应，读取OD45tl值；P/N值大于2.1定义为阳性。结果表明纯化的卵黄抗体效价超过1:25600。
[0059]实施例7纯化的卵黄抗体总浓度测定
[0060]采用兔抗鸡IgG包被酶标板，包被浓度为3.75 μ g/mL,包被缓冲液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.05M，pH9.6)，4°C包被过夜；洗板后加入1:80000稀释的纯化卵黄抗体，同时加入2倍梯度度稀释(0.5~0.031 μ g/mL)的标准卵黄抗体，制备标准曲线；37°C孵育I小时；洗板后加入1:10000稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG，37°C孵育I小时；洗板后加入TMB显色液，37°C反应15min，终止反应，读取OD450值；根据标准曲线计算纯化的卵黄抗体浓度。结果表明纯化的卵黄抗体中总卵黄抗体浓度为1.89mg/mL，可作为下一步抗体添加剂量的依据。
[0061]实施例8卵黄抗体IgY的体外中和试验
[0062]I)卵黄抗体的准备
[0063]取实施例4中制备的卵黄抗体，56 °C灭活I小时后用MEM培养基2倍梯度稀释(1:2-1:256)。
[0064]2)中和试验
[0065]采用实施例1中的方法增殖的鲤科疱疹病毒3型，并调整到200TCID50/mL，取100 μ L与上述稀释的卵黄抗体等体积混匀，25°C孵育I小时，加入长满CCB细胞的96孔培养板，每个卵黄抗体浓度接种8孔，25°C培养一周后观察细胞病变情况。
[0066]3) 50 %中和指数(ND5tl)计算
[0067]按照Reed and Munch 公式计算 ND50:
[0068]lgND50 = Ig (高于50%保护率的抗体稀释度)+距离比例X稀释度对数的差
[0069]距离比例=(高 于50%的保护率-50% )/(高于50%的保护率-低于50%的保护率)
[0070]4)结果
[0071]卵黄抗体的ND5tl值为1/45.29。
[0072]因此，本发明中的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体可以作为检测或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的制剂或药物引用。
[0073]实施例9抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体作为饲料添加剂的应用
[0074]I)含有卵黄抗体的锦鲤饲料的制备
[0075]将实施例4中制备的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体喷洒到普通锦鲤饲料上，制备两种饲料，其中的卵黄抗体终浓度分别为0.25%,0.5% (质量百分含量)，混匀后25°C放置48小时晾干。按照相同方法同时制备含有0.5%未免疫卵黄抗体的锦鲤饲料。
[0076]2)养殖试验
[0077]选取1g左右的锦鲤60尾，分3组，每组20尾。试验组投喂含有抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的饲料，对照组投喂含有未免疫卵黄抗体的锦鲤饲料。每日投喂量为2%体重比，分别在上午10:00和下午16:00投喂上述两种饲料。
[0078]3)攻毒试验
[0079]连续投喂10日后，采用滴鳃攻鲤科疱疹病毒3型，每尾锦鲤攻毒40TCID5(i。攻毒后水温保持25 °C,观察28日，记录死亡率。
[0080]4)数据统计分析
[0081]采用SPSS软件，对锦鲤死亡率进行Fisher精确检验，显著性水平选择0.05。
[0082]5)结果
[0083]统计分析显示，试验组I (投喂含有0.5%抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的饲料)中的锦鲤死亡率显著低于对照组，试验组2 (饲料中含有0.25%抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体)中的锦鲤死亡率与对照组无显著性差异。
[0084]表1攻毒锦鲤的死亡率统计
[0085]
【权利要求】
1.一种抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的制备方法，其特征是含以下步骤: (1)鲤科疱疹病毒3型的纯化:取CCB细胞株增殖的鲤科疱疹病毒3型培养物，冻融后进行差速离心纯化病毒:首先采用低速离心，去除细胞碎片，收集上清，再将上清进行超速离心，沉淀后获得差速离心纯化的鲤科疱疹病毒3型病毒，纯化的病毒采用BCA蛋白定量方法检测蛋白浓度后作为抗原； (2)用纯化的鲤科疱疹病毒3型作为抗原免疫蛋鸡，首次免疫100μ g/只，两周后200 μ g/只第二次免疫，再过两周后300 μ g/只进行第三次免疫，测定卵黄抗体效价，抗体效价达到1:25600以上时收集免疫卵； (3)分离免疫卵的卵黄制备卵黄液，采用硫酸钠盐析纯化卵黄液后，获得抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的制备方法，其特征是:步骤(I)中低速离心时的参数为lOOOg，4°C离心20min，超速离心时的参数为45000g，4°C超速离心60min。
3.根据权利要求1所述的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的制备方法，其特征是:步骤(2)中采用间接酶联免疫吸附试验测定卵黄抗体效价。
4.根据权利要求1所述的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的制备方法，其特征是:步骤(3)中对获得的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体进行抗体效价、纯度和总卵黄抗体浓度测定。
5.根据权利要求4所述的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的制备方法，其特征是:采用间接酶联免疫吸附试验抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体效价，其中抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体效价超过1:25600，采用SDS-PAGE测定抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的纯度，抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的纯度在90%以上，采用夹心酶联免疫吸附试验测定抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的浓度。
6.采用权利要求1-5任一项所述的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的制备方法制备获得的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体。
7.权利要求6所述的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体在制备检测、预防或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的制剂中的应用。
8.权利要求6所述的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体在制备检测、预防或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的 相关疾病的药物中的应用。
9.权利要求6所述的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体在制备预防和/或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的饲料添加剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体在制备预防和/或治疗鲤科疱疹病毒3型感染引起的相关疾病的饲料添加剂中的应用，其特征是:所述抗鲤科疱疹病毒3型鸡卵黄抗体的添加量占饲料总质量的0.5%以上。
【文档编号】G01N33/569GK104031143SQ201410231937
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2013年7月2日
【发明者】刘振兴, 柯浩, 马艳平, 郝乐, 马江耀, 梁志凌 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所